具有抗肿瘤活性的细胞松弛素Cytochalasin Z24，Cytochalasin Z25和Cytochalasin Z26及其应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，本发明从北极弯孢聚壳属真菌的次级代谢产物中提取的三种新的细胞松弛素Cytochalasin Z24，Cytochalasin Z25和Cytochalasin Z26结构式如下。本发明还提供它们在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是指从北极弯孢聚壳属真菌的次级代谢产物中 提取的三种新的细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄，Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin  Z₂₆及其它们在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

微生物具有极强的环境适应能力，在其它生物无法生存的强酸、强碱、高 盐、强辐射、高压、高温、低温、寡营养等极端环境中，都能够发现微生物存 在的踪迹。极地具有独特的地理及气候特征，常年的冰雪覆盖、变化极大的光 照辐射、季节性的光照时间、极低的温度造就了极地微生物特殊的生物学特征。 极地特殊生态环境中的微生物资源已成为拓展天然药用资源的新空间。

细胞松弛素（Cytochalasin）又被称为“松胞素”，是一独特的真菌次生代谢 产物，大都具有高度取代的全氢异吲哚酮并大环内酯的结构，结构的独特性造 就了该类化合物具有抑制HIV病毒、抗肿瘤、植物毒性等多种生物活性。自 1964年Aldridge DC首次发现了细胞松弛素类化合物以来，至今已经报道了超 过100个该类结构的化合物。

真菌弯孢聚壳菌属（Eutypella sp.）的次级代谢产物目前研究的比较少，仅 有部分报道，从已知的报道中可知，该种属的次级代谢产物主要包括聚酮类如 γ-内酯，苯并吡喃衍生物，二萜，三萜以及含氮的化合物（细胞松弛素、环肽） 等。在已报道的结构中，各类化合物都具有多样的生物活性，如抑制HIV病毒、 抗肿瘤、抗菌等。

发明内容

本发明的目的在于从极地微生物中，具体是从北极弯孢聚壳属真菌的次级 代谢产物中提取得到新的细胞松弛素，本发明的另一目的在于提供这些细胞松 弛素的制备方法，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术方案如下：本发明所用的菌种是分离自北极地 区Kongsfjorden的伦敦岛（海拔100米）土壤样品的弯孢聚壳属真菌D-1 (Eutypella sp.D-1)，于2013年4月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（简 称CCTCC），保藏号为CCTCC M2013144。本发明从该弯孢聚壳属真菌D-1 中分离获得三种细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄，Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin  Z₂₆。

本发明的第一方面，是提供了细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄、Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin Z₂₆，具有如下结构式：

Cytochalasin Z₂₄为黄色油状物（甲醇），分子式C₂₈H₃₃NO₅，高分辨质谱： 464.2422(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表1。

Cytochalasin Z₂₅为黄色油状物（甲醇），分子式C₂₈H₃₅NO₅，高分辨质谱： 466.2587(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表2。

Cytochalasin Z₂₆为黄色油状物（甲醇），分子式C₂₈H₃₃NO₆，高分辨质谱： 480.2398(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表3。

本发明的第二方面，是提供了上述的细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄、 Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin Z₂₆的制备方法，该方法包括如下步骤：

（A）从平板上挑取少量弯孢聚壳属真菌D-1(Eutypella sp.D-1)，保藏号 为CCTCC M2013144的菌株的菌丝体，接种到装有PDB培养基的250mL三 角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装70mL培养基，20℃摇床恒温培养，转速 180r/min，培养5天后将种子培养液接种到2000mL的三角瓶中进行扩大培养， 每瓶装500mL PDB培养基，按12%接种量接种，同上培养条件培养9d。PDB 培养基成分：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然。

（B）将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌丝体后收集发酵液上清。 将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸 干溶剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为甲醇。

（C）将所得洗脱相蒸干后通过ODS反相柱层析纯化，流动相为：甲醇－ 水，收集60%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后继续过ODS反相柱层析，流动相 为：甲醇－水，收集80%甲醇－水的洗脱部分，浓缩后HPLC进一步纯化，使 用Zorbax半制备C₁₈反相柱（9.4mm×250mm）制备，流动相为甲醇：水（57： 43），流速2.0mL/min，218nm检测，收集t_R为16min的洗脱峰制备出化合物 Cytochalasin Z₂₄,液相分离后剩余的组分，采用硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙 酯=1:1洗脱，得Cytochalasin Z₂₅，石油醚：乙酸乙酯=5:2洗脱，得Cytochalasin  Z₂₆。

本发明的第三方面，是提供了上述的细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄、 Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin Z₂₆在制备抗肿瘤药物中的应用。

结果显示，细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄、Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin Z₂₆对大多数肿瘤细胞株都具有一定的抑制活性。细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄对 MCF-7乳腺癌细胞株的IC₅₀达到了9.33μM，和阳性对照紫杉醇的IC₅₀相当， Cytochalasin Z₂₅对SW-1990胰腺癌细胞株的IC₅₀达到了50.1μM，Cytochalasin Z₂₆对大多数肿瘤细胞株均有微弱的活性。细胞松弛素Cytochalasin Z₂₄、 Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin Z₂₆可用于制备抗肿瘤药物。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用 于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1：弯孢聚壳属真菌D-1（CCTCC M2013144）的发酵培养

a.弯孢聚壳属真菌D-1(Eutypella sp.D-1)，于2013年4月12日保藏于中 国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC M2013144；弯孢 聚壳属真菌D-1的发酵培养基如下：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，蒸馏水 1000mL，pH自然。

b.发酵培养过程：将D-1从平板上挑取少量D-1菌株的菌丝体，接种到 装有PDB培养基的250mL三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装70mL培养 基，20℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养5天后将种子培养液接种到2000 mL的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装500mL PDB培养基，按12%接种量接 种，同上培养条件培养9d。

实施例2：活性化合物的分离提取

将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌丝体后收集发酵液上清。将发 酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶 剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为甲醇。将所得洗脱相蒸干后通 过ODS反相柱层析纯化，流动相为：甲醇－水，收集60%甲醇－水的洗脱部 分，浓缩后继续过ODS反相柱层析，流动相为：甲醇－水，收集80%甲醇－ 水的洗脱部分，浓缩后HPLC进一步纯化，使用Zorbax半制备C₁₈反相柱 （9.4mm×250mm）制备，流动相为甲醇：水（57：43），流速2.0mL/min，218nm 检测，收集t_R为16min的洗脱峰制备出化合物Cytochalasin Z₂₄，液相分离后剩 余的组分，采用硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1洗脱，得Cytochalasin Z₂₅， 石油醚：乙酸乙酯=5:2洗脱，得Cytochalasin Z₂₆。

Cytochalasin Z₂₄为黄色油状物（甲醇），分子式C₂₈H₃₃NO₅，高分辨质谱： 464.2422(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表1。Cytochalasin Z₂₅为黄色油 状物（甲醇），分子式C₂₈H₃₅NO₅，高分辨质谱：466.2587(M+H)⁺，¹H和¹³C 核磁共振谱数据见表2。Cytochalasin Z₂₆为黄色油状物（甲醇），分子式 C₂₈H₃₃NO₆，高分辨质谱：480.2398(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表3。

表1Cytochalasin Z₂₄的¹H和¹³C核磁共振谱数据

表2Cytochalasin Z₂₅的¹H和¹³C核磁共振谱数据

表3Cytochalasin Z₂₆的¹H和¹³C核磁共振谱数据

采用600MHz的核磁共振仪测定，样品溶解于氘代氯仿。

同时，还测定了三个化合物的多种二维核磁共振谱（TOCSY，DQCOSY， HMQC，HMBC和NOESY），确定了化合物所有的碳原子和氢原子的归属及该 化合物的化学结构，结构式如下：

实施例3：活性化合物Cytochalasin Z₂₄，Cytochalasin Z₂₅和Cytochalasin Z₂₆对人癌细胞株的抑制作用。

方法：MTT法（Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and  survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods, 1983,65,55-63.）：

分别取对数生长期人胶质瘤细胞株U251，人胰腺癌细胞株SW1990，人胃 癌细胞株SG7901，人乳腺癌细胞株Mcf-7，人肝癌细胞株Huh-7，人子宫颈癌 细胞株Hela，人肺癌细胞株H460，各以2×10⁴/孔细胞接种于96孔板上，分别 加入不同浓度（1.5μg/ml—50μg/ml）的Cytochalasin Z₂₄，Cytochalasin Z₂₅和 Cytochalasin Z₂₆，设0.1%DMSO对照组培养72h，结束前4h每孔加入5mg/mL MTT10μL，培养结束时离心并小心吸去上清液，加入200μL DMSO并轻微振 荡，使生成的甲賛完全溶解显色后，用Bio-Rad Model550 Microplate Reader 以570nm波长测OD值。实验共进行3次，算出平均值。按下式计算抑制率： 抑制率（%）=（1－实验组平均OD值／对照组平均OD值）×100%。用Bliss 软件计算细胞生长抑制率达50%的Cytochalasin Z₂₄，Cytochalasin Z₂₅和 Cytochalasin Z₂₆的浓度，以IC₅₀表示，结果如表4所示。

表4具有抗肿瘤活性的Cytochalasin Z₂₄（IC₅₀，μM）

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。