一种用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统

摘要

本发明涉及遗传学和分子生物学领域，提供了一种用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统，包括依次连接的电流电压变换电路、调理电路和碱基特征信号数据采集电路；电流电压变换电路用于将碱基在电场的驱动下通过固态纳米孔产生的特征电流信号转换为电压信号，调理电路用于将所述电压信号进行放大和滤波，碱基特征信号数据采集电路用于长时连续采集调理电路的输出并将采集数据输出到计算机处理。本发明克服膜片钳系统在固态纳米孔核酸测序中电信号检测的不足，针对四种碱基，采用彼此相互独立的检测通道和不同的增益，实现了检测和采集大幅度变化的pA～nA级电流信号，提高了碱基特征电流信号采集的速度和分辨率，进而可提高识别精度。

说明书

技术领域

本发明属于遗传学和分子生物学领域，更具体地，涉及一种用于固态 纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统。

背景技术

核酸测序技术是遗传学和分子生物学研究的重要手段，也是临床疾病 诊断和治疗的一种有效工具。随着基因组计划的推动，核酸测序技术发挥 着越来越重要的作用。固态纳米孔核酸测序（见发明专利200610116294.X） 是一种低成本、高读长、高通量的第三代测序方法，在目前的方法中它最 有望在24小时内仅花费1000美元实现个人全基因组测序的目标。纳米孔 核酸测序大多采用电泳的方法，碱基在外加恒定电场的驱动下穿过纳米级 的小孔时会引发电流的变化，不同的碱基会产生不同幅度和脉宽的特征电 流，通过识别特征电流就能达到测定核酸碱基的目的。

诞生于二十世纪70年代的膜片钳技术是研究细胞离子通道的最重要的 技术，是研究细胞电生理的常规方法。该技术利用膜片钳系统检测和采集 活细胞离子通道pA～nA量级电流，而该电流量级与单个碱基穿越固态纳米 孔产生的特征电流的数量级相同，故被用于纳米孔核酸测序。经对文献检 索发现，目前主流的商用膜片钳放大器有Axopatch200B（Molecular  Devices）和EPC-10（HEKA Electronik）。如图1所示，为膜片钳系统检测 活细胞离子通道电流的框图，离子通道电流经过电流电压变换电路11将离 子通道电流转换成电压信号，接着通过信号调理电路12对信号进行放大滤 波，最后通过电生理信号数据采集电路13将数据采集到计算机进行显示和 处理，在信号检测之前需要通过补偿电路10对电路快、慢电容和串联电阻 进行补偿。

膜片钳系统的传统用途是检测细胞离子通道电流，在固态纳米孔核酸 测序的应用中存在一些功能冗余和性能不足。现有膜片钳系统多采用12位 或16位模数转换器，虽然单通道最高采样率可达200～500kHz，但经多路 复用后，各通道共享采样率，无法同时满足多通道高精度并行高速的采集 要求。另外，现有膜片钳系统在进行纳米孔核酸测序时，对不同碱基引发 的特征电流均以相同放大倍数进行放大，而当特征电流幅度变化范围较大 时，对小幅度特征电流检测可能存在分辨率不足的问题。对于纳米孔核酸 测序，上述问题带来的后果是不仅极大地压缩了采集数据后处理的空间， 而且影响对特征电流细节的辨识。而利用集成电路技术制作的放大器虽然 可以降低噪声、扩大带宽，但在利用如外切酶降速进行核酸测序的场合 （≤1000bp/s），成本则明显过高。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种可以检测和采集大幅度变化 的pA～nA级微弱电流信号的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集 系统。

本发明提供了一种用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系 统，包括：依次连接的电流电压变换电路、调理电路和碱基特征信号数据 采集电路；电流电压变换电路的输入端用于连接电泳池的正电极，碱基特 征信号数据采集电路的输出端用于连接计算机；所述电流电压变换电路用 于将碱基在外加恒定电场的驱动下通过固态纳米孔产生的特征电流信号转 换为特征电压信号，所述调理电路用于将所述特征电压信号进行放大和滤 波处理后输出，所述碱基特征信号数据采集电路用于长时连续采集所述调 理电路的输出并将采集数据输出到所述计算机上用于显示和分析。

更进一步地，所述碱基特征信号数据采集电路包括：依次连接的程控 放大电路、同步多通道数据转换电路、数据比较选择单元、数据缓冲单元 和USB接口电路，以及连接在数据缓冲单元的反馈输出端与程控放大电路 的反馈控制端之间的校准增益控制单元；所述程控放大电路用于对四种不 同碱基的特征电压信号进行不同倍数的放大；所述同步多通道数据转换电 路用于将放大后的特征电压信号同步转换成数字信号；所述数据比较选择 单元用于将四路数字信号进行比较分析并输出转换数据；数据缓冲单元用 于缓冲所述数据比较选择单元输出的数据和所述USB接口电路输入的数 据；所述USB接口电路用于实现数据缓冲单元与计算机的数据交换；所述 校准增益控制单元用于根据所述数据缓冲单元中的校准控制数据控制程控 放大电路的放大倍数。

更进一步地，碱基特征信号数据采集电路包括：依次连接的程控放大 电路、同步多通道数据转换电路、通道选择控制单元、数据缓冲单元和USB 接口电路，连接在数据缓冲单元的反馈输出端与程控放大电路的反馈控制 端之间的校准增益控制和阈值设置单元，以及连接在程控放大电路的输入 端与通道选择控制单元的控制端之间的阈值比较电路；所述程控放大电路 用于对四种不同碱基的特征电压信号进行不同倍数的放大；所述同步多通 道数据转换电路用于将放大后的特征电压信号同步转换成数字信号；所述 阈值比较电路用于将特征电压信号与参考电压进行比较并根据比较结果输 出控制信号；所述通道选择控制单元用于根据所述控制信号进行通道选择； 所述数据缓冲单元用于缓冲数据；所述USB接口电路用于实现数据缓冲单 元与计算机的数据交换；所述校准增益控制和阈值设置单元用于设置所述 参考电压以及根据所述数据缓冲单元中的校准控制数据控制所述程控放大 电路的放大倍数。

更进一步地，所述程控放大电路包括四路并行的放大器，用于对四种 不同碱基的特征电压信号分别同时进行不同倍数的放大。

更进一步地，所述同步数据转换电路包括四个模数转换器，分别连接 至四个程控放大器的输出端，用于将经放大后的特征电压信号同步转换成 数字信号。

更进一步地，阈值比较电路包括四个比较器，四个比较器的第一输入 端作为阈值比较电路的输入端，均连接至程控放大电路的输入端，四个比 较器的第二输入端分别连接所述校准增益控制和阈值设置单元输出的四个 参考电压控制端，四个比较器的输出端均连接至通道选择控制单元的控制 端。

本发明提供了一种用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系 统，通过修改膜片钳放大电路结构，删除了纳米孔DNA测序中不需要慢电 容和串联电阻补偿电路，简化了电路结构，减小了仪器体积；通过增加多 路程控放大功能、同步数据采集功能和比较选择功能，实现了检测和采集 大幅度变化的pA～nA级微弱电流信号。

附图说明

图1是现有技术提供的用于单细胞离子通道电流的膜片钳检测和采集 系统的原理框图；

图2是本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和 采集系统的原理框图；

图3是本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和 采集系统中碱基特征信号数据采集电路的一种结构示意图；

图4是本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和 采集系统中碱基特征信号数据采集电路的另一种结构示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图 及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明适用于连续检测和采集pA～nA量级的大幅度快速变化的微弱 电流信号，并对最大和/或最小电信号都要进行高精度连续采集的应用领域。 具体来说，可用于采集固态纳米孔核酸测序时产生的幅度无法事先预知的 电流信号。固态纳米孔核酸测序时会产生四种幅度的特征电流信号，且最 大和最小电信号的幅度可能相差100倍以上。

图2示出了本发明实施例提供的用于固态纳米孔核酸测序电信号的检 测和采集系统的原理框图，为了便于说明，仅示出了与本发明实施例相关 的部分，详述如下：

用于固态纳米孔核酸测序电信号的检测和采集系统1包括：依次连接 的电流电压变换电路11、调理电路12和碱基特征信号数据采集电路14； 电流电压变换电路11的输入端用于连接电泳池的正电极，碱基特征信号数 据采集电路14的输出端用于连接计算机；电泳池中被核酸外切酶切下的带 负电荷的碱基在外加恒定电场的驱动下通过固态纳米孔产生特征电流，电 流电压变换电路11用于将特征电流信号转换为电压信号并同时提供驱动电 压，调理电路12用于将电压信号进行放大和滤波处理后输出，碱基特征信 号数据采集电路14用于长时连续采集调理电路12输出的特征电压信号， 并将采集数据输出到计算机上用于显示和分析。

电泳池是一种碱基特征电流信号产生装置，在固态纳米孔电泳池中， 核酸外切酶以一定速率逐个地切下核酸单链的碱基，带负电荷的碱基在外 加恒定电场的驱动下通过固态纳米孔。碱基在通过碳纳米孔的时候会阻塞 纳米孔，故将引起通道电流的变化，每种碱基通过纳米孔所产生的特征电 流变化会与其他碱基存在一定差别，通过检测特征电流变化即可判断穿越 纳米孔的碱基种类。可以采用外切酶-纳米孔的单分子核酸测序方法（申请 号：200610116294.X）中所描述的方法搭建固态纳米孔核酸测序的电泳装 置，其中碳纳米管纳米孔可采用碳纳米管制备二维可控纳米元件的方法（申 请号：200610147236.3）进行制备和安装。

电流电压变换电路11通过超低噪声探头实现碱基特征电流信号到电压 信号的转换并同时给电泳池提供驱动电压形成外加恒定电场。调理电路12 由高频补偿电路、增益放大电路、低通滤波电路组成，主要将电流电压变 换电路11输出的电压信号调理成可采集的低噪声特征电压信号。根据所使 用的纳米孔材料不同，碱基通过纳米孔会产生pA～nA量级的电流变化，电 流电压变换电路11和调理电路12的作用是将微小的电流放大成碱基特征 信号数据采集电路14能识别的电压信号。与电生理实验中使用的膜片钳放 大器相比，在电流的检测过程中，由于被测对象不是电生理实验中的活细 胞，故不需要慢电容补偿、串联电阻补偿等辅助电路，但需保留其他补偿 电路（比如快电容补偿电路）。核酸测序的电流放大器主通道仅保留了电流 电压变换电路11与调理电路12中的高频补偿电路、滤波电路和增益放大 电路。如此，可以减小电路体积，便于增加集成度。

调理电路12输出的特征电压信号的最大与最小电压幅度可能相差100 倍以上，如果考虑最大信号，则最小信号就没有足够的采样精度，如果考 虑最小信号，最大信号就会超过采集电路的量程。

由于本领域的普通技术人员根据上述描述很容易实现电流电压变换电 路11和调理电路12，在此不再详述其内部结构。

碱基特征信号数据采集电路14能进行长时连续的采集，且能保证最大 和最小特征电压信号都有足够的分辨率。

计算机用于将接收到的数据进行显示和后续处理，即碱基数据的分析。

本发明克服传统膜片钳系统对于固态纳米孔核酸测序中电信号检测的 不足，通过修改膜片钳结构，减小了电流放大器的体积；通过增加多路程 控放大电路、同步模数转换电路和比较选择电路，实现了并行高速高精度 检测和采集大幅度变化的pA～nA级微弱电流信号。

本发明通过多路程控放大电路实现大幅度变化的电信号的低噪声检测 和高精度采集；碱基电流信号存在很大幅度的变化，假设最大碱基电流为 20nA、最小碱基电流为10pA时，如果采用固定增益的方法，当最大碱基 电流信号转换成10V的满量程电压输出时，在12位模数转换器的情况下， 最小碱基电流信号对应的电压输出仅为5mV。12位模数转换器电路在 -10V～+10V的量程下，其最小分辨电压约为4.88mV，考虑到系统噪声，此 时模数转换器的分辨率无法满足碱基特征电流波形的精确识别的要求，因 此需要针对不同的碱基特征信号进行不同倍数的放大，并采用更高位数的 模数转换器。

如图3所示，碱基特征信号数据采集电路14包括：依次连接的程控放 大电路141、同步多通道数据转换电路142、数据比较选择单元144、数据 缓冲单元145和USB接口电路146，以及连接在数据缓冲单元145的反馈 输出端与程控放大电路141的反馈控制端之间的校准增益控制单元140；程 控放大电路141用于对四种不同碱基的特征电压信号进行不同倍数的放大； 同步多通道数据转换电路142用于将放大后的四路特征电压信号同步转换 成数字信号；数据比较选择单元144将四路数字信号进行比较分析，选择 出最大分辨率且不超量程的转换数据；数据缓冲单元145用于缓冲数据比 较选择单元144输入的数据和USB接口电路输入的反方向数据；USB接口 电路146通过USB总线实现数据缓冲单元145与计算机的数据交换。

程控放大电路141包括四路并行的放大器，四个放大器的放大倍数分 别为k1、k2、k3、k4，分别针对四种不同碱基（DNA为A、T、G、C，RNA 为A、U、G、C）的特征信号同时进行不同倍数的放大；程控放大功能采 用数字可调的电位器和低噪声运算放大器实现，根据不同材料纳米孔的校 准结果，可以通过校准增益控制单元140对放大倍数k1、k2、k3、k4进行 调节。

同步数据转换电路142包括四个分别连接在上述四个放大器的输出端 的模数转换器，用于将程控放大后的电压信号同步转换成数字信号。通过 同步数据转换电路142可以保证在不降低采样率的情况下分别获得最大或 最小信号的电压值，并且都能保证采集的信号有足够的分辨率且更小的相 对误差。

数据比较选择单元144的输入端连接至上述四个模数转换器的输出端， 用于通过阈值比较判断的方法选择出分辨率最高且不超量程的转换数据， 对于16位模数转换器就是选择数值最大，且不超过量程最大数值的数据。

数据缓冲单元145的输入端连接至数据比较选择单元144的输出端， 用于缓存数据。数据缓冲单元145能将数据缓存起来，避免数据丢失；该 单元既可用于测序时缓存测序实验数据，又可缓存校准时的校准实验数据 和校准控制数据。

USB接口电路146用于实现数据缓冲单元145与计算机之间双向数据 通信，USB接口电路用于读写USB总线上的数据，实现数据缓冲单元与计 算机的数据交换。

校准增益控制单元140用于接收数据缓冲单元145中的校准控制数据 并控制程控放大电路141中四个放大器的放大倍数；校准增益控制单元通 过发送数字信号给数字可调的电位器实现模拟放大器放大倍数的调节。由 于不同材料固态纳米孔四种碱基的电流幅度大小不同，在采集信号之前， 需要根据固态纳米孔的电流特征进行校准：

校准时，需先将四路程控放大器的增益设为不同增益基值，在电泳池 中放入数量一定的单一碱基（如100个A碱基），碱基在外加电场作用下逐 个通过纳米孔；产生的碱基特征电流信号经碱基特征信号数据采集电路传 递给计算机。将校准时获得的数据称为校准实验数据，以区别测序实验获 得的实验数据。

计算机根据校准实验数据计算“A碱基”对应的增益设置数值，再将 增益设置数值通过USB总线发送给USB接口电路146，经数据缓冲单元145 缓冲后，将增益设置数值传递给校准增益控制单元140；最后由校准增益控 制单元140发送数据给程控放大电路141以设置“A碱基”的增益。

其他三种碱基的校准过程同理，在此不再赘述。

校准过程中需要采集到足够时长的纯碱基电流数据，并留出超量程余 量，以保证数据的准确性。

电路校准之后，即可对碱基排序未知的DNA片段进行测序实验。当未 知碱基穿越纳米孔时，特征电压信号经过倍数分别为k1、k2、k3、k4的四 个程控放大器分别同时放大，接着通过同步数据转换电路142转换成四路 数字信号，之后数据比较选择单元144通过判断选择出分辨率最大且不超 量程的数据，再经过数据缓冲单元144和USB接口电路146将数据传递到 计算机分析处理。

作为本发明的一个实施例，数据比较选择单元144、数据缓冲单元145 和校准增益控制单元140可以在FPGA上实现，也可以在DSP或CPLD等 实现。FPGA的RAM资源丰富，但是成本高；CPLD的RAM资源较少但 是成本低；DSP更加专注于数字信号的处理，但是没有FPGA和CPLD使 用上的灵活性。

如图4所示，碱基特征信号数据采集电路14包括：依次连接的程控放 大电路141、同步多通道数据转换电路142、通道选择控制单元143、数据 缓冲单元145和USB接口电路146，连接在数据缓冲单元145的反馈输出 端与程控放大电路141的反馈控制端之间的校准增益控制和阈值设置单元 148，以及连接在程控放大电路141的输入端与通道选择控制单元143的控 制端之间的阈值比较电路147；校准增益控制和阈值设置单元148的输出端 还与阈值比较电路147的控制端连接；程控放大电路141用于对四种不同 碱基的特征电压信号进行不同倍数的放大；同步多通道数据转换电路142 用于将放大后的特征电压信号同步转换成数字信号；阈值比较电路147用 于将特征电压信号与参考电压进行比较并根据比较结果输出控制信号；通 道选择控制单元143用于根据控制信号进行通道选择；数据缓冲单元145 用于缓冲数据；USB接口电路146用于实现数据缓冲单元与计算机的数据 交换。校准增益控制和阈值设置单元148是在校准增益控制单元140的基 础上增加了阈值设置功能，用于设置阈值比较电路147的四个比较器参考 电压V_REF1、V_REF2、V_REF3、V_REF4；阈值比较电路147用于根据比较器的 输出结果输出控制信号给通道选择控制单元143。

程控放大电路141、同步多通道数据转换电路142、数据缓冲单元145 和USB接口电路146的结构功能与上述结构相同，为了节省篇幅，在此不 在赘述。

通道选择控制单元143接收阈值比较电路147的输出控制信号，控制 信号选择当前碱基对应的通道数据，而忽略其他通道的数据。

阈值比较电路147包括四个比较器，每个比较器都有两个输入端，其中 的一个输入端作为阈值比较电路147的输入端，均连接至程控放大电路141 的输入端，每个比较器的另一个输入端均分别连接四个参考电压V_REF1、 V_REF2、V_REF3、V_REF4；四个比较器的输出端均连接至通道选择控制单元 143的控制端；阈值比较电路147用于根据比较器的输出结果输出控制信号； 四个参考电压V_REF1、V_REF2、V_REF3、V_REF4可以通过下述的校准过程获取。

校准增益控制和阈值设置单元148是在校准增益控制单元140的基础上 增加了阈值设置功能。

该实施例中校准包括两个步骤：即程控放大电路141的增益设置和阈 值比较电路147的阈值设置。其中程控放大电路141的增益设置方法与图3 所示实施例的方法原理相同。

校准时，先将阈值比较电路147中的四个阈值电压设为相等，再将程 控放大电路141中的四路放大器增益均设为相应基值。电泳池中某纯碱（如 A碱基）基逐个通过纳米孔时，产生的碱基特征电流信号经碱基特征信号 数据采集电路14传递给计算机。将校准时获得的数据称为校准实验数据， 以区别测序实验获得的实验数据。

计算机接收到校准实验数据后，根据校准实验数据计算“A碱基”对 应的增益设置数值；再将增益设置数值通过USB总线发送给USB接口电路 146，经数据缓冲单元145缓冲后，将增益设置数值传递给校准增益控制和 阈值设置单元148；最后由校准增益控制和阈值设置单元148发送数据给程 控放大电路141以设置A碱基的增益。

其它三种碱基增益设置过程同理。

计算机根据“A碱基”校准实验数据的分布，利用统计的方法，计算 出A碱基校准实验数据幅度的平均值，可以将此平均值作为阈值比较电路 147的阈值电压值；再将阈值电压值通过USB总线送给USB接口电路146， 经数据缓冲单元145缓冲后，将阈值电压值传递给校准增益控制和阈值设 置单元148，然后设置阈值比较电路147标记为“A碱基”的参考电压值。 此种设置阈值的方法能保证同一种碱基的电流是来自于同一个程控放大通 路，避免了通路切换造成的误差。

校准过程中需要采集到足够时长的纯碱基电流数据，并留出超量程余 量，以保证数据的准确性。

电路校准之后，即可对碱基排序未知的DNA片段进行测序实验。当未 知碱基穿越纳米孔时，特征电压信号经过倍数为k1～k4四个程控放大器141 分别放大。与此同时，输入电压会经过四个比较器组成的阈值比较电路147 对输入电压当前幅度进行判断比较并输出控制信号。控制信号控制通道选 择控制单元143选择对应的数模转换器并转换相应的数据，数据将经过数 据缓冲单元145和USB接口电路146将数据传递到计算机。

图4的方法相比于图3的实现方法，增加了通道选择控制单元143和 阈值比较电路147，删减了数据比较选择单元144；由于采用模拟比较方法 代替数字方法比较，图4的方法具有更快的响应速度，但是阈值比较电路 147输出给通道选择控制单元143的数据为异步信号，图4的方法数字控制 的复杂性较大，两种方法互有优缺点。

本发明实施例中，数据比较选择单元144、数据缓冲单元145、校准增 益控制单元140、通道选择控制单元143和校准增益控制和阈值设置单元 148可以用FPGA实现，也可以用DSP或CPLD等实现。FPGA的RAM资 源丰富，灵活方便，但是成本高；CPLD的RAM资源较少但是成本低；DSP 更加专注于数字信号的处理，但是使用上没有FPGA和CPLD灵活。

在本发明实施例中，碱基电流信号经过电流电压变换电路11和调理电 路12后分成四路并进行放大，每一路程控放大对应于四种碱基的一种。程 控放大电路141将碱基特征信号放大到一定的幅度，能够保证每种碱基的 特征信号有足够的分辨率。如此设计能够保证四路信号中总有一路信号是 需要采集的特征信号，采集到的四路数据任意时刻总存在一路高分辨率且 不超量程的有效数据。碱基特征信号通过四路同步数模转换电路142采集， 经数据缓冲单元145，数据将由USB接口电路146传输到计算机上进行处 理。采集到的数据将通过自主开发的计算机软件转换成实际的四种碱基的 电流值并显示。计算机分析软件还负责分析电流数据以得到实际碱基A、T、 G、C的顺序，以达到测序的目的。

为了更进一步的说明本发明实施例提供的检测和采集系统，现结合具 体实例详述如下：

采用碳纳米管孔实现电泳池装置，其中碳纳米孔的直径为1-2nm，厚度 为200nm左右。电流电压变换电路和调理电路通过对具有自主知识版权的 商用膜片钳放大器进行修改而实现。程控放大器采用数字电位器和低噪声 运算放大器实现。模数转换器采用4通道16位同步模数转换器。数据比较 选择单元/通道选择控制单元、数据缓冲单元、校准增益控制单元/校准增益 控制和阈值设置单元采用FPGA和SDRAM实现。阈值比较电路采用带迟 滞的比较器。

碱基穿越碳纳米管孔产生的电流信号经过电流电压变换电路11、调理 电路12得到可采集的特征电压信号，之后经过多路程控放大电路141、同 步多通道模数转换电路142和FPGA逻辑电路实现大幅度变化信号的连续 采集。

为了更清楚地说明本发明的思想，通过以下数据对本发明中多路程控 放大电路141增益设置方法进行详细说明，实际实验中可能因为纳米孔的 材料不同而导致数据不同，但处理方法相同。假定利用纯碱基校准实验后 得到的四种碱基对应的幅度范围的统计结果如表一所示，膜片钳放大器调 理电路12的放大倍数为10倍，16位模数转换器的满量程为-10V～+10V。 采用表一数据的最大值，根据膜片钳放大器满量程20nA进行计算，其程控 放大倍数计算结果为：

碱基类型 电流大小±误差(pA) 程控放大倍数 dAMP 172.08±25.49 10.86 dTMP 356.81±42.90 5.00 dCMP 1437.47±66.49 1.33 dGMP 13.73±0.92 136.51

表一

从表一可以看出，采用本发明提供的检测和采集系统可以检测和采集 十几pA至上千pA的大幅度快速变化的微弱电流信号。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等 同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。