环介导等温扩增(LAMP)的序列特异性实时监测

摘要

公开了能够快速区分所选择病原体的所选择株与相同种内其它种群的基于基因的诊断法。可以通过使用寡核苷酸探针，称为“同化探针”，来完成DNA的LAMP的序列特异性实时监测。同化探针包含两条寡核苷酸链，其中一条包含猝灭剂（称为猝灭探针）而另一条包含荧光团（称为荧光探针）。在LAMP反应期间，当所述两条链互相替换时，产生荧光信号。通过监测发射的荧光，可以检测序列特异性扩增。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年6月22日提交的标题为“用于环介导等温扩增 （LAMP）的序列特异性实时监测的系统和方法（SYSTEMS AND  METHODS FOR SEQUENCE SPECIFIC REALTIME MONITORING OF  LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION（LAMP））”的美国 临时专利申请号61/357,428的优先权，该专利申请的全部内容作为参考并 入本文并且应认为是本说明书的一部分。

有关联邦政府资助的研究开发的声明

本发明是通过批准号2006-55605-16683和07-55605-17843的政府资 助以及美国农业部（USDA-NRI）授予的项目HAW00559-04G进行的。政 府对本发明具有一定的权利。

背景技术

病原菌是可以在植物、动物和人类中导致疾病的那些细菌。由于病原 菌的多样性，存在大量病原菌和伴随的疾病。这些疾病的实例可以包括植 物中的萎蔫病、软腐病和枯萎病，狗中的细小病毒、贾弟虫和洛基山斑疹 热，和人类中的肺结核、肺炎和破伤风。

由细菌性病原体所引起的疾病可以导致财产和生命的巨大损害。例 如，青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是在超过200种植物种中导 致萎蔫病的细菌性病原体。据估计主要影响马铃薯产量的该病原体中的一 个种（小种3变种2（race3biovar2））每年造成超过约9.5亿美元的损失。

减缓并防止细菌性疾病传播首先包括鉴别病原菌的存在。然而，用于 病原菌检测的技术可能相对缓慢。此外，这些技术可能不能将所选的细菌 性病原体种与其它种相区别。由于不能正确鉴别生物病原体，因此阻止并 消除爆发的举措可能会被过度延迟。

因此，对开发能够快速检测所选病原体株并且将所选病原体株的亚群 与相同种内的其它种群相区别的检测技术具有浓厚兴趣。

发明内容

在一个方面，提供了监测靶DNA的环介导等温扩增（LOOP-mediated  isothermal amplification）（LAMP）的方法。所述方法通常包括提供LAMP 反应混合物，所述反应混合物包含靶DNA和能够扩增所述靶DNA的一 种或多种LAMP引物。可以将同化探针（assimilating probe）加入到LAMP 反应混合物中，其中所述同化探针包含两条寡核苷酸链（oligonucleotide  strands），其中第一寡核苷酸链包含位于3'端的猝灭探针（猝灭剂探针， quencher probe）并且其中所述同化探针的第二寡核苷酸链包含结合 （conjugated）在5'端的荧光团。加入到LAMP反应混合物中的所述第二 寡核苷酸链的量与所述第一寡核苷酸链的量的比率可以小于1:1。还可以 将DNA聚合酶加入到包含所述同化探针的LAMP反应混合物中。可以测 量包含所述同化探针和DNA聚合酶的LAMP反应混合物所发射的荧光。

在另一个方面，提供了用于监测靶DNA的环介导等温扩增（LAMP） 的同化探针。所述探针通常包含第一寡核苷酸链，所述第一寡核苷酸链包 含位于所述链的3'端的猝灭探针。在一些实施方式中，所述探针包含第二 寡核苷酸链，所述第二寡核苷酸链包含结合在所述链的5'端的荧光团。另 外，在一些实施方式中，所述第二寡核苷酸链与所述第一寡核苷酸链的量 的比率可以小于1:1。

附图说明

图1是用于温度控制的激光驱动器和用于监测杂交探针的荧光计的电 路示意图；

图2是基于CD的平台中辐射源的示意图；

图3A是本发明的实施方式的定制荧光计和激光驱动器的电路板布局 的示意图；

图3B是图3A的定制荧光计和激光驱动器的组装电路板的光学照片。 在聚碳酸酯CD上方还显示了高温计头部；

图4是在ABS中具有多种尺寸的反应孔（反应容器，reaction well） 的印刷CD的光学照片；

图5是与通过热电偶测量的真实孔温度相比，通过非接触式热电偶（例 如，高温计）估计的修正孔温度的图。在插图中显示了用于估计通过孔的 辐射透射和来自孔表面的环境辐射的反射的系数的校准数据；

图6是显示从大致环境温度至约65℃的设定点的反应孔中温度控制 的温度测量图；

图7是相对荧光相对于具有约0.4μΜ分子拉链的rsfliC LAMP的时间 的图；

图8是相对荧光相对于时间的图，其显示了通过在形成分子拉链结构 之前在LAMP反应混合物中直接加入荧光链和猝灭链（quencher strand） 对rsfliC LAMP反应的实时监测；

图9是相对荧光相对于rsfliC LAMP和具有靶向rsfliC的同化探针 （0.08μΜ荧光链和0.16μΜ猝灭链）的λ噬菌体LAMP的时间的图；

图10是相对荧光相对于时间的图，其显示使用了用于rsfliC LAMP 扩增终点检测的分子信标以及rsfliC LAMP反应的速度观察；

图11是相对荧光相对于时间的图，其显示了当使用rk2208.1和rsfliC 引物组结合升高浓度的Bst DNA聚合酶时所测量的荧光；

图12是相对荧光相对于时间的图，其显示了使用rk2208.1引物组和 升高浓度的Bst DNA聚合酶所获得的可观察到的荧光增加；

图13是达到检测阈值的时间相对于来自图12的数据中Bst DNA聚合 酶含量的图；

图14是相对荧光相对于通过同化探针监测的具有引物组rk2208.1， 不具有环F（loopF）引物的LAMP反应的时间的图。以约0.08μΜ、约0.4μΜ 和约0.8μΜ的浓度提供荧光链，并且以约0.16μΜ、约0.8μΜ和约1.6μΜ 的浓度提供猝灭链；

图15是相对荧光相对于通过具有不同浓度的同化探针荧光链和猝灭 链的环F（loopF）引物的rk2208.1LAMP反应的时间的图。猝灭链的浓度 为荧光链的约两倍；

图16是相对荧光相对于使用本发明所述的同化探针和插入染料 （EvaGreen）的实施方式的LAMP反应的时间的图；

图17是相对荧光对相对于肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和细菌 噬菌体λ（噬菌体λ，bacteriophage lambda）基因组DNA的多路LAMP 反应的时间的图。

图18是使用用于荧光素的光谱设定所观察到的相对荧光相对于使用 荧光素标记的肠沙门氏菌（Salmonella enterica）同化探针扩增肠沙门氏菌 （Salmonella enterica）和/或细菌噬菌体λ基因组DNA的多路LAMP反应 的时间的图；和

图19是使用用于cy3的光谱设定所观察到的相对荧光相对于使用cy3 标记的λ噬菌体同化探针扩增肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和/或细菌 噬菌体λ基因组DNA的多路LAMP反应的时间的图。

具体实施方式

如本文所使用的术语“约”、“大约”和“基本上”表示与所说明的量接近 的量，其仍执行所需功能或者实现所需结果。例如，术语“约”、“大约”和“基 本上”可以指在所说明的量的小于10%之内、小于5%之内、小于1%之内、 小于0.1%之内或小于0.01%之内的量。

本发明公开的实施方式提供了能够快速区分所选病原体的所选株与 相同种内的其它种群的基于基因的诊断法。实例可以包括，但不限于，细 菌噬菌体λ（噬菌体λ，bacteriophage lambda）、青枯雷尔氏菌（Ralstonia  solanacearum）的小种3变种2株（race3biovar2strains）、青枯雷尔氏菌 （Ralstonia solanacearum）、肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和金黄色葡 萄球菌（Staphylococcus aureus）。可以通过将特定寡核苷酸探针（本文中 称为“同化探针”）加入到包含LAMP引物和靶DNA的混合物中来完成靶 DNA的环介导等温扩增（LAMP）的序列特异性实时监测。

同化探针本身可以包含两条不同的寡核苷酸链。第一寡核苷酸链可以 包含猝灭剂（称为猝灭探针），而第二寡核苷酸链可以包含荧光团（称为 荧光探针）。在LAMP反应期间，当所述两条链互相替换时，产生荧光信 号。通过监测发射的荧光，可以检测LAMP反应。

此外，实施方式的所述同化探针当扩增的所选定的靶DNA发生时， 可以包含经历显著的移位的链。因此，当不发生靶DNA的扩增时，所述 同化探针可以基本上不发荧光，而当存在靶DNA的扩增时，可以基本上 发荧光。因此，靶DNA扩增的检测可以是序列特异的。

如本文所使用的，术语同化探针可以采用本领域技术人员所理解的它 的惯常含义，并且当互相不杂交且还当荧光探针与猝灭探针杂交在一起时 可以进一步指荧光探针和猝灭探针。

如以下更详细地讨论的，LAMP反应混合物中同化探针的存在可以减 缓进行LAMP反应的速率。然而，已鉴别了由于存在同化探针而降低同化 探针对LAMP反应速率的影响的同化探针参数。这些参数包括，但不限于， 荧光探针与猝灭探针的比率、混合所述链（荧光探针和猝灭探针）以产生 同化探针的方式以及同化探针的总量。通过降低同化探针对LAMP反应速 率的影响，有利于LAMP反应的实时监测。还可以在所选范围内改变这些 参数以减少检测LAMP反应所需的时间，从而进一步有利于实时检测。

设计用于独立的LAMP反应的同化探针的实施方式还可以用于多于 一个单一基因序列的实时检测（多路检测）。为了实时进行LAMP反应的 多路检测，每个同化探针可以使用可以单独监测的光谱学唯一的荧光团。

本发明的其它实施方式提供了有利于这些基于基因的诊断法的实时 应用的基于基底的硬件平台。在一些实施方式中，所述平台包括由孔组成 图案以用于进行LAMP反应的光盘（CD）或其它基底。在一些实施方式 中，可以将高温计用作非接触温度传感器以监测基于基底的平台的反应孔 内的温度。高温计可以根据对反应孔所发出的热辐射的测量来估计所述基 底的反应孔内的温度。还开发了校准程序以修正由于存在水和密封反应孔 的透明薄膜所导致的通过高温计测量的温度误差。这些温度测量还可以用 于控制热源。以这种方式，可以将所述反应孔内的温度对在其中发生的 LAMP反应保持大致恒定。

有利地，这些工具可以有利于病原体的准确区分，并且例如使得能够 对疾病引入的响应做出及时的管理决定。可以理解所公开的实施方式还可 以在多种其它背景中是有用的，其包括，但不限于，临床诊断学，如在低 来源环境中和军队以及国家安保人员对生物制剂的鉴定。

在一个实施方式中，提供了通过LAMP对所选DNA序列实时检测的 方法。所述方法可以包括在所选基底（例如，CD）中形成图案以形成反 应孔。所述方法还可以包括将如本文所述的LAMP反应混合物和同化探针 加入到所述反应孔中。所述方法另外可以包括密封所述孔并将靶DNA加 入至孔中。所述方法另外可以包括用热源（例如，激光）将所述孔的内容 物加热至足以诱导荧光的温度。所述方法还可以包括检测所述荧光。

硬件设计

可以在包含用于单独LAMP反应的多个孔的基底上进行LAMP过程。 所述基底可以是本领域中已知的任何材料，如塑料、金属或复合材料。在 一些实施方式中，可以将光盘（CD）平台用于进行用于DNA扩增和检测 的环介导等温扩增（LAMP）过程。CD平台允许样品制备和反应步骤的 自动化，并且提供了良好的密封度（containment）。尽管在本文中一般是 就CD基底而言进行描述的，但是可以使用提供多个反应孔的其它基底。

在包含在CD或其它基底内的反应孔内进行LAMP反应。在某些实施 方式中，可以通过图案化来制造所述反应孔。可以通过机械装置 （mechanisms）在基底如CD中产生图案，所述机械装置包括，但不限于， 用于快速原型设计的激光和/或印刷、用于批量生产的注塑成型以及用于使 光盘或本领域中已知的其它基成图案化的其它机械装置。

例如，在一个实施方式中，可以使用激光雕刻机（例如，Venus-30,GCC  Systems,Taipei Hsien,Taiwan）在黑色聚碳酸酯（例如，Lexan）盘上形成 图案。在另一个实施方式中，可以使用计算机数字控制（CNC）机器使聚 碳酸酯空白盘图案化。在其它实施方式中，可以使用3D打印机（例如， SST1200,Dimension Inc,Eden Prairie MN）作为整体产生图案化的丙烯腈 丁二烯苯乙烯（ABS）盘。可以根据所需应用制造所述盘的横截面形状。 例如，在某些实施方式中，可以将所述孔制备成具有一般圆形截面的圆柱 体结构。

在一些实施方式中，用于LAMP监测的基底厚度可以在约1.2mm至 约1.8mm的范围内。然而，可以理解，所述基底的实施方式可以由材料 （如本领域中已知的其它聚合物）无限制地形成。

根据需要，所述反应孔的横截面积也可以是不同的。例如，在具有一 般圆形截面的圆柱体结构的孔的实施方式中，所述反应孔的直径可以根据 在所述孔中进行的特定反应而无限制地改变。在一些实施方式中，所述孔 直径的值可以从约3mm至约4mm，或者可以是它们中间的任何值。

在其它非限制性实例中，所述反应孔中的一个或多个可以被一个或多 个壁和通道围绕。有利地，所述壁和/或通道的存在可以改善反应孔周围的 隔热性。在某些实施方式中，可以在约0.5mm至5mm的范围内选择所述 壁厚度值。在某些实施方式中，可以选择具有约0.5至约5mm范围内的 值的所述通道厚度值。然而，可以理解，根据需要可以选择所述壁厚度和 通道厚度以采用适合于LAMP监测的任何值。除非另作说明，否则在以下 所讨论的实例中使用的所述反应孔厚度和通道厚度分别为约1mm和约 2mm。在一些实施方式中，可以选择所述反应孔和通道的深度以在所述反 应孔和/或通道下方保留5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.3mm 或更小的基底材料。在以下的实例中，选择所述反应孔和通道的深度以在 所述反应孔下方保留约0.3mm厚的盘材料。

可以使用非接触温度传感器记录CD或其它基底的温度。在一个实施 方式中，所述非接触温度传感器可以包括包含光源和检测器的高温计。例 如，可以将具有微型光头的商业化高温计连接到柔性电缆（例如， MID20LTCB3,Raytek,Santa Cruz,CA）。可替换地，可以将单片型（例如， MLX90614ESF-BAA,Melexis,Ieper Belgium）直接安装在邻近于反应孔位 置的电路板上。为了校准，可以使用热电偶（例如，由细热电偶丝制成的 K型热电偶，例如Omega Engineering,Stamford,CT），记录标准温度。可 以将所述热电偶丝连接到软件补偿的万用表（例如，Fluke186,Everett, WA）上。

如以下更详细地说明的，为了有利于非接触温度传感器的校准，可以 用蒸馏水（或其它不反应的液体）将所述孔基本上充满并用具有粘合底布 的透明薄膜（例如，Microseal'B'粘合封口，Bio-Rad,Hercules CA）覆盖。 有利地，通过校准所述非接触温度传感器以补偿所述反应孔中非发射性液 体和薄膜的影响，可以更精确地控制所述反应孔中的温度。

还可以通过热源来实施所述反应孔的加热。热源可以包括但不限于， 如本领域中已知的接触和非接触源。在一个实施方式中，所述热源可以包 含光学加热装置。例如，所述光学装置可以包含对准所述反应孔下侧的散 焦激光。例如，可以通过使用以约150mW大致对准所述孔下侧的条件操 作的808nm红外线激光二极管组件（例如，icetec-UK）来实现加热。所 述激光可以大致是散焦的以抑制所述盘的灼烧并且将热量均匀地分布在 孔中。可以通过由来自微控制器（例如，Fox LP3500,Rabbit Semiconductor, Davis,CA）的脉冲宽度调制（PWM）信号驱动的逻辑光耦合器门控的n 沟道功率MOSFET（参见图1）控制激光功率。

为了提供温度控制，可以使用来自高温计的反馈通过修改的比例积分 控制程序对控制器编程。如下所述，可以在应用校准修正后通过微控制器 接收高温计反馈。要实施光学温度检测，可以例如通过具有所选波长的高 强度光源倾斜照射样品。在一个实施方式中，所述光源可以包含发射约 450nm至约475nm之间（例如，约470nm）范围内所选波长的光的蓝光 发射二极管（LED）。能够具有这种光照的LED光源的实例为Agilent  Technologies,Santa Clara,CA生产的HLMP CB28STD00。

可以通过检测器检测从反应孔中发出的热辐射。在一个实施方式中， 所述检测器可以包含邻近光源布置的光电二极管。可以安装检测器以收集 穿过水和所述透明薄膜的来自所述孔表面的热辐射。如图1中所示，可以 使用在约10¹⁰V/A-10¹²V/A之间的范围内运行的高增益光电放大电路（例 如，T-5系列，Intor Inc.,Socorro NM）来运行所述检测器。可以使用窄带 通干涉滤光片（例如，Intor）调谐通过检测器测量的激发和发射光谱。然 而，可以理解，在可替换的实施方式中，可以代替上述光电二极管检测器 或与之结合使用接触温度传感器。

非接触温度传感器的校准

可以在所述系统中选择非接触温度传感器以用于温度测量从而防止 污染，如在一次性CD平台中。例如，可以将高温计用作非接触温度传感 器。然而，所述检测器测量从所述反应孔的表面发出的热辐射以便确定所 探测区域中的温度（例如，单个孔的温度或所选的孔组的平均温度）。这 种热辐射穿过反应液体（例如，水）和用于密封所述孔的材料（例如，透 明薄膜，存在薄膜）。不受理论的限制，据信由于这些材料具有低发射率， 所以它们可以在来源于所述孔内部的辐射以及来自环境的热辐射中引入 反射。因此，这些材料可能会在由通过高温计测量的热辐射计算的温度中 引入误差。

可以校准高温计以修正这些误差。如以下所讨论的，作为来自处于稳 态的热源的不同光功率的函数，可以使用高温计和与反应孔接触的热电偶 测量所述反应孔内的温度。可以将这些测量放入到基于高温计所测量的温 度计算反应孔正确温度的校准模型中。

在图2中示意性地显示了基于CD的检测系统200以及辐射源。系统 200包括具有一个或多个反应孔204的基底202（例如，塑料盘，如聚碳 酸酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）或者另一种适合的塑料材料）。可以 将透明薄膜206放置在反应孔204的上方以抑制污染物进入反应孔204中。

可以将检测器210定位在基底202的上方以测量从基底202发出的热 辐射。在一些实施方式中，检测器210可以包括高温计。可以使用校准模 型来修正由于通过反应孔内材料（例如，LAMP反应混合物、覆盖所述孔 的保护性薄膜）的热辐射传播和基底本身对入射荧光的吸收所造成的检测 器210的温度测量误差。如图1所示，E_c是从热源吸收到基底202中以控 制反应孔204的温度的热辐射。E_T是从反应孔204表面发出的热辐射。E_t是传输通过反应孔204和透明薄膜206到达检测器210的来自反应孔204 表面的热辐射部分。E_amb是从紧密接触（碰撞）透明薄膜206的环境中发 出的热辐射。E_r是反射到检测器210中的环境热能部分。在一个实施方式 中，校准模型可以认为基本上所有辐射均来源于反应孔204的表面或来自 环境并且在穿过反应孔204中的水和透明薄膜206后或者在从这些表面反 射后在检测器210检测。

在这些情况下马克斯韦尔方程的解产生了与在其各自边界上的多种 材料的归一化波阻抗有关的反射和透射系数。反过来，这些波阻抗与所述 波通过的材料各自的电容率和磁导率有关。最终结果是来源于反应孔204 的总热辐射的一部分a到达检测器210，并且来源于环境的总热辐射的一 部分b反射离开反应孔204以到达检测器210。

从适用于灰体的斯蒂芬-玻尔兹曼定律（Stefan-Boltzmann's law）来看， 根据方程1，体所发出的总热能E与材料的发射率ε和透明薄膜206表面 的绝对温度T有关：

E＝εσT⁴                               (1)

其中σ是斯蒂芬-玻尔兹曼常数。基于到达高温计210的检测器的热 辐射，采用所选的材料发射率，检测器210可以估计透明薄膜206表面的 温度。根据方程2，到达高温计210检测器的总热能E可以用来计算指示 温度T_i：

E_i＝E_t+E_r                               (2)

E_t是在传输通过反应孔204内的反应材料体积和透明薄膜206后到达 检测器高温计210的来源于反应孔204的热辐射。E_r是在从透明薄膜206 表面反射后到达检测器210的检测器的来源于环境的热能（参见，例如， 图2）。

将斯蒂芬-玻尔兹曼定律和从以上获得的经验系数a和b应用于以上方 程中的每一项，可以获得方程3：

${ϵ}_{\mathrm{set}}{{\mathrm{\sigma T}}_i^4\mathrm{a\omega }}_{\mathrm{well}}{\mathrm{\sigma T}}^4+{\mathrm{b\omega }}_{\mathrm{amb}}{\mathrm{\sigma T}}_{\mathrm{amb}}^4---\left(3\right)$

ε_set是检测器210的发射率设定值（emissivity setting）。在某些实施方 式中，对于ε_Set可以采用缺省值（例如，约0.95）。然而，基于检测器210， 可以采用其它发射率值。ε_well是反应孔表面的发射率。ε_amb是环境温度T_amb下包围材料的发射率。

温度T_i、T_amb和T可以彼此相关。例如，通过重新排列方程3，T_i可 以用T_amb、T和称为A和B的经验系数以及包括对传播和/或反射损耗的 修正的周围环境来表示：

$T_i^4={\mathrm{AT}}^4+{\mathrm{BT}}_{\mathrm{amb}}^4---\left(4a\right)$

A＝(aε_well)/(ε_set)                    (4b)

B＝(bε_abl)/(ε_set)                     (4c)

经验系数A和B表示系统（例如，孔）的发射率的比率并且可以通 过在恒定环境温度T_amb下对作为真实孔温度T四次方（fourth power）的 函数的指示温度T_i的四次方进行线性回归来确定。对实际孔温度T解方 程4a获得系数A和B。反过来，根据方程5，这些系数可以用于从给定 检测器温度读数T_i估计T：

$T={\left(\frac{T_i^4-{\mathrm{BT}}_{\mathrm{amb}}^4}{A}\right)}^{1/4}---\left(5\right)$

用这样的方式，可以校准检测器210以改善非接触温度测量的准确度。 然而，在其它实施方式中，可以通过其它机制获得温度测量，如通过与反 应孔接触的热电偶。

荧光计和激光驱动器

图3A是本发明的实施方式的定制荧光计和激光驱动器的电路板布局 的示意图。

图3B是图3A的定制荧光计和激光驱动器的组装电路板的照片。在 聚碳酸酯CD上方还显示了高温计头部。

环介导等温扩增和检测：

环介导扩增（LAMP）可以用于实现等温基因复制并且无模版DNA 的变性。LAMP还可以扩增其靶DNA而无需裂解或提取细胞，但是其导 致获得了更低的检测限。在以下文献中详细说明了LAMP的实施方式，每 篇文献以其全部内容作为参考并入。

·N.Tsugunori,et al.,"Loop-mediated isothermal amplification of DNA," Nucleic Acids Research,Vol.28,No.12,June15,2000.

·Y. Mori,et al.,"Detection of loop-mediated isothermal amplification  reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation," Biochemical.Biophys.Res.Comm.,Vol.289,No.1,p.150-154,Nov.23, 2001.

·K.Nagamine,"Isolation of single-stranded DNA from loop-mediated  isothermal amplification products,"Biochemical and Biophysical Research  Communications,Vol.290,No.4,p.1195-1198,Feb1,2002.

·K.Nagamine,et al.,Accelerated reaction by loop-mediated isothermal  amplification using loop primers,"Molecular and Cellular Probes,Vol.16,No. 3,p.223-229,June2002.

在一个实施方式中，LAMP可以使用四种引物的组。这四种引物可以 识别六条不同的序列并且依赖于例如通过Bst DNA聚合酶大片段的自循 环链置换DNA合成。用于LAMP反应的引物可以是内引物（例如，FIP 和BIP）和外引物（例如，F3和B3）。可以通过内引物（例如，FIP或BIP） 与靶DNA上其各自引发位点（例如，F2c或者B2c）的杂交来起始LAMP 反应。外引物（例如，F3或B3）随后杂交至靶DNA上其引发位点（例 如，F3c或B3c）并起始置换已从内引物延伸出的DNA序列的新互补序列 的合成。结果是可以在两端形成茎环结构（stem-loop structure）的DNA 序列。该自引发“哑铃”结构是用于LAMP自循环扩增的起始材料。

还可以使用称为环引物的其它引物来加速LAMP反应。环引物可以杂 交至从靶DNA模板转录的环部分。由于需要正确起始材料的转录，所以 这种另外的引发可以加速LAMP反应并改善LAMP选择性。在某些实施 方式中，可以在等温条件（在所需范围内选择的温度值，例如，约60℃至 约70℃之间，或者约60℃至约65℃之间）下进行LAMP反应。扩增产物 可以是茎环DNA，其通常具有几种靶的倒位重复（inverted repeat）。倒位 重复通常显示出具有多个环的菜花样结构。

已发展了多种机制来检测通过LAMP的DNA阳性扩增。在一个方面， 可以使用插入染料如SYBR绿（SYBR Green）或实时监测DNA 的阳性扩增。已知SYBR绿对聚合酶链反应（PCR）或嗜热蜗牛酶依赖性 扩增（tHDA）具有抑制作用。相反，已报道EvaGreen对PCR具有较低 的抑制作用并且还已用于检测LAMP反应。然而，如以下更详细地讨论的， 可以观察到EvaGreen对LAMP反应的高抑制作用。此外，这种机制不允 许DNA产物的序列特异性确认。然而，值得注意的，这种机制不允许DNA 产物的序列特异性确认。相反，该技术仅检测阳性扩增。

在另一个实施方式中，可以通过测量LAMP反应混合物的白色混浊度 来鉴别阳性LAMP反应。由于焦磷酸镁是LAMP反应的副产物，因此白 色混浊度是阳性LAMP反应的指示。然而，尽管混浊度可以提供发生阳性 扩增的指示，但是混浊度本身不是所关心的特定序列经历LAMP的决定性 指示物。因此，仅靠混浊度来确定序列特异性易发生较高的假阳性率。

基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法（如分子信标、Taqman 探针和分子拉链）是为DNA扩增过程提供实时、序列特异性监测的技术。 分子信标包含具有自互补茎环结构的核酸探针，其在一端结合荧光分子， 而在相反端结合猝灭分子（猝灭剂分子）。因为由于互补茎环序列猝灭剂 接近荧光团，因此在不存在靶序列的情况下，不发射荧光。当环区杂交至 靶时，猝灭剂和荧光团彼此分开并且可以检测荧光发射。

然而，值得注意的，用于监测LAMP的分子信标的使用可以是困难的。 例如，在等温条件下，分子信标可能对dsDNA产物（如LAMP扩增子） 的可接近性较差。此外，由于Bst DNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，因此 通常不使用Taqman探针来检测LAMP反应。尽管如此，可以在某些实施 方式中使用任何这些技术。

分子拉链是包含部分双链短DNA片段的分子。所述分子拉链的第一 链包含3'端的猝灭剂并且可以称为猝灭探针。所述分子拉链的第二链包含 具有结合在5'端的荧光团的部分互补链和与所选少量靶DNA（如λ噬菌 体F、λ噬菌体B、rk1249.1F、rk2208.1F、rk2403.1F、rsfliC B、rsfliC F、 Se01F、SE01B、spa1.）互补的引发序列。该第二链可以称为荧光探针。 所述猝灭剂的实例可以包括但不限于DABCYL、TAMRA和黑洞猝灭剂 （Black Hole Quenchers）（BHQ）（Biosearch Technologies,Novato,CA）。 荧光团的实例可以包括但不限于荧光素、cy3、cy5和本领域中已知的任何 数量的量子点。在组装的拉链构造中，结合荧光团的末端与猝灭剂对齐。 在某些实施方式中，除了在DNA聚合反应中起引物作用的荧光链的突出 不相配部分（悬垂不相配部分，overhanging unmatched segment）外，所述 分子拉链的链一定需要是互补的。在一些实施方式中，可以配置所述分子 拉链从而使得当所述拉链的两条链彼此杂交时，荧光基本猝灭。

当所述拉链的两条链置换时，荧光信号是由所述分子拉链产生的。因 此，可以在LAMP中使用分子拉链。在其它实施方式中，通过设计突出区 来杂交至LAMP产物的环区，可以在随后的聚合反应过程中发生通过Bst DNA聚合酶的链置换活性的所述分子拉链的分离。另外，在其它实施方 式中，通过配置熔融温度超过LAMP过程（例如，约65℃）的拉链序列， 分子拉链对低背景信号的LAMP反应中的实时监测可以是有用的。先前已 证明了分子拉链对滚环扩增（RCA）和网状分枝扩增（RAM）的实时监 测。

在分子拉链中，荧光探针和猝灭探针通常以近似相等的量混合并杂交 以形成双链拉链。例如，在某些实施方式中，可以在约95℃将等量的荧光 探针和猝灭探针（例如，约20μΜ）培育约5分钟，并且缓慢冷却至约室 温以便形成双链分子拉链。

将杂交的分子拉链探针加入到LAMP反应混合物中。在一些实施方式 中，可以加入杂交的分子拉链探针以提供在约0至约100μΜ范围内选择 的最终浓度值。在某些实施方式中，分子拉链的浓度可以具有在约0μΜ 至约10μΜ的范围内选择的值。在其它实施方式中，分子拉链的浓度可以 在约0μΜ至约1μΜ的范围内。在一个实施方式中，分子拉链的浓度可 以是约0.4μΜ。

在一些实施方式中，本发明提供了改善的检测技术。使用FRET原理， 已设计了一对标记的寡核苷酸探针（在本文中称为“同化探针”）来进行 DNA的LAMP的序列特异性实时监测。探针对与以上所讨论的分子拉链 类似。然而，本发明所述的分子拉链和同化探针的实施方式至少相对于其 反应过程的实施来说是不同的。

表1显示了用于与不同LAMP引物和靶生物一起使用的荧光探针和猝 灭探针的实施方式。

表1-用于靶生物的LAMP引物组和同化探针

在表2中总结了每种引物和探针的分子结构/序列。

表2-LAMP引物、同化探针和分子信标

已经鉴别了与同化探针有关的几个参数，在一些实施方式中，与其它 检测技术相比其可以显著改善同化探针的性能。这些参数包括荧光探针与 猝灭探针的量的比率、将同化探针加入到LAMP反应混合物中的方式以及 竞争LAMP扩增子单链环上退火位点（annealing site）的同化探针的总量。 例如，尽管在LAMP反应混合物中存在同化探针可以导致LAMP反应速 率降低，但是当所述参数值在所选范围内时，LAMP反应混合物中存在同 化探针对LAMP反应速率的抑制程度可以忽略。

就荧光探针和猝灭探针而言，在某些实施方式中，可以将所述荧光探 针与所述猝灭探针的比率选择为小于约1:1（例如，猝灭探针的浓度比荧 光探针的浓度更高）。这些比率的实例可以包括但不限于，小于约1:1.1、 小于约1:1.2、小于约1:1.3、小于约1:1.4、小于约1:1.5、小于约1:1.6、 小于约1:1.7、小于约1:1.8、小于约1:1.9和更小。这些比率的实例还可以 包括但不限于，小于约1:2、小于约1:3、小于约1:4、小于约1:5和更小。

有利地，已发现处于该范围内的比率降低了存在同化探针对LAMP 反应速率的抑制程度并且降低了背景荧光混淆检测的程度。例如，如以下 更详细地讨论的，实施例4显示在约65℃培育约120分钟后，荧光探针与 猝灭探针约1:1的比率（例如，分子拉链）提供了基本上不升高的荧光信 号，其具有高荧光背景，指示在反应温度分子拉链中荧光链的不完全组装。

相反，当使用约1:2的荧光探针与猝灭探针的比率时，在约65℃培育 约60分钟后观察到大量扩增子（实施例6）。在一些实施方式中，对于小 于约1:2的比率可以获得相似的结果。

在其它实施方式中，可以改变将同化探针链混合到LAMP反应混合物 中的方式以提高LAMP的反应速度，并因此缩短了产生足以进行检测的扩 增靶DNA的量所需的时间。当加入到LAMP反应混合物中时，荧光探针 和猝灭探针可以处于相对于彼此未杂交的状态。即，可以将荧光探针和猝 灭探针单独加入到LAMP反应混合物中。这与分子拉链的情况相反，其中 荧光和猝灭探针杂交在一起，然后加入到LAMP反应混合物中。在某些实 施方式中，可以将本发明所述的荧光探针和猝灭探针彼此同时或不同时加 入到LAMP反应混合物中。

据观察与将双链同化探针结构（包含荧光探针和猝灭探针）加入到 LAMP反应混合物中相反，将荧光探针和猝灭探针分别直接加入到LAMP 反应混合物中，LAMP反应速率相对没有受到抑制，从而导致对阳性反应 更快速的指示（实施例5）。

在其它实施方式中，已认识到可以改变聚合酶浓度来影响LAMP反应 速率，并因此缩短了鉴别阳性反应所需的时间。例如，在一个实施方式中， 聚合酶浓度可以大于或等于约8U、大于或等于约16U、大于或等于约24U、 大于或等于约32U等。聚合酶浓度可以用来提高LAMP反应速度和缩短 检测时间。

例如，如以下更详细地讨论的（实施例8），使用rk2208.1引物组和 约8U的Bst DNA聚合酶在约20分钟后检测荧光。相反，当将Bst DNA 聚合酶的量从约8U加倍至约16U时，在约10分钟后检测荧光。该结果 表明随着聚合酶浓度的加倍，LAMP反应速度也大致加倍。预计进一步提 高聚合酶浓度可以缩短检测时间。还相信速度的额外增加是大致线性的， 一直到大约其中速度限制引物退火速率成为限制的点，这是因为它们被酶 催化聚合速率超过。

还可以改变反应混合物内同化探针的总量以影响LAMP反应速度和 可观察的荧光的发生。已认识到通过提高加入到反应混合物中的荧光和猝 灭探针的量显著缩短了检测时间（参见，例如，实施例10）。例如，如实 施例8中所讨论的，加入到LAMP反应混合物中的荧光探针的量可以大于 约0.08μΜ、大于或等于约0.4μΜ、大于或等于约0.8μΜ等并且猝灭探针 的各个浓度可以大于或等于约0.16μΜ、大于或等于约1.6μΜ等。

在其它实施方式中，荧光探针与猝灭探针的比率可以小于约1:1。这 些比率的实例可以包括但不限于，小于小于约1:1.5、小于约1:2、小于约 1:2.5、小于约1:3、小于约1:3.5、小于约1:1.4、小于约1:1.4.5、小于约 1:5、小于约1:5.5、小于约1:1.60、小于约1:1.65、小于约1:1.70、小于约 1:1.75、小于约1:1.80、小于约1:8.5、小于约1:9、小于约1:9.5和更小。 这些比率的实例还可以包括但不限于，约1:2、约1:3、约1:4、约1:5和 更小。

在某些实施方式中，可以将荧光探针和猝灭探针的量保持尽可能低， 同时在LAMP反应混合物中进行通过LAMP的DNA阳性扩增时仍提供可 检测的荧光水平。用这样的方式，仍可以进行检测，同时基本上消除了由 于存在同化探针所导致的LAMP反应速率的降低。在某些实施方式中，荧 光探针的量可以在约0.01至约0.4μΜ的范围内。在其它实施方式中，可 以在约0.02至约0.8μΜ的范围内选择猝灭探针的量。在其它实施方式中， 同化探针的总量可以在约0.03μΜ至约1.2μΜ的范围内。

如以下在实施例中更详细地讨论的，在实施例10中已确定LAMP反 应混合物中更大量的同化探针导致荧光检测发生的更长延迟。由于当大量 存在时，同化探针抑制LAMP反应速度，所以这种情况可能发生。例如， 荧光探针和猝灭探针浓度增加10倍（例如，约0.08μΜ和约0.16μΜ分 别至约0.8μΜ和1.6μΜ）提供了荧光检测时间约6倍的增加，从约20分 钟至约120分钟。

实施例

在以下实施例中，测试了同化探针的实施方式以评价它们监测LAMP 反应的能力。还可以在同化探针的实施方式和使用分子拉链、分子信标和 插入染料的检测技术之间进行比较。

LAMP引物

使用了多种不同的LAMP引物组以评价同化探针的性能：λ噬菌体 LAMP、rk1249.1、rk2208.1、rk2403.1、rsfliC和Se01和Spa1。rsfliC LAMP 引物组设计为靶向青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）（Rs）鞭毛蛋 白亚基C（flagellin subunit C）(fliC）基因，其存在于该种的大部分成员 中。

rk1249.1、rk2208.1和rk2403.1引物组设计为靶向分类为小种3变种2 （Race3Biovar2）（R3B2）的Rs株亚群独有的DNA序列区。λ噬菌体DNA LAMP引物组设计为靶向λ噬菌体DNA。Se01引物组设计为靶向肠沙门 氏菌（Salmonella enterica）。Spa1LAMP引物组设计为靶向金黄色葡萄球 菌（Staphylococcus aureus）。

在一个实施方式中，LAMP引物可以从供应商获得。在其它实施方式 中，LAMP引物可以设计为衍生化的。这些衍生化LAMP引物的实例可 以包括但不限于在Kubota,R.,B.G. Vine,A.M.Alvarez,and D.M.Jenkins, "Detection of Ralstonia solanacearum by loop-mediated isothermal  amplification,"Phytopathology.98(9):1045-1051(2008)中公开的那些，该文 献的全部内容作为参考并入本文。每个引物组和同化探针链的序列可见于 表2。

在以下所讨论的实验中，使用Kubota等人的规程来选择性扩增不同 的靶序列。在一个实施方式中，使用合著者Schell和Allen所提供的序列 比较信息（数据未显示），DNA靶包含噬菌体λ、青枯雷尔氏菌（Ralstonia  solanacearum）的小种3变种2株、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、 肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus  aureus）中的一种。

在一个实施方式中，在含有约1.6μΜFIP和BIP、约0.2μΜ浓度的F3 和B3引物、约0.4μΜ浓度的环B引物（loop B primer）、约400μΜ脱氧 核苷三磷酸（dNTP）、约1.0M甜菜碱（例如，Sigma-Aldrich Corp,St Louis, MO）、20mM Tris-HCl（约pH8.8）、约10mM KCl、约10mM(NH₄)₂SO₄、 约6mM MgSO₄、约0.1%Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）和模板DNA 的约25μl（总体积）反应混合物中进行LAMP反应。在约0.2ml微量管中 进行所述反应，使用热循环仪进行温度控制。将混合物加热至约95℃的温 度约5分钟，然后在加入约8U Bst DNA聚合酶大片段（例如，New England  Biolabs,Inc.,Beverly,MA）之前在冰上冷却。

在另一个实施方式中，在含有Se01LAMP和λ噬菌体LAMP引物组 并且在下列浓度：1.6μΜFIP和BIP；0.2μΜF3和B3；和0.4μΜ环F和B 的25μl中进行多路实时LAMP反应。以FAM Se01F探针、FAM Se01B 探针和λ噬菌体F探针中每一种为0.08μΜ的浓度并且猝灭探针（Quencher  probe）01为0.4μΜ的浓度，将同化探针包含在所述反应混合物中。

其它试剂浓度如下：400μΜ dNTP；1.0M甜菜碱（Sigma-Aldrich Corp, St Louis,MO）；20mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）（pH8.8）； 10mM KC1、10mM(NH₄)₂SO₄；8mM MgSO₄；0.1%Triton X-100（聚乙二 醇辛基苯基醚）；8U Bst DNA聚合酶大片段（New England Biolabs）和模 板DNA（50ng肠沙门氏菌DNA和/或λDNA为5ng）。

对于LAMP反应的实时监测，将所述反应在65℃培育60分钟并且使 用iQ5实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA）每分 钟测量荧光信号（荧光素：λex/em=500/530，Cy3：λex/em=550/570）。然 后，通过加热至80℃持续10分钟终止反应。对每种样品进行四次反应， 并且对于每组样品在每个反应时间点的荧光值进行平均。对于通道间荧光 数据的比较，将所有荧光值归一化为其中0和1,000RFU分别对应于对在 反应期间在给定通道上荧光值范围最大的平均样品所观察到的最小和最 大的荧光值的值。

在加入聚合酶后，将混合物在约65℃培育约60分钟。通过加热至约 80℃使聚合酶变性来终止反应。使用适当大小的标志物（例如，Hyper ladder  II;Bioline USA,Inc.,Randolph,MA），将扩增产物通过约2%琼脂糖凝胶 （1×Tris-乙酸盐-EDTA）在约85V电泳约90分钟，然后用溴化乙锭染色。

使用分子拉链和同化探针实时监测LAMP反应。将分子拉链设计为靶 向由种特异性引物（例如，导致来自所有青枯雷尔氏菌（Ralstonia  solanacearum）株的DNA扩增的引物）所产生的LAMP扩增子的环区域。 在一个实施方式中，通过将约2μΜ的正链（荧光团）和负链（猝灭剂） 在含有约100mM Tris-HCl（约pH8.0）和约10mM EDTA（pH约8.0）的 缓冲液中混合，在约95℃加热约5分钟并缓慢冷却至室温来产生分子拉 链。使用约0.04μΜ浓度的分子拉链用于进行实时LAMP反应。

然后，将这些分子拉链加入到具有种选择性LAMP引物、靶DNA（例 如，青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum））的反应混合物中，并且加入 到阴性对照（例如，来自λ噬菌体的DNA或不含DNA的反应混合物） 中。

为了检验同化探针检测LAMP反应的能力，还产生了设计为靶向由种 特异性引物所产生的LAMP扩增子的环区域的同化探针。在某些实施方式 中，所述正链（荧光团）和负链（猝灭剂）保持彼此分离并直接加入到 LAMP混合物中。荧光团和猝灭剂的浓度比分别小于约1:1。

根据从反应混合物发出的荧光确定分子拉链和同化探针检测在 LAMP反应混合物中发生LAMP反应的能力。例如，使用IQ5实时PCR 系统（例如，Bio-Rad,Hercules CA）测量荧光。

实施例1-硬件性能

与含有分子信标但无LAMP扩增子的阴性对照（未示出数据）相比， 使用定制荧光计成功观察了用靶向环区域之一的分子信标标记的LAMP 产物之间的差异。图4中显示了具有各种尺寸反应孔的ABS中的定制印 制CD。

实施例2-温度校准和控制的检验

如以上所讨论的，进行温度校准以评价校准技术。尽管存在通过孔和 透明薄膜的辐射损失，在图案化的ABS和聚碳酸酯中的反应孔上进行校 准测量并获得了高度精确的非接触温度测量。图5显示了与通过K型热电 偶所测量的真实孔温度相比由非接触式热电偶（例如，高温计）估计的修 正的孔温度。圆圈表示由聚碳酸酯中切开的孔所测量的数据，而三角形表 示由ABS中切开的孔所测量的数据。在图5的插图中显示了用于估计通 过孔的辐射传播和孔表面的环境辐射反射的系数的校准数据。在聚碳酸酯 CD上的单独校准的孔的温度中观察到的标准误差为约0.35℃。对总计5 个孔（包括在ABS中图案化的一些孔）应用相同校准获得了约0.93℃的 测量温度的标准误差。后一种结果表明在观测温度的热辐射光谱范围内， ABS和聚碳酸酯的发射率是非常相似的。

图6显示了瞬时温度测量，其显示仅使用修正的非接触温度测量对反 应孔中约65℃的设置点的温度控制。这些数据表明在约1分钟内达到设置 点。此外，数据分析发现达到设置点后系统均方根差为约0.27℃。这些结 果表明可以使用所公开的校准方法的实施方式将反应孔内的温度控制在 较高的程度。

为了改善温度控制的范围和速度，可以在LAMP之前使DNA变性。 在一个实施方式中，这可以使用比用于加热孔的功率更高的激光来进行。 在其它实施方式中，可以改变反应孔的设计以限制其热质量并改善隔热 性。

实施例3-LAMP反应设置

a）菌株和DNA纯化

根据Norman和Alvarez（Norman,D.,and Alvarez,A.M.,"A rapid  method for presumptive identification of Xanthomonas campestris pv. dieffenbachiae and other xanthomonads,"Plant Disease,73,654-658(1989)， 该文献的全部内容作为参考并入本文），在改性的氯化四唑（TZC）琼脂 培养基上生长R_s株GMI1000（R1B3）和UW551（R3B2）。将Rs株在约 28℃培育约48-72小时。根据生产商的说明书，用基因组DNA纯 化试剂盒（Promega Corp.,Madison,WI）从这些细胞中纯化DNA并通过 分光光度法定量。对于λDNA LAMP反应，购买了纯化的λDNA（New  England Biolabs,Inc.,Beverly,MA）。

使用溶原性肉汤（LB）培养基使金黄色葡萄球菌（Staphylococcus  aureus）株进一步生长并在约38℃培育约18-24小时。将细胞悬浮在双蒸 水（ddH2O）中并在100℃热杀死15分钟。

在多路检测的实施方式中，将肠沙门氏菌（Salmonella enterica）株在 木糖-赖氨酸-脱氧胆盐（XLD）琼脂培养基（Zajic-Satler and Gragas,1977） 上进一步生长并在38℃培育18-24h。根据生产商的说明书用基因 组DNA纯化试剂盒（Promega Corp.,Madison,WI）从这些细胞中纯化DNA 并通过分光光度法定量。对于λ噬菌体LAMP反应，购买了纯化的λDNA （New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA）。

b）LAMP反应

在用于单一扩增检测的同化探针的实施方式中，除其中另有说明外， 使用总体积为25μl的LAMP反应混合物进行LAMP反应。在某些实施方 式中，所述反应混合物包含约1.6μΜFIP和BIP、约0.2μΜ的F3和B3 引物和约0.4μΜ浓度的环引物。

LAMP反应混合物中其它试剂浓度如下：约400μΜ dNTP、约1.0M 甜菜碱（Sigma-Aldrich Corp,St Louis,MO）、约20mM Tris-HCl（pH约8.8）、 约10mM KCl、约10mM(NH₄)₂SO₄、约6mM MgSO₄、约0.1%Triton X-100 （聚乙二醇辛基苯基醚）和约50ng（或者对于λDNA约50pg）的模板 DNA。

对于rsfliC LAMP引物组，将GMI1000株纯化的基因组DNA用作阳 性对照，并且对于rk2208.1LAMP引物组，将UW551株的DNA用作阳 性对照。将混合物加热至约95℃约5分钟，然后在加入约8U Bst DNA聚 合酶大片段（New England Biolabs）之前在冰上冷却。在加入聚合酶后， 立即将所述反应在约65℃培育约60分钟，然后通过加热至约80℃终止反 应。

对于用于多路扩增检测的同化探针的实施方式，除其中另有说明外， 使用总体积为25μl的LAMP反应混合物进行LAMP反应。在某些实施方 式中，所述反应混合物包含约1.6μΜFIP和BIP、约0.2μΜF3和B3，和 约0.4μΜ的环F和B。对FAM Se01F探针、FAM Se01B探针和λ噬菌体 F探针中每一种以约0.08μΜ的浓度并且猝灭探针（Quencher probe）01为 约0.4μΜ的浓度，还将同化探针包含在所述反应混合物中。

LAMP反应混合物中其它试剂浓度如下：400μΜ dNTP；1.0M甜菜碱 （Sigma-Aldrich Corp,St Louis,MO）；20mM Tris-HCl（pH8.8）；10mM  KC1、10mM(NH₄)₂SO₄；8mM MgSO₄；0.1%Triton X-100（聚乙二醇辛基 苯基醚）；8U Bst DNA聚合酶大片段（New England Biolabs）和模板DNA （50ng肠沙门氏菌（Salmonella enterica）DNA和/或λDNA为5ng）。

对于LAMP反应的实时监测，将所述反应在65℃培育60分钟并且使 用iQ5实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA）每分 钟测量荧光信号（荧光素：λex/em=500/530，Cy3：λex/em=550/570）。然 后，通过加热至80℃持续10分钟终止反应。对每种样品进行四次反应， 并且对于每组样品在每个反应时间点的荧光值进行平均。

对于通道间荧光数据的比较，将所有荧光值归一化为其中0和1,000 RFU分别对应于对在反应期间在给定通道上荧光值范围最大的平均样品 所观察到的最小和最大荧光值的值。

根据所使用的LAMP引物，加入反应混合物中的模板DNA的量是不 同的。例如，在λ噬菌体引物的情况下，加入约5ng细菌噬菌体λDNA。 在rk1249.1、rk2208和rk2403.1引物的情况下，加入约50g青枯雷尔氏菌 （Ralstonia solanacearum）小种3变种2DNA。在rsfliC引物的情况下， 加入约50g青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）DNA。在Se01引物 的情况下，加入约50ng肠沙门氏菌（Salmonella enterica）DNA。在Spa1 引物的情况下，加入约1.0μl热杀死的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus  aureus）DNA细胞。

c）用于LAMP反应的同化探针的设计。

在用于单一扩增检测的同化探针的实施方式中，设计了同化探针的荧 光链从而在3'端含有rsfliC环B或rk2208.1环F引物，并且在5'端含有与 猝灭探针互补的序列。将荧光分子（例如，荧光素）结合至荧光探针的5' 端，从而当退火（复性，anneal）至同化探针中的猝灭链时，结合至猝灭 链（猝灭剂链）3'端的猝灭剂分子（例如，黑洞猝灭剂-1 （BlackHoleQuecher-1））有效地使荧光猝灭。表1中总结了每种引物和探 针的分子结构/序列。

在用于多路扩增检测的同化探针的实施方式中，设计了同化探针的荧 光链从而在3'端含有Se01环F、Se01环B（loopB）或λ噬菌体环F引物 序列，并且在5'端含有与猝灭探针互补的序列。将荧光素分子结合至Se01 F探针和Se01B探针的5'端，并且将Cy3分子结合至λ噬菌体F探针的 5'端，从而当退火至同化探针中的猝灭链时，结合至猝灭链3'端的猝灭剂 分子（例如，黑洞猝灭剂-1（BlackHoleQuecher-1））有效地使荧光猝灭。 在表2中总结了每种引物和探针的分子结构/序列。

实施例4-用于rsfliC LAMP反应的分子拉链的评价

为了检验用于实时监测LAMP反应的分子拉链的性能，按照先前由 Yi等人所述的规程（Yi,J.Z.,W.D.Zhang,and D.Y.Zhang,"Molecular  Zipper:a fluorescent probe for real-time isothermal DNA amplification," Nucleic Acids Research,34(2006)，将该文献的全部内容作为参考并入）形 成分子拉链。在该实验中使用了rsfliC LAMP引物组，并且设计荧光探针 从而在3'端侧含有rsfliC LAMP环B引物，如表1中所示。将最终浓度为 约0.4μΜ的分子拉链与rsfliC LAMP反应混合物混合，并且将所述混合物 在约65℃培育约120分钟。

使用iQ5实时PCR检测系统观察荧光信号。将R_s株GMI1000的基因 组DNA（50ng）用于阳性样品，并且将双蒸水（ddH₂O）用作阴性对照。 两种处理均重复制备三次，并且将重复实验的数据平均以产生整个给定反 应过程的平均荧光谱（fluorescence profile）（例如，图7）。

如图7所示，在使用分子拉链的两种处理（GMI1000基因组DNA相 对于ddH2O）的荧光谱中未观察到显著差异。此外，在任一个反应过程中 未观察到荧光信号的升高。两种处理均表现出显著高的背景荧光信号，这 是在反应温度下荧光链向分子拉链中显著不完全组装的指示。

实施例5-使用同化探针的rsfliC LAMP反应的实时监测

为了实时监测rsfliC LAMP反应而基本上不损失反应速度，在形成双 链分子拉链结构前将约0.08μΜ荧光探针和约0.16μΜ猝灭探针直接包含 在所述反应混合物中。将反应混合物在约65℃培育约120分钟，并且使用 iQ5实时PCR检测系统观察荧光信号。

图8显示在培育约30分钟后，在存在同化探针前体的情况下出现 rsfliC LAMP反应的荧光信号，这与使用分子信标所说明的rsfliC反应速 度基本一致（实验6）。将同化探针链杂交并将杂交的同化探针加入到 LAMP反应混合物中，这明显干扰了rsfliC LAMP反应，从而导致阳性反 应指示的延缓。然而，通过将荧光和猝灭探针直接加入到rsfliC LAMP反 应混合物中，使用探针的rsfliC LAMP的速度得到彻底改善，从而反映了 不受抑制的rsfliC LAMP反应速度。

由于在约65℃双链DNA探针处于动态平衡条件，因此荧光和猝灭探 针分子是恒定解离和再结合的（reassociating），从而有利于探针与LAMP 扩增子的相互作用。为了抑制这些条件下的背景荧光，猝灭探针的浓度应 高于荧光探针的浓度，从而仅当后者同化到LAMP扩增子中时发生未猝灭 的荧光。

实施例6-荧光和猝灭探针的比率对LAMP反应速度影响的检验

调整分子拉链的荧光和猝灭探针的比率以提供用于监测rsfliC LAMP 反应的同化探针。为了降低荧光探针的背景信号，将荧光探针与猝灭探针 的比率降低至约1:2。对于LAMP反应的监测，将包含约0.08荧光探针和 约0.16μΜ猝灭探针的约0.08μΜ的所得同化探针与rsfliC LAMP反应混合 物混合。为了验证荧光和猝灭探针的序列特异性，将λDNA LAMP引物 组与rsfliC同化探针一起用作实时LAMP的对照。

仅从具有GMI1000基因组DNA的rsfliC LAMP反应混合物中观察到 了与同化探针向LAMP扩增子中的同化有关的荧光信号，而从λDNA LAMP反应中未观察到。该观察表明了rsfliC同化探针的序列特异性。

还进行了琼脂糖凝胶电泳分析以确认各个反应中均存在rsfliC和λ DNA LAMP扩增子。荧光谱（图9）表明可以使用给定浓度的同化探针检 测rsfliC LAMP反应，但仅在约65℃培育约60分钟后。相反，在不存在 同化探针的情况下，在约65℃，rsfliC LAMP反应通常在约60分钟内会 导致产生大量扩增子。这可以通过聚合反应的沉淀焦磷酸镁副产物的累积 和通过用分子信标在各个间隔测试终止反应（参见以下实验7）或凝胶电 泳来观察。该结果表明同化探针的存在可以抑制LAMP反应中环引物的退 火，从而延缓其整体过程。因此，可以在所选的范围内改变同化探针的总 浓度以允许LAMP反应全速进行而仍能够进行实时序列特异性检测。

实施例7-通过分子信标测量rsfliC LAMP引物组的速度。

为了确定rsfliC LAMP反应的真实速度，如表1中所示设计了分子信 标以靶向rsfliC环F和环B区。将约0.4μΜ分子信标加入到rsfliC LAMP 反应中并在约65℃分别培育约0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、60分钟。通过在约80℃培育约10分钟使每个反应终止。在反应终止 后，在约25℃测量具有分子信标的rsfliC LAMP混合物的荧光强度。为了 验证分子信标不会延迟反应，对不具有分子信标并在多个间隔终止的反应 进行琼脂糖凝胶电泳以便确认rsfliC扩增子的存在。

图10显示了相对荧光作为时间的函数的结果。图10的结果显示rsfliC 环F和B区的两种分子信标均能够成功地与它们的rsfliC LAMP扩增子的 靶区杂交。还使用λDNA LAMP反应作为阴性对照确认了两种分子信标 的序列特异性（数据未显示）。分子信标数据还表明来自rsfliC LAMP反 应的可检测量的扩增子的增长是在培育约30分钟内发生的并且在培育约 55分钟发生饱和。

无分子信标的rsfliC反应的琼脂糖凝胶电泳分析还显示从约30分钟起 出现弱条带（模糊条带）（数据未显示），这与含有分子信标的反应中荧光 的发生有关。与实验6的那些结果相比，这些结果支持分子拉链显著降低 rsfliC LAMP反应速度的结论。

实施例8-增加的聚合酶浓度对LAMP反应速度的影响

将rsfliC和R3B2特异性rk2208.1LAMP引物组用于起始LAMP反应， 并且使用具有约0.08μΜ浓度的荧光探针和约0.16μΜ浓度的猝灭探针的 相应同化探针进行实时监测。在形成双链分子拉链结构前，将同化探针直 接包含在所述反应混合物中。为了研究反应速率的动力学限制，使用不同 量（约8U或约16U）的Bst DNA聚合酶进行使用每个引物组的反应。

如图11所示，当使用约8U的Bst DNA聚合酶时，使用rk2208.1引 物组的LAMP反应导致可观察的荧光在约20分钟内增加，并且当使用约 16U时，在约10分钟内增加。不考虑Bst DNA聚合酶浓度，使用rsfliC LAMP引物组的LAMP反应导致可观察的荧光在约30分钟内增加。

该结果表明rk2208.1反应的限速引物退火步骤的正向结合速率常数 显著高于rsfliC反应中相应的速率。这种改善的退火速率是显著足够的， 从而可以在rk2208.1反应中观察到通过提高聚合酶活性的成比例的动力 学增加。通过所述反应中聚合酶浓度的相应提高可以观察到其它增加。

实施例9-具有rk2208.1LAMP的Bst DNA聚合酶浓度对检测速度和 反应动力学的影响的进一步检验

将R3B2特异性rk2208.1LAMP引物组用于起始LAMP反应，并且使 用具有约0.08μΜ浓度的荧光探针和约0.16μΜ浓度的猝灭探针的相应同 化探针进行实时监测。在形成双链分子拉链结构前，将同化探针直接包含 在所述反应混合物中。为了研究反应速率的动力学限制，使用不同量（约 0U、约4U、约8U、约12U、约16U、约20U、约24U、约28U和约32U） 的Bst DNA进行使用每个引物组的反应。

当使用约4U Bst DNA聚合酶时，使用rk2208.1引物组的LAMP反应 导致可观察的荧光在约30分钟内增加（图12）。在聚合酶浓度升高至约 8U的情况下，在更短的时间（约20分钟后）观察到了荧光。将聚合酶浓 度提高至大于约15U（例如，约15U、约20U、约24U、约28U和约32U） 导致在约10至15分钟内产生可观察的荧光。

提高Bst DNA聚合酶浓度还提供达到最大速度的时间的增加。图13 显示了与达到每分钟最大荧光增加速度的时间的关系。随着Bst DNA聚合 酶浓度从约4U提高至约32U，达到最大速度的时间从约40分钟减少至约 15分钟。

实施例10-对于无环引物的rk2208.1LAMP引物组的同化探针组成的 检验

将无环引物的rk2208.1LAMP引物组用于确定荧光探针和猝灭探针 的量对检测来自LAMP反应混合物的荧光的时间的影响。在无环引物的情 况下在LAMP反应中使用分别与约0.16μΜ、约0.8μΜ和约1.6μΜ浓度的 猝灭探针混合的约0.08μΜ、约0.4μΜ和约0.8μΜ浓度的荧光探针进行反 应。图14中显示了这些测试的结果。圆圈表示低探针浓度（约0.08μΜ荧 光探针和约0.16μΜ猝灭探针），三角形为中等探针浓度（约0.4μΜ荧光 探针和约0.8μΜ猝灭探针），而方形是高等探针浓度（约0.8μΜ荧光探针 和约1.6μΜ猝灭探针）。实心符号是包含模板DNA的反应，而空心符号 是阴性对照（ddH₂O）。

如图14所示，通常反应混合物中大量同化探针的存在会导致可观察 荧光增加发生的更长的延缓。该结果确认更高浓度的同化探针可以干扰 rk2208.1LAMP反应的速度。该实验还表明甚至在不存在环引物的情况下 可以将同化探针掺入到LAMP扩增子中。这些结果还表明除了环引物的退 火和延伸之外，通过同化探针的反应抑制影响LAMP过程中的步骤。

实施例11-对于具有环引物的rk2208.1LAMP引物组的同化探针组成 的检验

为了确定同化探针的组成对包含环引物的LAMP反应的影响，在将环 引物包含在所述反应中以后重复实验10。图15中显示了实验结果，其中 圆圈表示低探针浓度（约0.08μΜ荧光探针和约0.16μΜ猝灭探针），三角 形为中等探针浓度（约0.4μΜ荧光探针和约0.8μΜ猝灭探针），而方形是 高等探针浓度（约0.8μΜ荧光探针和约1.6μΜ猝灭探针）。实心符号是包 含模板DNA的反应，而空心符号是阴性对照（ddH₂O）。

如图15所示，以所测试的最低浓度（约0.08μΜ荧光探针和约0.16μΜ 猝灭探针），用于rk2208.1的同化探针导致在约20分钟后产生荧光信号。 中等浓度（约0.4μΜ荧光探针和约0.8μΜ猝灭探针）导致在约70分钟后 产生增加的荧光。包含最高同化探针浓度（约0.8μΜ荧光探针和约1.6μΜ 猝灭剂链）的反应在约120分钟反应期间的任意点均不会产生增加的荧光。 该结果确认更高浓度的同化探针干扰了rk2208.1LAMP反应的速度，并且 rk2208.1环F引物的存在提高了反应速度。

实施例12-插入染料（EvaGreen）对LAMP反应和速度的影响的评 价

为了评价插入染料（EvaGreen）对LAMP反应的影响，将EvaGreen 加入到rk2208.1LAMP反应混合物（具有和不具有rk2208.1环F引物）中 并且通过测量荧光信号观察反应。将在这些条件下发生荧光增加的时间与 具有最佳同化探针组成的rk2208.1LAMP反应的速度相比较。图16中显 示了该实验的结果。

具有EvaGreen的rk2208.1LAMP反应（具有和不具有rk2208.1环F 引物）显示了分别培育约30和约80分钟后的荧光信号。具有同化探针的 rk2208.1LAMP反应显示了约20分钟内的反应。这些结果表明插入染料 显著抑制rk2208.1LAMP反应。EvaGreen可能会干扰Bst DNA聚合酶的 效率，这是因为这种酶具有链置换活性并且插入染料使双链DNA稳定。

实施例13-用于肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和细菌噬菌体λ基 因组DNA的同时LAMP基检测的同化探针性能的检验

图17是相对荧光相对于扩增肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和细 菌噬菌体λ基因组DNA的LAMP反应的时间的图。在荧光素通道 （λex/em=500/530-Se01F探针标记）和在cy3通道（λex/em=550/570-λ噬 菌体F探针标记）上测量荧光值。用实心圆圈表示含有肠沙门 氏菌（Salmonella enterica）和细菌噬菌体λ基因组DNA的样品，用空心 圆圈表示无模板DNA的阴性对照，用实心三角形表 示仅具有肠沙门氏菌（Salmonella enterica）基因组DNA的样品，并且用 实心菱形表示仅具有细菌噬菌体λ基因组DNA的那些。

图18是相对荧光相对于扩增肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和/或 细菌噬菌体λ基因组DNA的LAMP反应的时间的图。在使用同化探针的 多路检测期间在荧光素通道（λex/em=500/530-Se01F的探针标记）上测量 了荧光值。用实心圆圈表示具有肠沙门氏菌（Salmonella enterica） 和细菌噬菌体λ基因组DNA两者的样品，用空心圆圈表示具有ddH2O 的阴性对照，用实心三角形表示仅具有肠沙门氏菌（Salmonella  enterica）基因组DNA的样品，并且用实心菱形表示仅具有细菌噬 菌体λ基因组DNA的那些。

图19是相对荧光相对于扩增肠沙门氏菌（Salmonella enterica）和/或 细菌噬菌体λ基因组DNA的LAMP反应的时间的图。在使用同化探针的 多路检测期间在cy3通道（λex/em=550/570-λ噬菌体F的探针标记）上测 量了荧光值。用实心圆圈表示具有肠沙门氏菌（Salmonella enterica） 和细菌噬菌体λ基因组DNA两者的样品，用空心圆圈表示具有ddH2O 的阴性对照，用实心三角形表示仅具有肠沙门氏菌（Salmonella  enterica）基因组DNA的样品，并且用实心菱形表示仅具有细菌噬 菌体λ基因组DNA的样品。

值得注意地，在图17、18和19的每个实施例中，通过使用对于单个 病原体具有光谱学唯一的荧光团的唯一序列特异性同化探针，可以同时特 异地检测不同的病原体。

总之，公开了几种有力的新型技术的实施方式，其单独或以任意组合 可以使得能够对密切相关的细菌性病原体亚群进行更快速地分类，所述细 菌性病原体尽管表现出非常类似的抗原决定簇，但在宿主特异性、毒性或 对疾病传播重要的其它生物学特性方面可以是显著不同的。可以容易地将 基于基因的技术转移至给定序列数据以区别所关心的各种种群。通过对 DNA复制使用等温方法，检测的灵敏度和选择性得到改善，甚至是在相 对大的样品体积中，并且不会增加费用、复杂性和热循环设备的能量需要。

在修正了通过反应孔的传输损失和环境热辐射的反射后，使用与标准 数字媒介规格类似的激光以及非接触温度测量在光盘媒介上对LAMP反 应的过程温度控制的能力得到证明。

还证明了使用光学探针实时观察LAMP复制进展的能力。已鉴别了影 响分子探针杂交条件并且可以导致检测速度和灵敏度改善的参数。这些参 数可以包括猝灭剂与荧光探针的比率、混合所述链以产生同化探针的方 式、聚合酶浓度和LAMP反应混合物中同化探针的总量。

具有基于CD的系统的定制荧光计的性能表明可以在CD媒介上实时 监测反应，并且实验证明这是确定进行的。这种非接触控制和具有离心基 测序的样品捕获、清洗、裂解和DNA提取的检测系统的整合可以导致产 生快速、用户友好的系统以允许在野外和在动植物检疫情况对病原体进行 检测。

尽管上述说明已显示、描述并指出了本发明教导内容的基本新颖性特 征，但是应理解在不背离本发明教导内容的范围的情况下，本领域技术人 员可以对所说明设备细节的形式及其使用做出各种删除、替换、改变和/ 或添加。因此，本发明教导内容的范围不应受限于上述讨论，而应通过所 附权利要求定义。