FK506菌株基因组尺度代谢网络模型指导下初级途径改造方法

摘要

本发明公开了一种FK506菌株基因组尺度代谢网络模型指导下初级途径改造方法，根据筑波链霉菌基因组序列，在添加FK506生物合成的特征反应和菌体合成反应并对网络反应进行手动精炼，获得了FK506菌株筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型；通过对该代谢网络模型进行分析，利用通量平衡分析和最小代谢调节分析方法，确定对FK506生物合成的初级途径前体关键基因。本发明改造后菌株的生产水平提高了80%-100%。为FK506菌株的初级途径前体构建、研究和分析提供了高效的指导，在FK506菌株改造的研究过程中具有很大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌株代谢工程分子改造技术领域，特别涉及基于微生物菌株基因组尺 度代谢网络模型的初级代谢途径改造方法。

背景技术

作为一种具有高度免疫抑制作用的23元聚酮大环内酯类化合物，FK506（又名他克莫司） 比结构不相似类免疫抑制剂环孢菌素强100倍，因而广泛应用于异体肾脏、肝脏、骨髓移植 后的抗排异治疗，还用于处理炎症皮肤疾病和湿疹。随着近年来器官移植呈指数型增长， FK506已经成为一种极为重要的一线临床药物。

曾经许多科研人员做了大量的工作致力于FK506的高效生产过程，这些工作还基于随机 突变和筛选方法。由于胞内前体水平不足的主要瓶颈，发酵过程相对较低的产量严重限制了 FK506的进一步应用。通过对原始菌株的基因改造，可以构建出保证菌体生长和产物生成的 前体平衡菌株。这些基因改造研究可以显著提高前体的合成，然而该方法对于目标基因的识 别总是盲目和不确定的，而且由于代谢途径是高度交互作用的，拓扑结构十分复杂，单纯操 作一个基因可能会对其他途径甚至整个细胞产生未知的结果。重要的是，由于工程改造通常 是局部的，对菌株优化的剧烈结果存在局限。由于细胞是具有高度交联代谢网络的精密复杂 系统，从系统水平把握细胞的全局行为并准确识别目标靶点是一个巨大的挑战。

系统生物学通过提供系统策略改变微生物胞内通量在代谢工程领域发挥了重要作用。随 着越来越多的物种基因组序列公布出来，基因组尺度代谢网络模型已经成为获取微生物生理 特性的重要平台^[1]。基因组尺度代谢网络模型可以用来反映遗传扰动的响应，协助揭示不利 表型的潜在原因。在此基础上，系统研究菌株的生物合成行为，结合模拟分析手段，能够快 速，精确地识别提高菌种生物合成能力的靶点基因^[2]。该方法省时省力，减少了研究成本。 目前基因组尺度代谢网络模型已经成功用于重要工业产品如生物燃料、维生素、氨基酸和次 级代谢物的代谢工程靶点识别。

初级代谢途径前体对微生物次级代谢物的合成具有重要影响。初级代谢途径是前体的主 要供给方式，前体可以通过利用不同碳底物如脂肪酸、单糖或者蛋白质来合成。初级代谢途 径生成的ATP可直接用来作为体内反应所需要的能量；NADH可以进入呼吸链产生ATP；戊 糖磷酸途径产生的NADPH通常作为氧化还原反应的还原力；产生的一些小分子物质如丙酮 酸，乙酰辅酶A等可以作为抗生素合成的前体物质。通过对初级途径关键基因和关键酶的识 别可以调节中心碳代谢网络的碳流分布，提高特殊前体物的胞内水平。在葡萄糖初级代谢途 径中磷酸戊糖途径和糖酵解途径由关键代谢节点6-磷酸葡萄糖连接，有磷酸葡萄糖异构酶、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶和磷酸葡萄糖变位酶参与。闻建平等人^[3]通过扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶 强化了磷酸戊糖途径，构建的玫瑰孢链霉菌基因工程菌比出发菌种的产量提高了18％，达托 霉素的产量高达700mg/L。Li和Townsend^[4]通过敲除糖酵解途径的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 gap1和gap2，将3-磷酸甘油醛向1,3-二磷酸甘油酸的碳流中断，使更多的前体用于合成棒酸， 最终在添加精氨酸条件下将棒酸产量提高了3.1倍。工程改造初级途径的辅酶A类前体可以 促进一些聚酮化合物如红霉素、寡霉素、莫能霉素B和放线菌紫素的生产。通过对甲基丙二 酰辅酶A代谢节点进行改造，红色糖多孢菌显著提高了合成红霉素的发酵水平^[5]。Ryu等人^[6]对天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶编码基因accA2、accB和accE进行过表达后，将乙酰 辅酶A到丙二酰辅酶A通量增强，丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A都是作为放线菌紫素的合成 结构前体，因此将放线菌紫素提高了6倍。初级途径的胞内还原力辅因子对次级代谢物的合 成也起到关键作用，为了提高胞内NADPH还原力水平，Asadollahi等人^[7]失活NADPH依赖 的谷氨酸脱氢酶后，降低了该途径合成谷氨酸时过多的NADPH消耗，引起菌株的倍半萜烯 产量提高了85%。

而截至目前，未见有利用FK506菌株基因组尺度代谢网络模型预测初级途径关键基因关 键酶，进而指导工程菌株初级途径分子改造的相关专利与文献报道。本文的专利发明点是根 据FK506菌株基因组尺度代谢网络模型预测的初级途径关键基因作为改造靶点，从链霉菌的 初级代谢途径包括谷氨酸合成代谢途径、磷酸烯醇式丙酮酸补给途径、莽草酸途径、还原力 平衡途径、脂肪酸合成代谢途径、磷酸戊糖途径进行分子改造，以此提高FK506的生产水平。 因此，通过构建FK506菌株高精度基因组尺度代谢网络，确定初级途径敲除关键基因gdhA、 ppc以及扩增关键基因dahp、pntAB、accA2、zwf2，进而通过对菌株的分子改造减少还原力 NADPH、磷酸烯醇式丙酮酸前体的消耗，强化环己烷二羧酸、还原力NADPH、丙酰辅酶A、 4-磷酸赤藓糖前体合成。

[1]Kim,T.Y.,S.B.Sohn,Y.B.Kim,et al.,Recent advances in reconstruction and applications of  genome-scale metabolic models,Current Opinion in Biotechnology,2012,23(4):617-623.

[2]闻建平，黄笛，李珊珊，贾晓强，异丁醇合成菌基因组尺度代谢网络模型及分子改造方法， 201210194678.9

[3]闻建平，宇光海，贾晓强，过表达zwf2基因提高达托霉素产量的方法及其应用，201110190206.1

[4]Li,R.and C.A.Townsend,Rational strain improvement for enhanced clavulanic acid production by  genetic engineering of the glycolytic pathway in Streptomyces clavuligerus,Metabolic Engineering,2006, 8(3):240-252.

[5]Reeves,A.R.,I.A.Brikun,W.H.Cernota,et al.,Engineering of the methylmalonyl-CoA metabolite node  of Saccharopolyspora erythraea for increased erythromycin production,Metabolic Engineering,2007, 9(3):293-303.

[6]Ryu,Y.-G.,M.J.Butler,K.F.Chater,et al.,Engineering of primary carbohydrate metabolism for increased  production of actinorhodin in Streptomyces coelicolor,Applied and Environmental Microbiology,2006, 72(11):7132-7139.

[7]Asadollahi,M.A.,J.Maury,K.R.Patil,et al.,Enhancing sesquiterpene production in Saccharomyces  cerevisiae through in silico driven metabolic engineering,Metabolic Engineering,2009,11(6):328-334.

发明内容

本发明的目的是根据FK506菌株基因组尺度代谢网络模型预测的初级途径的前体合成基 因作为改造靶点，通过抗性盒的同源替换构建敲除菌株，整合质粒的转化构建扩增菌株，以 此改造菌株的初级途径（谷氨酸合成代谢途径、磷酸烯醇式丙酮酸补给途径、莽草酸途径、 还原力平衡途径、脂肪酸合成代谢途径、磷酸戊糖途径）前体合成基因，可以提高FK506产 量降低生产成本。

本发明的技术方案如下：

一种FK506菌株基因组尺度代谢网络模型指导下初级途径改造方法，步骤如下：

1)根据筑波链霉菌基因组序列，在添加FK506生物合成的特征反应和菌体合成反应并对网 络反应进行手动精炼，获得了FK506菌株筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型；

2)通过对该代谢网络模型进行分析，利用通量平衡分析和最小代谢调节分析方法，确定对 FK506生物合成的初级途径前体关键基因。

在FK506菌株代谢网络模型中添加FK506生物合成的特征反应和菌体合成反应，以淀粉 为唯一碳源。

FK506生物合成的初级途径前体关键基因为gdhA、ppc、dahp、pntAB、accA2和zwf2。

FK506生物合成的初级途径前体关键基因进行分子改造，步骤如下：

1）对预测得出的初级途径前体合成基因gdhA和ppc进行基因敲除，对dahp、pntAB、accA2 和zwf2进行基因扩增的分子改造；

2）将前体合成基因敲除和扩增菌株进行摇瓶发酵培养，考察菌株改造前后FK506产量变化。

对预测出的关键基因，采用基因敲除的分子改造方法，构建敲除质粒pΔGDH和pΔPPC， 将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利 用卡那霉素（硫链丝菌素）抗性筛选和PCR验证方法获得基因缺失菌株HT-ΔGDH和 HT-ΔPPC。

对预测出的关键基因，采用基因扩增的分子改造方法，构建扩增质粒pACC、pDAHP、 pPNT和pZWF，将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉 菌D852中，利用安普霉素抗性筛选和PCR验证方法获得基因扩增菌株HT-ACC、HT-DAHP、 HT-PNT和HT-ZWF。

对改造的菌株进行摇瓶发酵培养，在摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；产量比野生 型提高了80%-100%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L， 黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8。

详细说明原理和方法如下：

根据筑波链霉菌基因组序列，在添加FK506生物合成的特征反应和菌体合成反应并对网 络反应进行手动精炼（剔除冗余反应、加入反应辅因子、调节反应可逆方向、配平反应、加 入运输反应、分析填补空缺）后，获得了FK506菌株筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型； 模型主要包括中心碳代谢（糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环），丙酮酸代谢，乙醛酸 循环代谢，氨基酸合成与消耗代谢，核苷酸代谢，脂类代谢，肽聚糖合成，辅酶合成，氮硫 代谢以及卟啉等相关反应，此外还包括FK506及其副产物FK520、FK506D的合成途径反应， 网络总共含865个反应和621个代谢物。

通过对该代谢网络模型进行分析，预测了能够提高FK506产量的靶基因。根据菌株的实 际生理代谢状态，从初级途径筛选到合理的基因改造策略，包括对谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶的单基因敲除，对3-脱氧-D-阿拉伯糖基-heptulosonate-7-磷酸合酶、烟酰胺核 苷转氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶的单基因扩增。

在FK506菌株代谢网络模型中添加FK506生物合成的特征反应和菌体合成反应，以淀粉 为唯一碳源。

利用通量平衡分析和最小代谢调节分析方法，确定对FK506生物合成的初级途径前体关 键基因。

本发明的FK506菌株基因组尺度代谢网络模型进行初级途径的前体基因改造，步骤如下：

1.对预测得出的初级途径前体合成基因gdhA和ppc进行基因敲除，对dahp、pntAB、accA2 和zwf2进行基因扩增的分子改造；

2.将前体合成基因敲除和扩增菌株进行摇瓶发酵培养，考察菌株改造前后FK506产量变化。

对于预测出的关键基因——敲除基因，利用同源左臂的引物对gdhA-LF和gdhA-LR对目 的基因gdhA的左臂进行扩增，获得基因gdhA的左臂片段。利用同源右臂的引物对gdhA-RF 和gdhA-RR对目的基因gdhA的右臂进行扩增，获得基因gdhA的右臂片段。两段同源片段送 去测序验证，将两段同源片段分别用XbaI–BamHI和KpnI–EcoRI双酶切后依次连接于 pUC119-kana。上述构建载体用XbaI–EcoRI双酶切后连接于E.coli-Streptomyces穿梭质粒 pKC1139，获得gdhA的敲除载体pΔGDH。基因ppc的敲除载体构建过程同pΔGDH类似， 同源左右臂的引物对分别为ppc-LF/ppc-LR和ppc-RF/ppc-RR。两段同源片段送去测序验证， 将两段同源片段分别用HindIII–XbaI和KpnI–EcoRI双酶切后依次连接于pKC1139。利用引物 tsr-F和tsr-R将硫链丝菌素tsr基因从质粒pGH112扩增下来，经过XbaI–KpnI双酶切后连接 于上一步骤构建的质粒，获得ppc的敲除载体pΔPPC。将含目标基因质粒转入大肠杆菌 ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利用卡那霉素（硫链丝菌素）抗性筛 选和PCR验证方法获得基因缺失菌株HT-ΔGDH和HT-ΔPPC。

对于预测出的关键基因——扩增基因，以S.roseosporus基因组为模板，分别以accA2-F 和accA2-R，dahp-F和dahp-R为引物（下划线为酶切位点），扩增accA2基因和dahp基因； 以S.coelicolor基因组为模板，以pntAB-F和pntAB-R，accA2-F和accA2-R为引物，扩增pntAB 基因和zwf2基因，PCR产物包括各个基因自身所带的核糖体结合位点。分别将accA2基因， dahp基因，pntAB基因和zwf2基因PCR产物以NdeI-XbaI双酶切后连入同样酶切过的pIB139， 连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞JM109或DH5α，转化后涂布到含有50μg/mL安 普霉素的筛选平板上过夜培养。挑取单菌落活化，提质粒做双酶切或者PCR验证，最终获得 质粒pACC，pDAHP，pPNT，pZWF。将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合 转移方法转入筑波链霉菌D852中，利用安普霉素抗性筛选和PCR验证方法获得基因扩增菌 株HT-ACC、HT-DAHP、HT-PNT和HT-ZWF。

对改造的菌株进行摇瓶发酵培养，在摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；产量比野生 型提高了80%-100%；使用的培养基组成为：淀粉60g/L,酵母提取物2g/L,蛋白胨2.5g/L， 黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L,pH6.8。

改造菌株发酵产量比野生型提高了80%-100%，说明实验效果提高显著；最大FK506产 量达到200-300mg/L。

本发明利用FK506菌株基因组尺度代谢网络模型预测初级途径前体基因以提高菌株生产 水平，实现菌株的途径分子改造方法。根据菌株的实际生理代谢状态，从初级途径筛选到合 理的基因改造策略，包括对谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的单基因敲除，对3-脱 氧-D-阿拉伯糖基-heptulosonate-7-磷酸合酶、烟酰胺核苷转氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、6-磷酸 葡萄糖脱氢酶的单基因扩增。对预测出的六个关键途径中的关键基因进行基因改造；对改造 的菌株进行摇瓶发酵培养，产量比野生型提高了80%-100%，说明实验效果提高显著；最大 FK506产量达到200-300mg/L。本发明采用基因组尺度代谢网络模型预测FK506菌株初级途 径前体合成基因的改造方法，改造后菌株的生产水平提高了80%-100%。该基于初级途径前 体合成途径（谷氨酸合成代谢途径、磷酸烯醇式丙酮酸补给途径、莽草酸途径、还原力平衡 途径、脂肪酸合成代谢途径、磷酸戊糖途径）改造的方法，为FK506菌株的构建、研究和分 析提供了高效的指导，在FK506菌株改造的研究过程中具有很大的应用前景。

附图说明

图1筑波链霉菌FK506合成途径及模型预测的初级途径基因（gdhA、ppc、accA2、dahp、pntAB 和zwf2）。

图2靶基因敲除质粒（pΔGDH和pΔPPC）与扩增质粒（pACC，pDAHP，pPNT，pZWF） 的构建。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

根据筑波链霉菌基因组序列，在添加FK506生物合成的特征反应和菌体合成反应并对网 络反应进行手动精炼（剔除冗余反应、加入反应辅因子、调节反应可逆方向、配平反应、加 入运输反应、分析填补空缺）后，获得了FK506菌株筑波链霉菌基因组尺度代谢网络模型（图 1）。模型主要包括中心碳代谢（糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环），丙酮酸代谢，乙 醛酸循环代谢，氨基酸合成与消耗代谢，核苷酸代谢，脂类代谢，肽聚糖合成，辅酶合成， 氮硫代谢以及卟啉等相关反应，此外还包括FK506及其副产物FK520、FK506D的合成途径 反应，网络总共含865个反应和621个代谢物。基于基因组尺度代谢网络模型，利用通量平 衡分析和最小代谢调节分析预测了能够提高FK506产量的靶基因。根据菌株的实际生理代谢 状态，从初级途径筛选到合理的基因改造策略，包括对谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶的单基因敲除，对3-脱氧-D-阿拉伯糖基-heptulosonate-7-磷酸合酶、烟酰胺核苷转氢酶、 乙酰辅酶A羧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶的单基因扩增（图1）。

实施例2

根据实施例1预测前体谷氨酸合成代谢途径基因gdhA和磷酸烯醇式丙酮酸补给途径基因 ppc，对FK506菌株进行基因敲除。利用同源左臂的引物对gdhA-LF和gdhA-LR（表1）对目 的基因gdhA的左臂进行扩增，获得基因gdhA的左臂片段。利用同源右臂的引物对gdhA-RF 和gdhA-RR（表1）对目的基因gdhA的右臂进行扩增，获得基因gdhA的右臂片段。两段同 源片段送去测序验证，将两段同源片段分别用XbaI–BamHI和KpnI–EcoRI双酶切后依次连接 于pUC119-kana。上述构建载体用XbaI–EcoRI双酶切后连接于E.coli-Streptomyces穿梭质粒 pKC1139，获得gdhA的敲除载体pΔGDH（图2）。基因ppc的敲除载体构建过程同pΔGDH 类似，同源左右臂的引物对分别为ppc-LF/ppc-LR和ppc-RF/ppc-RR（表1）。两段同源片段 送去测序验证，将两段同源片段分别用HindIII–XbaI和KpnI–EcoRI双酶切后依次连接于 pKC1139。利用引物tsr-F和tsr-R（表1）将硫链丝菌素tsr基因从质粒pGH112扩增下来， 经过XbaI–KpnI双酶切后连接于上一步骤构建的质粒，获得ppc的敲除载体pΔPPC（图2）。 将含目标基因质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利 用卡那霉素（硫链丝菌素）抗性筛选和PCR验证方法获得基因缺失菌株HT-ΔGDH和 HT-ΔPPC。

表1本研究中用到的引物

下划线为酶切位点

实施例3

根据实施例1预测前体莽草酸途径基因dahp、还原力平衡途径基因pntAB、脂肪酸合成 代谢途径基因accA2、磷酸戊糖途径基因zwf2，对FK506菌株进行分子改造。以S.roseosporus 基因组为模板，分别以accA2-F和accA2-R，dahp-F和dahp-R为引物（表1），扩增accA2基 因和dahp基因；以S.coelicolor基因组为模板，以pntAB-F和pntAB-R，accA2-F和accA2-R 为引物（表1），扩增pntAB基因和zwf2基因，PCR产物包括各个基因自身所带的核糖体结 合位点。分别将accA2基因，dahp基因，pntAB基因和zwf2基因PCR产物以NdeI-XbaI双酶 切后连入同样酶切过的pIB139，连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞JM109或DH5α， 转化后涂布到含有50μg/mL安普霉素的筛选平板上过夜培养。挑取单菌落活化，提质粒做双 酶切或者PCR验证，最终获得质粒pACC，pDAHP，pPNT，pZWF（图2）。将含目标基因 质粒转入大肠杆菌ET12567，利用接合转移方法转入筑波链霉菌D852中，利用安普霉素抗 性筛选和PCR验证方法获得基因扩增菌株HT-ACC、HT-DAHP、HT-PNT和HT-ZWF。

实施例4

对实施例2改造的前体谷氨酸合成代谢途径基因gdhA敲除菌株HT-ΔGDH进行摇瓶发酵 培养，在摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提 取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L， pH6.8。谷氨酸合成代谢途径基因gdhA敲除菌株HT-ΔGDH的最大生长量约为原始菌株的 70%-80%，FK506产量比野生型提高了85%-95%。

实施例5

对实施例2改造的前体磷酸烯醇式丙酮酸补给途径基因ppc敲除菌株HT-ΔPPC进行摇瓶 发酵培养，在摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵 母提取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5 g/L，pH6.8。磷酸烯醇式丙酮酸补给途径基因ppc敲除菌株HT-ΔPPC的最大生长量约为原始 菌株的60%-70%，FK506产量比野生型提高了80%-90%。

实施例6

对实施例3改造的前体脂肪酸合成代谢途径基因accA2扩增菌株HT-ACC进行摇瓶发酵 培养，在摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提 取物2g/L，蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L， pH6.8。脂肪酸合成代谢途径基因accA2扩增菌株HT-ACC的最大生长量约为原始菌株的 90%-100%，FK506产量比野生型提高了85%-95%。

实施例7

对实施例3改造的前体莽草酸途径基因dahp扩增菌株HT-DAHP进行摇瓶发酵培养，在 摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L， 蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8。 莽草酸途径基因dahp扩增菌株HT-DAHP的最大生长量约为原始菌株的95%-105%，FK506 产量比野生型提高了90%-100%。

实施例8

对实施例3改造的前体还原力平衡途径基因pntAB扩增菌株HT-PNT进行摇瓶发酵培养， 在摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L， 蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8。 还原力平衡途径基因pntAB扩增菌株HT-PNT的最大生长量约为原始菌株的90%-100%， FK506产量比野生型提高了80%-90%。

实施例9

对实施例3改造的前体磷酸戊糖途径基因zwf2扩增菌株HT-ZWF进行摇瓶发酵培养，在 摇瓶中28°C、220rpm培养168小时；使用的培养基组成为：淀粉60g/L，酵母提取物2g/L， 蛋白胨2.5g/L，黄豆饼粉5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，CaCO₃0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，pH6.8。 磷酸戊糖途径基因zwf2扩增菌株HT-ZWF的最大生长量约为原始菌株的90%-100%，FK506 产量比野生型提高了80%-90%。

经过试验，本发明在下述条件范围内，可达到需要的效果。

构建FK506菌株基因组代谢网络模型，进行代谢通量分析，获得初级途径筛选到合理的 基因改造策略，包括对谷氨酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的单基因敲除，对3-脱氧-D- 阿拉伯糖基-heptulosonate-7-磷酸合酶、烟酰胺核苷转氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、6-磷酸葡萄 糖脱氢酶的单基因扩增。对预测的前体基因进行分子改造，改造菌株在装有200mL液体发酵 培养基的500mL摇瓶中，160-220rpm，25-30°C条件下培养120-196h，可提高FK506的产 量80%-100%，验证了模型对初级途径前体合成基因预测的准确性。