一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法

摘要

本发明涉及一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，利用机械法分离人皮肤干细胞，体外培养人皮肤干细胞，利用人皮肤干细胞体外形成拟胚体的方法进行分化，分化后用骨形态发生蛋白-4、干细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子体外诱导14天，可获得一些能够表达早期生殖细胞基因的原始生殖细胞样细胞；之后采用猪的卵泡液进行诱导。本发明方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达原始生殖细胞样细胞，细胞荧光分析体外诱导得到的原始生殖细胞样细胞表达Stra8和Dazl，能够达到早期减数分裂。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种人皮肤干细胞（human Skin Stem Cell简称hSSC）体外向原始生殖细胞 样细胞（Primordial germ cell-like cells简称PLCs）分化的技术方法，属于生殖医学的 生物医学技术领域。

背景技术：

从2003年开始，多个实验组报导了他们将哺乳类干细胞，包括人类干细胞，诱导为各发 育阶段的生殖细胞。在以雄性配子为目标的报导中，2003年Toyooka等首先以Vasa基因为 PGC报告系统(reporter system)，及BMP4为诱导因子，将小鼠干细胞诱导为PGCs（原始生 殖细胞primordial germ cells）；并接着将分离出来的PGCs与睾丸细胞混合后移植到睾丸 中产生精子。2004年，Geijsen等利用SSEA1为早期生殖细胞表面标记，加上RA(retinoic  acids)诱导小鼠干细胞，成功在体外获得单倍体，并将其注射入小鼠卵子中，受精卵发育至 囊胚期。德国研究小组Nayernia等同样利用RA诱导小鼠干细胞，並以Stra8及Prm1为报告 系统，获得的类精细胞在注射入卵子后能获得后代。此外，Nayernia等人也用小鼠骨髓干细 胞在体外转分化出了原始生殖细胞以及精原细胞样的细胞。一直到2009年末，纪家葵等在高 表达DAZL家族基因后，发现雄性人类胚胎干细胞能被诱导进入减数分裂，并形成单倍体。2011 年日本Hayashi等利用小鼠胚胎干细胞体外培养获得EpiLCs并加上BMP4、LIF、SCF等诱导 因子，分离出PLCs，之后移植到睾丸，获得成熟精子并生产了健康的小鼠后代。

综合最近研究进展，大都采用胚胎干细胞（ESC）作为原材料，但是ESC处在哺乳动物个 体发育的早期，而且取材困难，因此采用成体干细胞代替ESC向生殖细胞分化可以更好的解 决这一问题。人皮肤干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的多能成体干细胞。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分 化的技术方法。

为了实现上述发明目的，本发明方法利用机械法分离人皮肤干细胞（hSSC），体外培养人 皮肤干细胞，利用hSSC体外形成拟胚体（Embryoid Body简称EB）的方法进行分化，分化后 用BMP-4、SCF、EGF、bFGF等细胞因子体外诱导14天，可获得一些能够表达早期生殖细胞基 因的PLCs，之后采用猪的卵泡液进行诱导。

本发明方法按照如下步骤操作：第一步，人皮肤的分离：将人的皮肤取下，转移至磷酸 盐缓冲液（PBS）+10%胎牛血清（FBS）的操作液中，在操作液中洗3次，去掉与皮肤连接

在一起的血凝块和脂肪；在新鲜DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Medium，F-12 Nutrient Mixture）中将分离干净的皮肤洗3次；

第二步，皮肤干细胞的体外培养：皮肤经DMEM/F12洗完后，用剪刀剪碎，再经DMEM/F12 洗3遍；然后置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA（TE），37℃消化，轻轻吹打混匀后加入10%血 清终止消化，DMEM/F12中洗3遍，最后用移液枪吹打，直至组织能够自由进入枪头，将吹 打好的组织过筛到皮肤干细胞培养液培养；所述皮肤干细胞培养液包含：DMEM/F12、2%B-27、 20ng/ml表皮生长因子（EGF）、40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、1%青链霉素， 以培养当天为零代，每4天传代一次；

第三步，皮肤干细胞体外形成拟胚体（EB）：当皮肤干细胞培养到第二代3-4天时（即 培养的11-12天），离心收集细胞，弃上清，加入0.25%Trypsin室温消化，然后轻轻吹打 至单细胞，终止消化，M199（Medium199）洗两遍后转入SARSTEDT悬浮培养24孔板，置 于EB培养基中培养，EB培养液包括：M199（Medium199）(pH7.0)、3mg/ml牛血清蛋白（BSA）、 1mg/ml胎球蛋白、5ul/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS)、0.23mM丙酮酸钠、1ng/ml表皮 生长因子（EGF）、20ng/ml激活素A（Activin A）和30ng/ml的骨形态发生蛋白-4（BMP-4）；

第四步，EB培养3-4天后开始向原始生殖细胞（Primordial germ cell）分化：用0.25% Trypsin消化EB，室温消化过程中用移液枪吹打至单细胞，用血清终止消化，收集细胞， 离心；弃上清，加入少量PGC培养液悬浮细胞；之后接种到24孔板中，每个孔接种细胞密 度为5×10⁴；将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO₂中培养14天，培养液包括：DMEM高糖、 10%胎牛血清（FBS）、0.23mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ- 巯基乙醇、20ng/ml表皮生长因子（EGF）、40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、40ng/ml 干细胞生长因子（SCF）、1uM RA（视磺酸）和30ng/ml骨形态发生蛋白-4（BMP-4）；

第五步，猪卵泡液继续培养：

之后将24孔板的细胞消化下来，接种到事先用多聚赖氨酸处理过的培养皿里，每个培 养皿的接种密度为1×10⁴，换成猪卵泡培养液进行培养；猪卵泡培养液包括：DMEM高糖、 5%猪卵泡液、5%胎牛血清（FBS）、0.23mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰 胺和0.1mMβ-巯基乙醇。

细胞荧光分析这种体外诱导得到的PLCs表达Stra8（stimulate by retinoic acid）和Dazl （Deleted in Azoospermia-Like），进而表明这些体外诱导的PLCs能够达到早期减数分裂。

附图说明：

图1为β-Integrin在皮肤中的定位图；

图2为人皮肤干细胞体外培养不同时期显微图；

图3为多能性基因OCT-4、SSEA-1、β-Integrin的细胞荧光；

图4为体外EB诱导的显微图；

图5为EB第3天消化后早期生殖细胞Vasa和Stella的细胞荧光；

图6为体外PLCs诱导不同时期的显微图；

图7为体外PLCs诱导14天早期生殖细胞特异基因的细胞荧光；

图8为猪卵液培养不同天数的显微图；

图9为猪卵泡液诱导后减数分裂相关基因的细胞荧光。

具体实施方式：

下面通过附图和具体实施例对本发明方法做进一步阐述。

实施例1、

第一步，人皮肤的分离：

将人的皮肤取下，转移至磷酸盐缓冲液（PBS）+10%胎牛血清（FBS）的操作液中， 在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与皮肤连接在一起的血凝块和脂肪；在新鲜 DMEM/F12（Hyclone公司）中将分离干净的皮肤洗3次；

人皮肤免疫组织化学：取出已经切好的石蜡切片即白片，将白片放入60度烘箱2小时， 经两次二甲苯每步15min将切片上的石蜡脱净，脱蜡后经无水酒精及各级酒精下行至水： 100%酒精5min→95%酒精5min→90%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min→50%酒精 5min→PBS（磷酸盐缓冲液）10min，将复水的切片放入柠檬酸抗原修复液中，96度10min。 应先将抗原修复液加热至96度之后，再将片子放入，放入后开始计时。之后将不锈钢杯子 直接从水浴锅中取出，在室温下冷却至室温，修复液冷却至室温后，将片子取出后，放在 水平湿盒内，用铅笔在组织切片的区域做好标记，之后将片子放入预暖的Ttis缓冲液（Tris  Buffer Solution简称TBS）中洗5min，再转入预暖的0.1%Tween-20的Ttis缓冲液（简 称TBST）中洗5min，加上30mg牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin简称BSA）和100ul 山羊血清或驴血清溶于900ul TBS（简称BDT）封闭，大约的量为50ul。之后加封口膜封在 切片区域，室温放置30min，将封口膜揭掉，将片子上多余的封闭液倒在吸水纸上。加适量 一抗（Abcam公司）于切片位置，用擦净的盖玻片封一抗，将玻片放入湿盒内，用封口袋 封住，4度冰箱过夜孵育，或者37度1小时，一抗孵育结束后，取出片子，置于封口袋中 37度复温30min。用镊子揭掉封口膜，将片子泡入预暖的TBST中洗三次，分别为10min， 20min，20min。将片子上的TBST倒在吸水纸上，加上BDT按1：50稀释二抗（碧云天公 司），用封口膜封住二抗后，放入湿盒内，用封口袋封住，37度孵育30min。孵育结束后， 将片子取出，揭掉封口膜，预暖的TBST洗三次，分别为10min，20min，20min。将片子上 多余的TBST倒在吸水纸上，滴加适量的Hoechst33342（碧云天公司），一般为10ul，在 切片位置添加封口膜，常温孵育3min-5min，将封口膜揭掉，放入PBS中，涮洗4次，每次 不超过1秒。将多余的PBS倒在吸水纸上。加Vectashield（VECTOR公司）封片，加的量 视片子上组织的面积而定，一般情况下加5-10ul即可。做好的切片置于干盒中，套上封口 袋防止切片凝水，4度保存，镜检观察。图1中1-6为β-Integrin在皮肤中的定位图。

第二步，皮肤干细胞的体外培养：

皮肤经DMEM/F12（Hyclone公司）洗完3遍后，用剪刀将皮肤减碎，DMEM/F12再洗三 遍，弃掉上清加1ml的0.25%Trypsin-0.04%EDTA（Hyclone公司），37℃消化20-30分钟， 轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，DMEM/F12（Hyclone公司）中洗3遍，用1ml的移 液枪机械性吹打，直至组织能够自由进入枪头，将吹打好的组织过筛到皮肤干细胞培养液 培养（图2为不同时期皮肤干细胞培养显微图）；皮肤干细胞培养液包含DMEM/F12（Hyclone 公司）；2%B-27（Gibco-BRL）；20ng/ml表皮生长因子（EGF，Sigma公司）；40ng/ml碱 性成纤维细胞生长因子（bFGF，Peprotech公司）；1%青链霉素（Hyclone公司），以培养 当天为零代，每4天传代一次。图2中1-4为P1代皮肤干细胞培养不同天数的克隆，5-8 为传代一次后克隆逐渐变大且边缘光滑，9-12为再次传代后不同天数的克隆。

选取P1代皮肤干细胞，加入0.25%Trypsin（Hyclone公司）室温消化5分钟，然后 轻轻吹打至单细胞，终止消化。PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛（索来宝公司）室温固定 15分钟，PBS洗3遍，每遍5分钟。用0.5％Triton X-100的磷酸盐缓冲液（简称PBST） 溶液进行透化，室温10分钟。PBS（PH7.0）洗1遍，5分钟。加入含10％山羊血清或马 血清(索来宝公司)的PBST，室温封闭30－60分钟。弃封闭液，加入一抗（1：50－1：200） 稀释于封闭液中，4℃过夜或37℃孵育2小时。1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗3遍，每 遍5分钟。加入二抗（1：50－1：200）稀释于二抗稀释液中，37℃避光放置1小时。PBS 洗3遍，每遍5分钟。加入终浓度的DAPI（碧云天公司），室温放置5分钟。PBS洗3遍， 每遍5分钟。加入500μl PBS或PBS甘油（1：1）在荧光显微镜下观察，图3中1-3说明 多能性基因SSEA-1在细胞膜表达、4-6为OCT-4在细胞质表达、7-9为β-Integrin在细 胞质中表达。

第三步，皮肤干细胞体外形成EB：

当皮肤干细胞培养到第二代又3-4天时（即培养的11-12天），1500rpm离心5min收集 细胞，弃上清，加入0.25%Trypsin（Hyclone公司）室温消化5分钟，然后轻轻吹打至单 细胞，终止消化，M199（Hyclone公司）洗两遍后转入SARSTEDT悬浮培养24孔板，置于EB 培养基中培养，每两天换一半培养液（图4是培养不同天数的EB及细胞荧光检测图）；EB培 养液包括：M199（pH7.0）（Hyclone公司）、3mg/ml牛血清白蛋白（BSA）、1mg/ml胎球蛋白、 5ul/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠（ITS）、0.23mM丙酮酸钠（Hyclone公司）、1ng/ml表皮 生长因子（EGF，sigama公司）、20ng/ml Activin A（Gibco公司）和30ng/ml骨形态发生 蛋白-4（R&D公司）；图4中1是将传代两次的人皮肤干细胞消化成单细胞1天后形成的EB 前体；图4中2是培养2天后形成的EB；经过3-4天后EB边缘清晰并且变得光滑，呈规则 的球状（图4中3-4）。图5中1-3说明EB第3天消化后早期生殖细胞Vasa细胞质中表达， 图5中4-6说明Stella在细胞的核中表达。

第四步，EB培养后添加不同细胞因子体外诱导分化：

EB培养3-4天后，用0.25%Trypsin（Hyclone公司）消化EB，室温消化过程中用移液 枪吹打至单细胞，用10%胎牛血清（FBS，Gibco-BRL）终止消化，收集细胞，1500rpm离心 5min；弃上清，加入少量PGC培养液悬浮细胞；之后接种到24孔板中，将细胞稀释到细胞浓 度为5×10⁴个/ml PGCs培养液里，之后每两天换一半培养液；将培养板置于37℃、饱和湿度、 5%CO₂中培养14天，培养液包括：DMEM高糖（Hyclone公司）、10%FBS、0.23mM丙酮酸钠、 0.1mM非必需氨基酸（Gibco公司）、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、20ng/ml EGF、 40ng/ml bFGF（Peprotech公司）、40ng/ml SCF（Sigma公司）、1uM RA（Sigma公司）和30ng/ml  BMP-4。图6中1-6说明添加不同细胞因子贴壁培养1d、3d、5d、7d、9d、14d；图7中1-3 说明分化的PGC呈Stella阳性并在细胞核表达，图7中4-6说明分化的PGC呈Vasa阳性并 在细胞质表达，图7中7-9说明分化的PGC呈OCT-4阳性并在细胞核表达。

第五步，猪卵泡液继续培养：

诱导14天后，将24孔板的细胞用Trypsin-EDTA（Hyclone公司）消化下来，用FBS 终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min；接种到事先用多聚赖氨酸处理过的6cm培养皿 里，每个培养皿的接种密度为1×10⁴，换成猪卵泡培养液进行培养，每个四天换一次液； 猪卵泡培养液包括：DMEM高糖、5%猪卵泡液、5%FBS、0.23mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基 酸、2mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇。图8中1-3猪卵泡液继续诱导1d、3d、5d不 同时期的显微图，图9中1-3说明猪卵泡液继续诱导分化的PGC呈Dazl（减数分裂早期特 异基因）阳性并在细胞质表达，图9中4-6说明分化的PGC呈Vasa阳性并在细胞质表达， 图9中7-9说明猪卵泡液继续诱导分化的PGC呈Stra8（减数分裂早期特异基因）阳性并在 细胞质表达。

本发明成功利用机械法分离人皮肤干细胞并体外培养，利用hSSC体外形成EB，之后采 用添加不同细胞因子和猪卵泡液分别体外定向诱导分化，最后可获得了与体内正常原始生殖 细胞（PGC）形态和特异分子标记表达PLCs。

本发明已经试验实施了多次，试验的结果是成功的，实现了发明的目的。