十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂及其应用

摘要

本发明公开了一种化合物十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂及其在制备预防和治疗肝癌、肺癌、食管癌、胃癌和乳腺癌药物中的应用。实验证明，本发明的化合物在浓度为50mg/kg体重时，对人肝癌HepG2细胞、人肺癌A-549细胞、人胃癌SGC7901细胞、人食管癌KYSE109细胞和乳腺癌MDA-MB-435细胞有较强的抑制作用，为制备抗多种肿瘤、且毒副作用更小、效果更明显的抗肿瘤药提供了基础和途径，具有极其重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及槐糖脂类化合物及其应用，尤其涉及十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖 脂（简称：C18:2DLSL）及其在制备抗癌药物中应用。

背景技术

槐糖脂是一种重要的生物表面活性剂，对于它的研究始于二十世纪五、六十年代，主 要是通过微生物发酵获得。

槐糖脂主要有两种基本结构，如下图所示：

槐糖脂的结构式（R=Actyl；左图：酸型槐糖脂；右图：内酯型槐糖脂）

槐糖脂是由几种非致病性的酵母产生，为由一系列结构类似的槐糖脂分子组成的混合 物。不同种类和结构的槐糖脂分子具有不同的理化活性和生物活性。实验证实，内酯型槐 糖脂具有更好的降低液体表面张力的能力和抗菌活性，而酸型槐糖脂具有更好的水溶性和 发泡能力。

近年来，国外对于槐糖脂作为药物的研究，特别是抗肿瘤药物方面有一些文献报道。 Scholz和Mehta等人报道，粗品槐糖脂及槐糖脂衍生物能够抑制人类白血病细胞株HL60 和人头颈癌细胞的增殖，并且证明了槐糖脂的抗肿瘤活性与槐糖脂的乙酰基有关，通过化 学反应去掉槐糖脂的乙酰基，发现其抗肿瘤活性明显降低，但对其抗肿瘤机制没有进一步 的研究。Isoda等人报道，槐糖脂能够导致HL60白血病细胞系的细胞分化和抑制蛋白激 酶C的活性。此外，槐糖脂可用作帕金森氏病、老年性痴呆症、牛皮癣、艾滋病治疗的免 疫调节剂，还可用作抗病毒的免疫刺激。

然而，经文献和专利检索，槐糖脂纯品分子如十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂， 或以该化合物为活性成分的药物组合物，或利用该化合物在制备治疗和预防肝癌、肺癌、 食管癌、胃癌、宫颈癌和乳腺癌的药物中的应用未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂（简称：C18:2DLSL） 及其在制备抗癌药物中应用。

本发明所述的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂，其结构如式(Ⅰ)所示：

上述十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂是利用拟威克酵母变种（Wickerhamiella  domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576经液体发酵后，从液体发酵产物中分离纯化制 得；其中：所述拟威克酵母变种（Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid）CGMCC No.1576 已于2005年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（中国科 学院微生物研究所，中国北京），相关菌株专利见“一种产槐糖脂的拟威克酵母变种及其 应用（专利号ZL200610042190.9）”。

本发明所述十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂在制备预防和治疗肝癌、肺癌、食 管癌、胃癌和乳腺癌药物中的应用。

发明人发现本发明所述十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂对肝癌、肺癌、胃癌、 食管癌、乳腺癌具有预防和治疗作用。实验证明，本发明的化合物在浓度为50mg/kg体 重时，对人肝癌HepG2细胞、人肺癌A-549细胞、人胃癌SGC7901细胞、人食管癌KYSE109 细胞和乳腺癌MDA-MB-435细胞有较强的抑制作用（30～33%），说明该化合物可以作为 抑制肝癌、肺癌、胃癌、食管癌和乳腺癌的化学制剂，提示所述化合物在制备预防和治疗 肝癌、肺癌、食管癌、胃癌和乳腺癌药物中具有重要应用。

本发明提供了一种用于预防和治疗肝癌的制剂，其中：所述制剂含有治疗有效量的上 述的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂和药学上可接受的载体。

本发明提供了一种用于预防和治疗肺癌的制剂，其中：所述制剂含有治疗有效量的上 述的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂和药学上可接受的载体。

本发明提供了一种用于预防和治疗食管癌的制剂，其中：所述制剂含有治疗有效量的 上述的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂和药学上可接受的载体。

本发明提供了一种用于预防和治疗胃癌的制剂，其中：所述制剂含有治疗有效量的上 述的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂和药学上可接受的载体。

本发明提供了一种用于预防和治疗乳腺癌的制剂，其中：所述制剂含有治疗有效量的 上述的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂和药学上可接受的载体。

上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如水、乙醇等， 填充剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润 剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如 十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙或镁、聚乙二醇等； 其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

上述制剂较适于通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要所述病症治疗的患 者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，或制成液体 制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、醑剂、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其 制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的制剂形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、 鼻喷雾剂和注射剂。

本发明所述的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一 种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的制剂优选含有重量比为0.1%-99.5%的活性成分十八碳双乙酰化两个双键内 酯型槐糖脂，最优选含有重量比为5%-95%的活性成分十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐 糖脂。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和 严重程度等变化，其日剂量可以是4-50mg/kg体重，优选10-50mg/kg体重。可以一次或 多次施用。

本发明所述十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂由发明人实验室分离的具有自主 知识产权的拟威克酵母变种发酵生产，粗品槐糖脂产量可达到150g/L，具有大规模发酵 生产的潜力，而且槐糖脂由可再生的天然原料发酵而成，对人和动物毒性很低。本申请日 前，申请人曾经对拟威克酵母变种产生的粗品槐糖脂对人肝癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细 胞、食管癌细胞的体外抑制作用进行了初步研究，在此基础上完善了结构不同的槐糖脂分 子的纯化和制备方法，形成了本专利。

据最新资料报道，全国肿瘤肿瘤死亡率为180.54/10万，每年因癌症死亡病例达270 万例，每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人，全国每分钟有6人被诊断为 癌症。居民因癌症死亡的几率是13%，即每7至8人中有1人因癌死亡。现在的发病率和 死亡率虽然较前20年变化不大，但数据显示，我国癌症发病呈现年轻化趋势，包括乳腺 癌、肺癌、结肠癌、甲状腺癌等发病年龄均低于以前的发病年龄。

从病种看，居全国恶性肿瘤发病第一位的是肺癌，其次为胃癌、结直肠癌、肝癌和食 管癌。居全国恶性肿瘤死亡第一位的仍是肺癌，其次为肝癌、胃癌、食管癌和结直肠癌， 前10位恶性肿瘤占全部恶性肿瘤的84.27%。死亡率最高者男女均为肺癌。

虽然癌症严重影响人们的身心健康，但目前对于癌症的治疗没有特效的方法，早期主 要是进行外科手术、放疗和化疗。晚期癌症的治疗方法主要有放化疗及中医药治疗，随着 治疗时间延长，带来的毒副作用也越大。因此，开发新型抗癌药势在必行。实验提示，本 发明提供的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂为制备抗多种肿瘤、且毒副作用更小、 效果更明显的抗肿瘤药提供了基础和途径，具有极其重要的意义。

附图说明

图1槐糖脂粗提物的HPLC图谱。

图2电镜观察十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂（简称：C18:2DLSL）作用 HepG2后细胞核变化

其中：A正常肿瘤细胞；B40μg/ml槐糖脂（C18:2DLSL）作用后的肿瘤细胞；C2μg/ml 阿霉素处理后的肿瘤细胞。

图3流式细胞技术检测C18:2DLSL作用后细胞周期变化

其中：A正常肿瘤细胞；B40μg/ml槐糖脂（C18:2DLSL）作用后的肿瘤细胞；C2μg/ml 阿霉素处理后的肿瘤细胞。

图4比色法检测C18:2DLSL作用后细胞中caspase-3活性变化。

具体实施方式

下面结合实施例来使本专业技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发 明。

实施例1：

1.十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂的制备

1.1利用拟威克酵母变种发酵生产粗品内酯型槐糖脂

（1）菌种选择：拟威克酵母变种（Wickerhamiella domercqiae var.sophorolipid）CGMCC  No.1576；

（2）斜面培养：将菌种接种于基本无机盐培养基，其中添加质量体积比为1.6%的琼 脂，30℃条件下，静止培养36小时；

（3）种子培养：将步骤（2）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于50ml 含有质量体积比为8%的葡萄糖和3%的菜籽油的培养基中，30℃条件下，振荡培养36小 时，制得种子液；

（4）扩大培养：以7%的体积比的接种量，将种子液接种于500ml含有质量体积比 为3%的菜籽油的培养基中，30℃条件下，振荡培养200小时；

（5）内酯型槐糖脂制备：将步骤（4）得到的发酵液用两倍体积的乙酸乙酯萃取，上 层有机相于50℃下减压蒸馏后用正己烷洗涤2遍，再经50℃减压蒸馏得到淡黄色块状固 体，即为粗提的内酯型槐糖脂样品。

1.2十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂的分离纯化

将上述内酯型槐糖脂粗提物分别溶解于色谱纯甲醇，0.22μm有机膜过滤后用于分析 型HPLC分析。上柱前，超纯水与有机溶剂均要经0.22μm滤膜分别过滤，装入不同溶剂 瓶。条件：柱子为KromasiL C₁₈分析柱（5μm×250mm×4.6mm，Agela Technologies Inc., USA），流动相：乙腈-水下的梯度洗脱（v/v），洗脱方案：0～15min，乙腈含量从40%升 高至60%；15～35min，乙腈含量从60%升高至70%。进样体积：15μl，流速：1ml/min， 检测波长：207nm。制备型HPLC条件：柱子为PrepHT XDB C₁₈column（250mm×21.2mm, Agela Technologies Inc.,USA）制备柱，进样体积：500μl，流速：15ml/min，洗脱条件与 分析型HPLC相同。收集到的不同馏分分别进行减压浓缩，进行结构分析。结果见图1。

2.十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂的结构鉴定

2.1MS分析

用阳离子模式MS/MS对脂肪酸部分为18C的槐糖脂结构进行鉴定。MS结果如表1 所示。[M-H]-发生在m/z685，故该组份的分子量应该是686，推断可能是脂肪酸部分为 C18:2的双乙酰化内酯型槐糖脂（C18:2DLSL）。在CID-MS谱图中，两个离子m/z617和 m/z575极有可能是槐糖部分的非还原端葡萄糖基团开环后失去一个或者两个C₂H₂O基 团所形成，而离子m/z539则可能是去质子化离子m/z659的还原端或者非还原端葡萄糖 基失去两个C₂H₄O₂所形成；去质子化离子m/z659失去AcOC₆H₉O₄形成离子m/z483，失 去AcOC₆H₉O₄和H₂O，形成离子m/z465AcOC₆H₉O₄和2分子H₂O，则形成离子m/z447。 离子m/z269(C₁₈H₃₁O₃)是去质子化羟基脂肪酸，说明该槐糖脂含有C18:2羟基脂肪酸。 综上，该槐糖脂应该是C18:2DLSL。

表1十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂的MS/MS分析

1B₂ion was formed by loss of hydroxy fatty acid

2Y₀ion was protonated hydroxy fatty acid

3B₁ions was the nonreducing residue with an acetate group at the C-6″atom

2.2核磁共振的二维谱分析

十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂的核磁共振的¹³C NMR特征非常明显，信号分 布集中在几个区域：低场区δ173.56、171.81、170.69ppm处为三个羰基信号，分别是两个 葡萄糖的6位取代乙酰氧基中的羰基和脂肪酸侧链的羰基。δ131.26、129.51ppm及δ129.36、 131.19ppm为两个双键信号，化学位移值接近，证明两个双键类型为-CH=CH-。δ103.98、 102.59ppm为两个葡萄糖的端基碳信号。δ69.9～82.0ppm是葡萄糖2、3、4、5位碳信号， δ63.74、62.28ppm为6位碳信号。脂肪链部分碳原子位于δ20.98～37.68ppm范围内。

综合十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂的氢谱和碳谱结果，及十八碳双乙酰化两 个双键内酯型槐糖脂的核磁共振的二维谱分析，结果见表2。

表2十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂的结构分析（溶剂CDCl₃，内标TMS）

实施例2：

制备方法：将十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂（C18:2DLSL）与乳糖和玉米淀 粉混合，用水均匀湿润，过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，均匀后压片，每片重240mg， C18:2DLSL槐糖脂含量为5mg。

实施例3：

制备方法：将C18:2DLSL与乳糖和硬脂酸镁混合，过筛，在合适的容器中均匀混合， 把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，C18:2DLSL含量为10mg。

实施例4：

制备方法：将C18:2DLSL和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液在无菌 条件下装入安瓿瓶中。

实施例5：

制备方法：将C18:2DLSL与乳糖和硬脂酸镁混合，过筛，在合适的容器中均匀混合， 把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，C18:2DLSL含量为15mg。

实施例6十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂（C18:2DLSL）诱导肿瘤细胞凋亡

用终浓度为40μg/ml的C18:2DLSL作用HepG2细胞24h后，胰蛋白酶消化并收集细 胞，pH7.2的PBS洗2次；细胞沉淀用2.5%的戊二醛固定液固定，4℃过夜；pH7.2的PBS 洗3次；1%的锇酸4℃固定2h；梯度丙酮脱水(25%-100%丙酮)；包埋剂包埋；LKBV型 超薄切片机切片，JEM-1200EX透射电镜观察并拍照。结果表明，正常的HepG2细胞，细 胞核浆比值大，核常染色质，核仁大，核膜完整有切迹。化合物C18:2DLSL作用后，细 胞体积缩小，细胞浆浓缩，细胞核染色质凝集深染凝聚于核膜内侧，并成块状或新月状边 缘化；胞浆内空泡增多，细胞膜完整，表面微绒毛和伪足减少；并可见膜包裹细胞核碎片 的调亡小体（图2）。流式细胞技术表明经C18:2DLSL诱导后，大部分HepG2细胞阻滞在 G₁期，少部分细胞阻滞在S期，使细胞不能进入下一个细胞周期，从而发生凋亡。在化合 物C18:2DLSL浓度为40μg/ml诱导24h，细胞的亚二倍体占的比例为28.0%（图3）。收 集对数期HepG2肝癌细胞，用1.0μM的C18:1DLSL作用24h后，加入Caspase3的作用 底物，室温放置3h，用荧光酶标仪检测Caspase3活性，结果显示Caspase3被激活，证明 C18:2DLSL诱导HepG2的凋亡是caspase-3依赖性的（图4）。

实施例7十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂体内抗肿瘤活性

采用实施例1得到的十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂（C18:2DLSL），以裸小鼠 为研究对象，对其体内种植肿瘤细胞，进行槐糖脂体内抗肿瘤试验。具体实验步骤如下：

1实验材料：

人肝癌细胞HepG2细胞、人肺癌A-549、人胃癌SGC7901、人食管癌KYSE109和乳腺 癌MDA-MB-435裸小鼠，注射器，针头等

2实验步骤与结果

（1）抑瘤实验：小鼠肿瘤模型建立：人肝癌细胞HepG2细胞、人肺癌A-549、人胃癌 SGC7901、人食管癌KYSE109和乳腺癌MDA-MB-435细胞株分别复苏后，按每只裸小鼠 腹腔内注射约1.5×10⁷个活细胞。待7～10天后，在无菌条件下抽取腹水，调整细胞浓度 为5×10⁷个/mL。随即依次在裸小鼠右侧腋下于腋中线上约2cm处皮下接种约l×10⁷个活 细胞。肿瘤直径≥5mm时为成瘤。

（2）治疗实验：对小鼠进行肿瘤接种7天后，将实体瘤小鼠模型动物随机分为5组， 每组10只。分别为对照组：80%乙醇溶液；槐糖脂低剂量组5mg/kg、中剂量组50mg/kg， 高剂量组500mg/kg；环磷酰胺给药组，分别连续给药10天。

（3）实体瘤小鼠抑瘤率的计算：末次给药48小时后脱臼处死小鼠，称重后剖取瘤块称 重，按照下公式计算抑瘤率。

肿瘤抑制率(%)=[(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重]×100%

结果见表2。

表2槐糖脂对裸小鼠移植瘤瘤重影响

由以上数据可以看出，5mg/kg·bw体重的C18:2DLSL槐糖脂对于5种人肿瘤细胞的 抑瘤率为13～18%；50mg/kg·bw槐糖脂给药组抑瘤率达到了23～25%；500mg/kg·bw槐糖 脂给药组抑瘤率达到33～36%，与80%乙醇溶液对照组差异极显著，抑瘤率小于环磷酰胺 对照组。

（4）槐糖脂对荷瘤裸鼠的毒副作用观察：用50mg/kg体重的C18:2DLSL治疗13 天后，称小鼠体重，检测槐糖脂对小鼠生长的影响，结果见表3。

表3C18:2DLSL槐糖脂治疗后对小鼠体重的影响

由结果可知，在用C18:2DLSL治疗13天后，各槐糖脂实验组小鼠一般情况良好，进 食和体重同80%乙醇溶液组相比无明显差异，而环磷酰胺阳性对照组于治疗开始后第13 天小鼠逐渐出现严重消瘦，营养不良，进食消极，体重变化与80%乙醇溶液组之间存在明 显差异(P<0.05)。说明槐糖脂对小鼠基本无毒副作用，而环磷酰胺对小鼠毒害作用较强。

上述实验表明，C18:2DLSL槐糖脂对于人肝癌细胞HepG2细胞、人肺癌A-549、人 胃癌SGC7901、人食管癌KYSE109和乳腺癌MDA-MB-435细胞都具有很强的抑制作用。 由于小鼠的耐毒能力是人的11倍，因而所述十八碳双乙酰化两个双键内酯型槐糖脂C18:2 DLSL的有效抗癌的药物浓度为4-50mg/kg体重，优选药物浓度为10-50mg/kg体重。