一种阻断白介素12 p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种阻断白介素12p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用。它包括重链和轻链，所述的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3的第20位至468位所示，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4的第20位至233位所示。本发明新发现了一种能阻断白介素12p40功能的单克隆抗体Ab123FR1及其编码基因，该单克隆抗体Ab123FR1能够与p40抗原特异性结合，半数有效浓度EC50为0.03992nM，因此可以将本发明的单克隆抗体Ab123FR1作为IL-12通路的阻断剂，从而成为自身免疫疾病（例如斑块性银屑病）治疗的一种新药物。

说明书

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种阻断白介素12p40功能的单克隆抗体及其编码基因和应用。 

背景技术：

白介素12(Interleukin12,IL-12)，又名细胞毒淋巴细胞成熟因子(cytotox-ic lymphocyte maturation factor,CLMF)，或者NK细胞刺激因子(natural killer cell stimulation factor,NK SF)，是白介素家族中的一员。它首先是由美国的Wistar从Epstein-Barr virus（EB病毒）转染人B淋巴母细胞系RPMI-8866的培养液中发现的，将其命名为NKSF，随后是由Hoffman研究小组从EB病毒转化的B细胞系NC37培养液中鉴定到，并命名CLMF，待完全纯化了两者并克隆基因后发现NKSF和CLMF是同一种细胞因子，并定名为IL-12。 

白介素12主要由树突状细胞，巨噬细胞，B淋巴细胞以及其他一些抗原提呈细胞(APC)产生，能够增强NK细胞(natural killer cell)和Tc细胞（cytotoxic T cell）的细胞毒作用；刺激静止或活化的T细胞和NK细胞产生干扰素γ（IFN-γ）；促进Th0向Th1的分化。促进Th1细胞分泌IFN-γ和IL-2，介导细胞免疫应答；诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ；增加髓外造血功能；IL-12在体内有抗血管形成作用，它不直接作用于血管内皮细胞，通过诱导IFN-γ的产生，从而抑制血管生成，此种抗血管生成的作用有助于抑制肿瘤的生长和转移。IL-12在机体早期的非特异性免疫和随后的抗原特异性的适应性免疫过程均扮演了极重要的角色，是一个多功能的免疫调节因子。 

一方面，IL-12参与机体的抗肿瘤、抗过敏、抗感染过程，另一方面，其过量产生又造成 机体免疫调节失衡而导致自身免疫病。过去认为自身免疫是由抗体及免疫复合物所介导的，而现在认为自身免疫特别是组织特异性自身免疫，是由T细胞介导或呈T细胞依赖性。研究表明，许多自身免疫病的免疫病理都与抗原特异性Th1细胞的产生有关，而IL-12是促使Th0向Th1分化的关键细胞因子，故IL-12在此类疾病的发生发展中起着极为重要的作用。 

IL-12诱导并促进细胞介导的自身免疫，这一事实被广泛地在非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠动物模型、实验性结肠炎、胶原性关节炎(CIA)以及实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)动物模型中得到证实。以上疾病的病理模型在IL-12缺陷小鼠或IL-12抗体中和的小鼠中均不能复制。且IL-12中和抗体可预防继承性接受髓磷脂碱性蛋白致敏淋巴细胞的小鼠发生EAE。 

IL-12在自身免疫诱导过程中的作用表现为：(1)促进抗原特异性Th1细胞分化增殖并产生多种细胞因子，增强Th1型免疫反应。已知Th1在诱发EAE、EAU、CIA等多种自身免疫病的过程中起关键作用，IL-12单克隆抗体或阻断剂均能减弱其Th1型反应，改善病情。(2)刺激单核巨噬细胞产生多种活性介质，增强免疫活性细胞的细胞毒作用，导致自身组织损伤。(3)IL-12亦参与抗体介导的自身免疫。许多研究报道IL-12参与狼疮性肾炎的发病机制，代表动物模型为MRL^Lpr/Lpr和NZB小鼠动物模型。在狼疮肾炎中IL-12的表达水平增高，增高的IL-12刺激NK细胞、T细胞产生IFN-γ，激活一氧化氮合酶(NOS)并产生NO，结果导致肾脏的病理损害。 

IL-12在自身免疫的诱导及免疫反应的维持方面起着极为重要的作用，因此阻断IL-12的产生或信号传导，任何一个环节均可预防或阻止自身免疫病的发生和发展。 

IL-12具有独特的异源二聚体结构，是由p40和p35两个亚基通过二硫键共价连接而成 的糖基化肽链〔相对分子质量为75000道尔顿〕。其重链(p40)由306个氨基酸组成，包含10个半胱氨酸残基和4个潜在的糖基化位点，轻链(p35)由197个氨基酸组成，包含7个半胱氨酸残基和3个潜在的糖基化位点。特异性结合p40亚基的单克隆抗体可作为IL-12通路的阻断剂，从而成为自身免疫疾病（例如斑块性银屑病）治疗的一种新药物。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种阻断白介素12p40功能的单克隆抗体Ab123FR1及其编码基因和应用。 

本发明的阻断白介素12p40功能的单克隆抗体Ab123FR1，其特征在于，包括重链和轻链，所述的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3的第20位至468位所示，所述的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4的第20位至233位所示。 

SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的第1位至19位氨基酸序列是信号肽序列。 

一种编码阻断白介素12p40功能的单克隆抗体Ab123FR1的基因，其特征在于，包括编码具有如SEQ ID NO.3的第20位至468位所示氨基酸序列的重链的核苷酸序列，和编码具有如SEQ ID NO.4的第20位至233位所示氨基酸序列的轻链的核苷酸序列。 

所述的编码重链的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1的第58位至1407位所示的核苷酸序列。 

所述的编码轻链的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2的第58位至702位所示的核苷酸序列。 

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的第1位至57位碱基序列是编码信号肽序列的核苷酸序列。 

本发明还提供了单克隆抗体Ab123FR1在制备IL-12通路的阻断剂中的应用。 

本发明新发现了一种能阻断白介素12p40功能的单克隆抗体Ab123FR1及其编码基因，该单克隆抗体Ab123FR1能够与p40抗原特异性结合，半数有效浓度EC50为0.03992nM，因此可以将本发明的单克隆抗体Ab123FR1作为IL-12通路的阻断剂，从而成为自身免疫疾病（例如斑块性银屑病）治疗的一种新药物。 

附图说明：

图1是将p40的cDNA插入载体pcDNA3.1/myc-his(-)A后转化大肠杆菌DH5a后的菌落PCR验证电泳图； 

图2是C端带his6标签的p40基因的读码框翻译后的氨基酸序列，其中字母代表氨基酸的缩写； 

图3是纯化后的带his的抗原p40蛋白的SDS-PAGE图； 

图4是重链的cDNA插入载体pcDNA3.1/myc-his(-)A后转化大肠杆菌DH5a后的菌落PCR验证电泳图以及轻链的cDNA插入载体pcDNA3.1/myc-his(-)A后转化大肠杆菌DH5a后的菌落PCR验证电泳图； 

图5是重链的cDNA的读码框翻译后的氨基酸序列，其中字母代表氨基酸的缩写，具体序列如SEQ ID NO.3所示； 

图6是轻链的cDNA的读码框翻译后的氨基酸序列，其中字母代表氨基酸的缩写，具体序列如SEQ ID NO.4所示； 

图7是纯化后的抗体Ab123FR1的SDS-PAGE图； 

图8是P40抗体AB123FR1的半数有效浓度EC50测试图。 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 

实施例1： 

一、p40筛选抗原表达载体的构建 

1.从北京傲锐东源公司购买p40的cDNA（SC124116，IL12B(NM_002187)human cD NA clone）作为抗原p40的基因来源。 

2.以SC124116为模版，以F1（5’-TCTAGAGCCGCCACCATGTGTCACCAGCAGTTG-3’），R1(5’-GTGGTGGTGGTGATGACTGCAGGGCACAGATGC-3’)为引物，进行第一轮PCR扩增，以第一轮PCR扩增的产物作为模板，以F2(5’-CCCAAGCGAGCTCTAGAGCCGC CACCATGT-3’)，R2(5’-CGCGGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGATGACTG-3’)作为扩增引物，进行第二轮PCR扩增，在p40基因后加上his6纯化标签，并在两端引入Xba I，Bam H I两个限制性酶切位点。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN DP209-03）回收第二轮PCR扩增的扩增产物。 

3.回收的PCR扩增产物和载体pcDNA3.1/myc-his(-)A（购自Invitrogen）分别经限制性内切酶Xba I,BamH I(购自NEB公司)双酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN DP209-03）回收酶切产物，利用DNA Ligation Kit Ver.2.0(TAKARA D6022S)进行连接反应，将PCR扩增产物插入载体pcDNA3.1/myc-his(-)A的Xba I，BamH I酶切位点之间。然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a（北京天根生化，CB101），涂布于LB培养基平板上。 

4.挑取LB培养基平板上的单克隆用LB液体培养基进行小量培养，以载体上的引物F3（5’-CCAAAAACGAGGAGGATT-3’），R3（5’-CATATGCCTTCCGAGTGAGAG-3’）进 行菌落PCR验证（图1），含有插入片段的克隆（克隆4，克隆5及克隆8）为阳性克隆，抽提阳性克隆的质粒DNA，并送invitrogen进行测序验证。 

5.测序结果显示，C端带his6标签的p40基因插入了载体pcDNA3.1/myc-his(-)A（购自Invitrogen）中，完全的读码框翻译后的氨基酸序列见图2，由此得到his融合表达载体，其是将步骤2的PCR扩增产物插入了载体pcDNA3.1/myc-his(-)A中。 

二、p40筛选抗原(p40-his6)的表达及纯化 

1.将测序鉴定正确的his融合表达载体50ug转染5×10⁷个293f细胞（购自invitrogen），37度，8%CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。 

2.将上清于6000rpm离心20min，再用0.2um滤膜过滤； 

3.滤液经Millipore labscale超滤浓缩换液至Buffer A（50mM Tris，300mM NaCl，10mM Imidazole，pH8.0）中，得到浓缩后样品； 

4.浓缩后样品经0.2um过滤后上样至已用PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4，pH7.4)平衡好的1ml HisTrap HP柱； 

5.待样品上完后用Buffer A冲洗，流速1ml/min，紫外监测为水平。 

6.用0-60%Buffer B（50mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole，pH8.0）,15柱体积线性洗脱，流速1ml/min，收集流出峰，并进行SDS-PAGE检测(图3) 

7.合并相应洗脱峰，并用超滤浓缩管浓缩换液至PBS中，由此得到抗原p40-his。 

三、p40抗体Ab123FR1表达载体的构建 

1.合成抗体Ab123FR1的轻链的cDNA（其序列如SEQ ID NO.2所示，其中第1-57位 碱基为编码信号肽序列的核苷酸序列，第58-699为编码轻链的碱基序列，第700-702为终止子），并在轻链的cDNA 5’端添加EcoR I酶切位点和Kozak序列，在3’端添加Hind III酶切位点，具体是在5’端连上GAATTCgccgccacc，在3’端连上AAGCTT，整个包括EcoR I酶切位点、Kozak序列、轻链的cDNA和Hind III酶切位点的序列可以直接人工合成。然后再合成重链的cDNA（其序列如SEQ ID NO.1所示，其中第1-57位碱基为编码信号肽序列的核苷酸序列，第58-1404为编码重链的碱基序列，第1405-1407为终止子），并在重链的cDNA5’端添加EcoR I酶切位点和Kozak序列，在3’端添加Hind III酶切位点，具体是在5’端连上GAATTCgccgccacc，在3’端连上AAGCTT，整个包括EcoR I酶切位点、Kozak序列、重链的cDNA和Hind III酶切位点的序列可以直接人工合成。 

2.将带有酶切位点的重链的cDNA和载体pcDNA3.1/myc-his(-)A（Invitrogen）分别经限制性内切酶EcoR I，Hind III(购自NEB公司)双酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGE N DP209-03）分别回收酶切产物，利用DNA Ligation Kit Ver.2.0(TAKARA D6022S)进行连接反应，将重链的cDNA插入载体pcDNA3.1/myc-his(-)A（Invitrogen）的EcoR I,Hind I II酶切位点之间。然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a（北京天根生化，CB101），涂布于LB平板上。挑取LB平板上的转化感受态细胞DH5a的单克隆用LB培养基进行小量培养，以引物F4（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’），R4（5’-TAGAAGGCACAGTC GAGG-3’）进行菌落PCR验证（图4），将含有插入片段的克隆（克隆1和克隆2）作为阳性克隆，抽提阳性克隆的质粒DNA，并送invitrogen进行测序验证。测序结果显示，Ab123FR1的重链的cDNA插入了载体pcDNA3.1/myc-his(-)A中，插入正确，完全的读码框翻译后的氨基酸序列见图5，由此得到Ab123FR1重链表达载体。 

同理，将带有酶切位点的轻链的cDNA和pcDNA3.1/myc-his(-)A（Invitrogen）分别经限制性内切酶EcoR I,Hind III(购自NEB公司)双酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGE N DP209-03）分别回收酶切产物，利用DNA Ligation Kit Ver.2.0(TAKARA D6022S)进行连接反应，将轻链的cDNA插入载体pcDNA3.1/myc-his(-)A（Invitrogen）的EcoR I,Hind I II酶切位点之间。然后将连接产物转化感受态细胞DH5a（北京天根生化，CB101），涂布于L B平板上。挑取LB平板上的转化感受态细胞DH5a的单克隆进行小量培养，以引物F4（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’），R4（5’-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’）进行菌落P CR验证（图4），将含有插入片段的克隆（克隆6和克隆7）作为阳性克隆，抽提阳性克隆的质粒DNA，并送invitrogen进行测序验证。测序结果显示，Ab123FR1的轻链的cDNA插入了载体pcDNA3.1/myc-his(-)A中，基因插入正确，完全的读码框翻译后的氨基酸序列见图6，由此得到Ab123FR1轻链表达载体。 

四、p40抗体Ab123FR1的表达及纯化 

1.将测序鉴定正确的Ab123FR1重链表达载体和轻链表达载体(1:1)50ug共转染到5×10⁷个293f细胞中（购自invitrogen），37度，8%CO2，130rpm/min培养7天后，离心收集上清。 

2.将上清6000rpm离心20min，并用0.2um滤膜过滤，收集滤液； 

3.滤液上样至已用PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,pH7.4)平衡好的1ml HiTrap protein A HP柱； 

4.待样品上完后用PBS冲洗，流速1ml/min，紫外监测为基线； 

5.改用100%0.1M Citric(pH3.5)洗脱，流速1ml/min，收集流出峰，并进行SDS-PAG  E检测(图7) 

6.合并相应洗脱峰，并用超滤浓缩管浓缩换液至PBS中，由此得到抗体Ab123FR1。 

五、用间接ELISA(酶联免疫吸附法)测定P40抗体AB123FR1的半数有效浓度EC50 

1.酶标板用抗原p40-his包被，37℃孵育2h。加入封闭液4℃孵育过夜。 

2.加入梯度浓度的抗体Ab123FR1为一抗，37℃温育30min。 

3.用Goat Anti Human IgG，HRP（Jackson，目录号：109-035-088）作二抗，37℃孵育30min。 

4.TMB显色剂，用酶标仪在450nm处测OD值（见表1）。 

将数据转录到软件GraphPad Prism5进行数据分析，计算出半数有效浓度EC50为0.03992nM（见图8）。 

表1：