草莓主要抗药性病害的环介导等温扩增(LAMP)检测

摘要

[目的]　　主要由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病和由灰葡萄孢菌（Boteytis cinerea）引起的灰霉病是草莓生产上两大主要病害。化学防治是草莓生产上防治炭疽病、灰霉病两大病害的主要手段，病原菌群体对药剂的敏感性是决定防治效果的主要因素之一。传统的抗药性检测方法是将病原菌分离纯化后，转接在含药培养皿上，根据药剂对病原菌的生长抑制作用来鉴定是否为抗药性菌株，该方法工作量大，耗时长；本研究为了实现抗药性快速检测的目的，建立环介导等温扩增检测（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），在1~2h内得到可靠的抗药性检测结果，能快速检测和监测病原菌的抗药性发展，从而合理指导用药。　　[方法]　　针对灰霉病，本研究通过错配碱基引物特异性鉴定抗药性菌株、优化反应组分和条件，从而建立抗药性LAMP快速检测体系。最后应用LAMP检测技术检测田间样品，同时将样品带回实验室分离培养，利用传统区分剂量法检测抗药性，结果和LAMP检测相比较，验证LAMP检测结果。针对炭疽病，本研究建立LAMP快速检测技术用于草莓苗期炭疽病的检测；随后，测定了草莓炭疽病菌的抗药性，分析其抗性分子机制，建立了草莓炭疽病菌抗药性LAMP检测方法。　　[结果]　　1.开发了一种环介导的等温扩增（LAMP）检测体系，设计错配引物，能快速检测灰葡萄孢菌β-tubulin基因上E198A突变基因型（对苯并咪唑类杀菌剂高抗）；灰霉病菌E198A基因型LAMP检测的最佳反应条件为64℃，60 min；本研究中LAMP灵敏度是常规PCR的10倍。和区分剂量法的检测结果比较表明LAMP检测田间抗性菌株可达到100%的准确性。　　2.建立了LAMP快速检测体系，用于田间灰葡萄孢菌对甲氧基丙稀酸酯（QoIs）类杀菌剂的抗性监测和抗性发展风险评估，其中包含两个LAMP检测，其一能准确检测到灰霉病菌对QoI类杀菌剂具有高度抗性的G143A突变体；其二能检测出灰葡萄孢中cytb基因上BCbi143/144内含子。LAMP检测的最佳反应条件为61℃，50 min，使用ALL-DNA-Fast-Out在10 min内对田间样品进行核提取前处理，以实现一步法快速检测。总之，本研究建立了一个快速灵敏的LAMP测定系统，用于灰霉病菌对QoIs杀菌剂抗性风险评估和监测田间抗药性。　　3.开发了一种直接用于草莓苗期炭疽病检测的LAMP体系，利用LFD（横向侧流试纸）及碱性聚乙二醇浸提等方法，快速进行田间样品前处理，实现田间病害快速检测。　　4.分别建立了LAMP快速检测方法，用于特异性检测胶孢炭疽菌对QoIs类杀菌剂高抗G143A突变基因型和对苯并咪唑类高抗E198A的突变体，检测结果和区分剂量法一致。　　[结论]　　本文研究结果初步实现了田间快速检测草莓主要抗药性病害的目的，对草莓生产上调整用药策略，提高药剂防治效果、减少药剂的使用量具有较大的现实意义。

目录

声明

1文献综述

1.1 草莓主要病害概述

1.2 草莓灰霉病及其抗药性

1.3 草莓炭疽病及其抗药性

1.4 植物病原菌抗药性检测技术

1.5 环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）检测技术

1.6 研究目的和意义

2检测草莓灰霉病菌抗苯并咪唑类杀菌剂E198A基因型的LAMP体系的建立与应用

2.1 材料方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

3快速检测和评估草莓灰霉病菌对QoI类杀菌剂的抗性发展

3.1 材料方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

4 草莓苗期炭疽病LAMP检测的建立和应用

4.1材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

5草莓炭疽病菌抗QoIs类和苯并咪唑类杀菌剂的LAMP检测技术

5.1材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

6全文总结

参考文献

附录

个人简介

致谢