利用防腐剂提高农杆菌介导的小麦转化存活率的方法

摘要

本发明公开了一种新的纵切幼苗叶基座转化小麦的方法，在运用纵切幼苗叶基座进行农杆菌转化时，在共培养基质中添加防腐剂，从而遏制霉菌的生长，提高了转化植株的存活率。

说明书

技术领域

本发明属于小麦转基因领域，涉及利用防腐剂提高农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦存活效率，进而提高转化效率的方法。

背景技术

小麦是总产量居第二位的重要粮食作物，世界各地广泛种植。随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，对小麦的需求量越来越大，对小麦品质的要求也越来越高，常规育种已不能满足人们对小麦品种和品质的要求。转基因技术的发展打破了常规育种的种族限制，许多作物诸如玉米、油菜等利用转基因技术已经成功培育出了优质、高效的转基因新品种。与其他作物相比，小麦的转基因育种相对滞后，转化成功的例子较少，一方面，由于小麦组织培养植株的再生频率低，建立稳定高效的再生体系比较困难；另一方面，小麦是多倍体作物，基因组大，遗传背景复杂，遗传转化体系不完善。目前，小麦转基因的方法主要有基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法以及花粉管通道法。

基因枪法是小麦转基因育种的主要方法，在获得的小麦转基因植株的报道中，基因枪法占了绝大多数，这主要由于该方法不受作物基因型的限制、方法相对简单，目前基因枪介导的小麦转化体系已经比较完善。但是基因枪法成本花费高、周期长，不利于转基因小麦的产业化。PEG法主要是以原生质体为受体的转化方法，由于小麦的原生质体再生困难，限制了该方法的使用。花粉管通道法是利用植物授粉后花粉萌发形成的花粉管，将外源DNA导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中。该方法具有操作简单、耗费低廉、不需要经过繁琐的组织培养过程等优点，但是目前该方法尚不成熟，DNA的导入时间和部位往往会影响植株的结实率，最终很难得到转基因后代。由于小麦不是农杆菌的天然宿主、谷类作物对农杆菌没有伤感反应等原因，农杆菌介导的小麦转化一直是摆在分子生物学家和育种家面前的一道难题。后来人们虽然实现了农杆菌介导的小麦转化，但是受到基因型、组织培养条件、外植体类型、农杆菌菌株等限制，目前农杆菌介导的小麦转化效率低，需要通过组织培养和植株再生阶段，周期比较长，不利于产业化的发展。农杆菌介导的活体转化方法不需要经过复杂的组织培养和植株再生阶段，不仅具有农杆菌介导转化的通用优点，而且具有很高的实际操作性。

但是在运用纵切小麦幼苗叶基座进行农杆菌转化时，共培养过程中霉菌的大量生长导致小麦转化苗绝大部分死亡，此种现象很普遍，这样严重影响了转化效率。因此，本发明在进行农杆菌介导的小麦纵切幼苗叶基座转化时，在共培养基质中添加防腐剂遏制了霉菌的生长，提高转化植株存活率，由41%-47%提高至91%-94%，具有很高的实际操作性和市场推广价值。

发明内容

本发明旨在提供一种新的纵切幼苗叶基座转化小麦的方法，包括以下步骤：

（1）挑选合适的小麦种子，剔除瘪小的，用自来水清洗，吸水饱和，发芽的幼苗作为转化供体；

（2）将含有目的基因的农杆菌YEB平板培养基划线活化，挑单菌落摇菌，取适量菌液涂板，玻璃涂棒刮下农杆菌用加入了As（200μM）； KT（0.2mg/L）； 2,4-D（1mg/L）；DTT（2mM ）；SIlwet-L77（200μl/L）的基本液体培养基悬浮，使悬浮菌液的OD₆₀₀值约为1，pH至5.5，所得液体为转化液；

（3）转化液侵染小麦幼苗叶基座；

(4)共培养基质的制备：

A、每升蛭石中事先添加丙酸钙1.5-3g；

B、加入了As（200μM）、 KT（0.2mg/L）、 2,4-D（1mg/L）、DTT（2mM ）、SIlwet-L77（200μl/L）的基本液体培养基中再加入防腐剂苯甲酸钠0.1-1g/L、山梨酸钾1.0-5.0 g/L、尼泊金酯0.01-1.0g/L；

C、将A和B混匀至湿度为70-80%，混匀后的基质即为共培养基质。

（5）转化结束后将幼苗埋入共培养基质中进行共培养，然后定植到大棚中培养。 

含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于：pKT系列载体、pWM系列载体、pBn系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于：AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404等。

本发明中所述的小麦为栽培或野生小麦品种、品系、育种材料或中间材料。

本发明在农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦的过程中在共培养阶段添加防腐剂后提高了转化小麦的存活效率，存活效率由41%-47%提高到了91%-94%，同时，所述防腐剂本身价格低廉，用量小成本低，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。

为了便于理解，下面将结合附图和实施例进一步诠释本发明。具体实施例和附图仅是为了更好的阐述本发明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为小麦共培养基质中添加防腐剂，幼苗正常生长示意图，存活率极高。

图2为小麦共培养基质中未添加防腐剂，植株停止生长，长出霉菌，存活率极低，绝大多数的转化幼苗板结在一起。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell, David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3^rdedition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。

实施例一

1. 实验材料

质粒：含有抗百草枯基因，带有抗生素筛选标记基因的pV1载体，具有百草枯抗性。PCR扩增该基因连接到pcambia1300（购自Invitrogen公司）载体上得到pV1载体。

农杆菌菌株：AGL0 

供转化的小麦品种：京麦9158

2. 农杆菌的培养

挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB平板培养基上画线，28℃黑暗培养箱培养2天。挑取单菌落接种于40ml 抗性YEB液体培养基中，28℃黑暗摇床200rpm摇过夜，至OD₆₀₀≈1。吸取上述菌液400μl涂布于平板直径为15cm 的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养箱培养2天后备用，不要继续存留于28℃黑暗培养箱或转存于4℃冰箱。

3. 转化液的制备

首先按照下述配方配制基本液体培养基。

基本液体培养基配制(1L)：

MgSO₄              0.12209g

KCl            2.95g

NaH₂PO₄·2H₂O   0.15g

肌醇           1.00g

谷氨酸       0.876g

天门冬氨酸   0.266g

精氨酸       0.174g

酪蛋白水解物   0.3g

蔗糖            20g

铁盐溶液        5ml   ①EDTA-2Na 7.46g/L 调pH=8.0

②再加4.5ml/L 5M NaCl

③FeSO₄·7H₂O  5.56g/L

CaCl₂溶液          4.5ml       25.06g/L

VB₁溶液                10ml           1g/L

VB₆溶液                  1ml           1g/L

烟酸溶液        1ml         0.1g/L

B₅微量          1ml          MnSO₄·H₂O      7.58g/L

                             ZnSO₄·7H₂O      2.0g/L

                             H₃BO₃                        3.0g/L

                             KI             0.75g/L

                             Na₂MoO₄·2H₂O   0.25g/L

                             CuSO₄·5H₂O    0.025g/L

                             CoCl₂·6H₂O    0.025g/L

在1L 基本液体培养基中添加下列成分：As（200μM ）； KT（0.2mg）； 2,4-D（1mg）；DTT（2mM ）；SIlwet-L77（200μl）， 将刮下农杆菌用加入了上述成分的基本液体培养基悬浮，使悬浮菌液的OD₆₀₀值约为1，pH至5.5，所得菌液为转化液。

 4. 幼苗选择准备

自来水清洗小麦种子后，浸泡使之吸收自来水饱和发苗，25 ℃，14小时光照10小时黑暗，每天早晚各冲洗一次，幼苗至胚轴长至1cm，可用于转化。

5. 转化液浸染小麦幼苗叶基座

（1）用手术刀的刀尖蘸取转化液插入叶基座的中央部位转化，刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤口长度为1mm，不要穿透叶基座，使小麦幼苗是完整的；

   （2）将致伤的小麦幼苗浸没在转化液中，28℃，24小时黑暗条件，150rpm培养20min。

6. 共培养基质的制备：

A、每升蛭石中事先添加丙酸钙1.5g；

B、加入了As（200μM）、 KT（0.2mg/L）、 2,4-D（1mg/L）、DTT（2mM ）、SIlwet-L77（200μl/L）的基本液体培养基中再加入防腐剂苯甲酸钠0.1g/L、山梨酸钾1.0g/L、尼泊金酯0.01g/L；

C、将A和B混匀至湿度为70-80%，混匀后的基质即为共培养基质。

      7．将转化后的小麦幼苗自然荫干后埋入共培养基质中，25℃，24小时黑暗条件下培养3d，然后定植到大棚中培养，通过此法使存活率由未添加防腐剂时的47%提高至91%。

实施例二

1. 实验材料

质粒：含有抗百草枯基因，带有抗生素筛选标记基因的pV1载体。PCR扩增该基因连接到pcambia1300（购自Invitrogen公司）载体上得到pV1载体。

农杆菌菌株：AGL0 

供转化的小麦品种：京麦9158

2. 农杆菌的培养

挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB平板培养基上画线，28℃黑暗培养箱培养2天。挑取单菌落接种于40ml 抗性YEB液体培养基中，28℃黑暗摇床200rpm摇过夜，至OD₆₀₀≈1。吸取上述菌液400μl涂布于平板直径为15cm 的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养箱培养2天后备用，不要继续存留于28℃黑暗培养箱或转存于4℃冰箱。

3. 转化液的制备

首先按照下述配方配制基本液体培养基。

基本液体培养基配制(1L)：

MgSO₄              0.12209g

KCl            2.95g

NaH₂PO₄·2H₂O   0.15g

肌醇           1.00g

谷氨酸       0.876g

天门冬氨酸   0.266g

精氨酸       0.174g

酪蛋白水解物   0.3g

蔗糖            20g

铁盐溶液        5ml   ①EDTA-2Na 7.46g/L 调pH=8.0

②再加4.5ml/L 5M NaCl

③FeSO₄·7H₂O  5.56g/L

CaCl₂溶液          4.5ml       25.06g/L

VB₁溶液                10ml           1g/L

VB₆溶液                  1ml           1g/L

烟酸溶液        1ml         0.1g/L

B₅微量          1ml          MnSO₄·H₂O      7.58g/L

                             ZnSO₄·7H₂O      2.0g/L

                             H₃BO₃                        3.0g/L

                             KI             0.75g/L

                             Na₂MoO₄·2H₂O   0.25g/L

                             CuSO₄·5H₂O    0.025g/L

                             CoCl₂·6H₂O    0.025g/L

在1L 基本液体培养基中添加下列成分：

As（200μM ）； KT（0.2mg）； 2,4-D（1mg）；DTT（2mM ）；SIlwet-L77（200μl），将刮下农杆菌用加入了上述成分的基本液体培养基悬浮，使悬浮菌液的OD₆₀₀值约为1，pH至5.5，所得菌液为转化液。

4. 幼苗选择准备

自来水清洗小麦种子后，浸泡使之吸收自来水饱和发苗，25 ℃，14小时光照10小时黑暗，每天早晚各冲洗一次，幼苗至胚轴长至1cm，可用于转化。

5. 转化液浸染小麦幼苗叶基座

（1）用手术刀的刀尖蘸取转化液插入叶基座的中央部位转化，刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤口长度为1mm，不要穿透叶基座，使小麦幼苗是完整的；

    （2）将致伤的小麦幼苗浸没在转化液中，28℃，24小时黑暗条件，150rpm培养20min。

6.共培养基质的制备：

A、每升蛭石中事先添加丙酸钙3g；

B、加入了As（200μM）、 KT（0.2mg/L）、 2,4-D（1mg/L）、DTT（2mM ）、SIlwet-L77（200μl/L）的基本液体培养基中再加入防腐剂苯甲酸钠1g/L、山梨酸钾5.0 g/L、尼泊金酯1.0g/L；

C、将A和B混匀至湿度为70-80%，混匀后的基质即为共培养基质。

7．将转化后的小麦幼苗自然荫干后埋入共培养基质中，25℃，24小时黑暗条件下培养3d，然后定植到大棚中培养，通过此法使存活率由未添加防腐剂时的46%提高至93%。

实施例三

1. 实验材料

质粒：含有抗百草枯基因，带有抗生素筛选标记基因的pV1载体。PCR扩增该基因连接到pcambia1300（购自Invitrogen公司）载体上得到pV1载体。

农杆菌菌株：AGL0 

供转化的小麦品种：京麦9158

2. 农杆菌的培养

挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB平板培养基上画线，28℃黑暗培养箱培养2天。挑取单菌落接种于40ml 抗性YEB液体培养基中，28℃黑暗摇床200rpm摇过夜，至OD₆₀₀≈1。吸取上述菌液400μl涂布于平板直径为15cm 的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养箱培养2天后备用，不要继续存留于28℃黑暗培养箱或转存于4℃冰箱。

3. 转化液的制备

首先按照下述配方配制基本液体培养基。

基本液体培养基配制(1L)：

MgSO₄              0.12209g

KCl            2.95g

NaH₂PO₄·2H₂O   0.15g

肌醇           1.00g

谷氨酸       0.876g

天门冬氨酸   0.266g

精氨酸       0.174g

酪蛋白水解物   0.3g

蔗糖            20g

铁盐溶液        5ml   ①EDTA-2Na 7.46g/L 调pH=8.0

②再加4.5ml/L 5M NaCl

③FeSO₄·7H₂O  5.56g/L

CaCl₂溶液          4.5ml       25.06g/L

VB₁溶液                10ml           1g/L

VB₆溶液                  1ml           1g/L

烟酸溶液        1ml         0.1g/L

B₅微量          1ml          MnSO₄·H₂O      7.58g/L

                             ZnSO₄·7H₂O      2.0g/L

                             H₃BO₃                        3.0g/L

                             KI             0.75g/L

                             Na₂MoO₄·2H₂O   0.25g/L

                             CuSO₄·5H₂O    0.025g/L

                             CoCl₂·6H₂O    0.025g/L

在1L基本液体培养基中添加下列成分：：As（200μM ）； KT（0.2mg）； 2,4-D（1mg）；DTT（2mM ）；SIlwet-L77（200μl），  将刮下农杆菌用加入了上述成分的基本液体培养基悬浮，使悬浮菌液的OD₆₀₀值约为1，pH至5.5，所得菌液即为转化液。

4. 幼苗选择准备

自来水清洗小麦种子后，浸泡使之吸收自来水饱和发苗，25 ℃，14小时光照10小时黑暗，每天早晚各冲洗一次，幼苗至胚轴长至1cm，可用于转化。

5. 转化液浸染小麦幼苗叶基座

（1）用手术刀的刀尖蘸取转化液插入叶基座的中央部位转化，刀刃向基部方向轻轻斜拉出，纵切伤口长度为1mm，不要穿透叶基座，使小麦幼苗是完整的；

   （2）将致伤的小麦幼苗浸没在转化液中，28℃，24小时黑暗条件，150rpm培养20min。

6.共培养基质的制备：

A、每升蛭石中事先添加丙酸钙2.0g；

B、加入了As（200μM）、 KT（0.2mg/L）、 2,4-D（1mg/L）、DTT（2mM ）、SIlwet-L77（200μl/L）的基本液体培养基中再加入防腐剂苯甲酸钠0.7g/L、山梨酸钾3.0 g/L、尼泊金酯0.6g/L；

C、将A和B混匀至湿度为70-80%，混匀后的基质即为共培养基质。

7. 将转化后的小麦幼苗自然荫干后埋入共培养基质中，25℃，24小时黑暗条件下培养3d，然后定植到大棚中培养。通过此法使存活率由未添加防腐剂时的41%提高至94%。