施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明提供了一种施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体，其是由保藏号为CGMCC No.7617的杂交瘤细胞SBV-N McAb2C8分泌产生的。该杂交瘤细胞的制备方法为：提取SBV基因组RNA，经RT-PCR扩增获得N基因序列，并插入到原核表达载体中，转化大肠杆菌进行诱导表达以及蛋白纯化；将纯化蛋白作为抗原免疫动物，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，经筛选获得可稳定分泌抗施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。该单克隆抗体为施马伦贝格病ELISA检测方法的建立提供物质基础。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及免疫技术领域，具体地说，涉及施马伦贝 格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

2011年夏秋季节，德国和荷兰的某些牛场开始出现一种未知疾 病，病牛出现发热（>40℃）、体质下降、食欲不振、厌食、腹泻和产 奶量下降等临床症状，有时出现流产症状。2011年11月18日，德国弗 里德里希洛弗勒研究所（Friedrich Loeffler Institute，FLI）利用宏基 因组学技术（Metagenomic technique）和病毒分离技术最终确证导致 此次疫情的病原体为一种新型的布尼亚病毒。因该病毒首先从德国西 部城镇—施马伦贝格的一头患病奶牛血液中被分离与鉴定成功，故根 据分离地点将其暂时命名为“施马伦贝格病毒（Schmallenberg virus， SBV）”，并将其引发的疫病称为“施马伦贝格病（Schmallenberg  disease，SBD）”。

SBV的易感动物包括绵羊、牛（奶牛和野牛）、山羊以及马鹿（Red  deer）、獐鹿（Roe deer）、羊驼（Alpaca）和欧洲盘羊（Mouflon）等 反刍动物。患病牛主要出现发热（>40℃）、精神不振、体质下降、厌 食、产奶量下降（最高达50%）和腹泻等临床症状，部分病牛会出现 流产症状。通常情况下，成年羊不出现异常症状，但怀孕羊易出现流 产、死胎或产出畸形羔羊，畸形羔羊即使分娩时尚未死亡也往往难以 存活，部分发病养殖场新生羔羊畸形率高达25-50%。截至2013年4月 底，正式确认存在施马伦贝格病的国家有德国、荷兰、比利时、英国、 法国、意大利、卢森堡、西班牙、丹麦、爱沙尼亚、瑞士、爱尔兰、 挪威、瑞典、芬兰、波兰、奥地利、斯洛文尼亚、捷克、匈牙利和土 耳其，引起了欧盟（EU）、世界动物卫生组织（OIE）以及国际社会 的高度重视。俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯、哈萨克斯坦、阿根廷、阿 尔及利亚、摩洛哥、埃及、约旦、黎巴嫩、美国、日本和中国等众多 国家已经对欧盟相关疫情国家的牛、绵羊和山羊活动物（包括胚胎） 及其相关制品（包括肉类、精液和卵细胞等遗传物质）采取了不同的 贸易限制措施；而智利、加拿大、塞尔维亚和瑞士等国则要求受感染 国家提供更多的疫情信息和该病的有关资料，并考虑采取相关的贸易 限制措施。毫无疑问，施马伦贝格病的暴发与流行已经给有关国家造 成了巨大经济损失。幸运的是，截至目前尚未发现施马伦贝格病疫区 内与患病动物或动物生产环境有过密切接触的人员（主要为畜主和兽 医）发病的情况。尽管如此，鉴于布尼亚病毒科的多种病毒具有人畜 共患的特性，因此，目前尚不能完全排除施马伦贝格病毒感染人类的 可能。

现有研究结果表明，施马伦贝格病毒在分类学上属于布尼亚病毒 科（Bunyaviride）正布尼亚病毒属（Orthobunyavirus）辛波血清群 （Simbu serogroup），其遗传特性与辛波血清群的沙门达病毒 （Shamonda virus）、艾罗病毒（Aino virus）和赤羽病毒（Akabane virus） 密切相关。基于正布尼亚病毒属病毒的N基因编码区的序列分析结果 表明，SBV与沙门达病毒的同源性最高。SBV是一种有囊膜的单股负 链RNA病毒，病毒粒子表面有糖蛋白纤突，其基因组可分为3个节段， 依次为L、M和S基因节段。其中，L基因编码RNA依赖性RNA聚合酶； M基因编码2种表面糖蛋白Gn和Gc以及1个非结构蛋白（NSm）；S基 因编码核衣壳蛋白N和另一个非结构蛋白NSs。FLI研究所已经将其测 得的SBV全基因序列提交到GenBank中（登录号为：L基因HE649912； M基因HE649913；S基因HE649914）。

目前，德国FLI研究所已经成功建立了施马伦贝格病的荧光定量 RT-PCR检测方法，可检测患病牛羊血液样品、畸形羔羊的脑组织、 胎盘、羊水和胎粪等样品中的施马伦贝格病毒。为了控制施马伦贝格 病疫情在欧盟各成员国之间进一步传播与蔓延，FLI研究所已经将其 新建的荧光定量RT-PCR检测方法提供给了荷兰、比利时、英国、法 国和意大利等国家的相关实验室。同时，FLI研究所利用KC细胞（杂 斑库蠓幼虫细胞）和BHK-21、Vero细胞已经从患病牛血液中成功分 离到了施马伦贝格病毒，为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供 了物质保障。目前，FLI研究所已经建立了检测SBV血清抗体的间接 免疫荧光、中和试验等血清学检测方法。

由于施马伦贝格病是一种新发的外来动物疫病，目前仅流行于欧 洲，我国尚未出现相关疫情，因此国内针对该疫病尚无任何检测技术 储备。鉴于布尼亚病毒科多数病毒具有人畜共患和相同传播媒介（主 要为库蠓、蚊子和白蛉）的特点，目前尚不能完全排除施马伦贝格病 毒能够引起人类发病的可能性。综上所述，从维持我国畜牧业持续健 康发展、保障国民身体健康以及维护国家利益的角度出发，预先开展 该病的检测技术储备研究已经势在必行。

众所周知，抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结 合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方 法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其 他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所 以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对 同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质 的抗体组成。因而，常规血清抗体又称为多克隆抗体，简称多抗。1975 年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原 免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合， 形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓 瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋 巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交 瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗 原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体，简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无 限量供应。单克隆抗体技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次 革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得及广泛的应用，促进了 众多学科的发展。

由于施马伦贝格病是一种新发现的动物疫病，目前国内针对该病 尚无任何检测技术储备。为此，本发明拟在原核表达SBV N蛋白的基 础上制备其单克隆抗体，以期为该病ELISA检测方法的建立提供生物 材料。

发明内容

本发明的目的是提供施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体、其 制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种施马伦贝格病毒（SBV）核 衣壳蛋白（N）单克隆抗体，其是由保藏号为CGMCC No.7617的杂 交瘤细胞SBV-N McAb2C8分泌产生的。

本发明还提供一种制备施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体 的方法，包括以下步骤：提取SBV基因组RNA，经RT-PCR扩增获得N 基因序列，并插入到原核表达载体（如pET-28a）中，转化大肠杆菌， 例如BL(DE3)中进行诱导表达以及蛋白纯化；将纯化蛋白作为抗原免 疫动物（如小鼠），取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（如SP2/0细胞）融 合制备杂交瘤细胞，经筛选（例如采用间接ELISA对融合细胞进行筛 选）获得可稳定分泌抗施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交 瘤细胞，然后通过体内或体外的方法制备单抗。例如，将杂交瘤细胞 腹腔注射动物（如小鼠），采集腹水，分离纯化单抗，或通过体外培 养该杂交瘤细胞，收集分泌产生的单抗。

进行RT-PCR扩增所使用的引物为：

上游引物：5’-CGCGAATTCATGTCAAGCCAATTCATTTTTGAA-3’，

下游引物：5’-TTACTCGAGGATGTTGATACCGAATTGCTGCAAG-3’。

经筛选，本发明最终获得可分泌抗施马伦贝格病毒核衣壳蛋白单 克隆抗体的杂交瘤细胞SBV-N McAb2C8（单抗2C8），现已保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中科院微生物研究所，邮编100101，保藏编号 CGMCC No.7617，保藏日期2013年5月23日。

该杂交瘤细胞可用体内或体外的方法大量制备抗SBV N蛋白的 单克隆抗体2C8，用亲和层析法纯化获得抗SBV N蛋白的单抗。优选 使用Protein G-Sepharose亲和层析柱对单抗进行纯化。

本发明利用Western blot和间接免疫荧光试验对单抗2C8进行了 免疫学鉴定。结果表明，制备的单抗2C8不仅能与His-SBV-N融合蛋 白发生特异性反应，而且还能识别SBV的不同毒株。重组N蛋白及其 单抗2C8的成功制备，为施马伦贝格病ELISA检测方法的建立奠定了 物质基础。

本发明采用了间接酶联免疫技术（ELISA）法对制备的单克隆抗 体进行了筛选。用纯化的重组蛋白包被ELISA板，1%BSA封闭，PBS 洗涤，然后加入含有SBV N单克隆抗体的上清液；经过一定时间反应 后，洗去未结合的抗体；再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG； 以TMB为底物进行显色。用2M H₂SO₄终止反应后，通过酶标仪来检 测结果。

本发明进一步提供含有单抗2C8的用于检测施马伦贝格病毒的试 剂盒。

本发明的优点在于：

（一）本发明提供的抗SBV N蛋白的单克隆抗体2C8不仅能够识 别原核表达的His-SBV-N蛋白，而且能够识别SBV的不同毒株。

（二）本发明提供的单抗2C8纯度高，专一性强，重复性好，且 能保证大量供应。

（三）本发明针对施马伦贝格病毒粒子内表达量最丰富、抗原保 守性最强、最先刺激动物机体产生免疫球蛋白的核衣壳蛋白N制备了 其单克隆抗体2C8，为施马伦贝格病阻断或竞争ELISA等血清学检测 方法的建立提供了优选的生物材料。

附图说明

图1为本发明实施例1中施马伦贝格病毒RNA的RT-PCR扩增结 果；其中，1为施马伦贝格病毒，2为阴性对照，3为DNA相对分子质 量标准(DL2000)。

图2为本发明实施例1中pET-28a-SBV-N重组质粒的PCR和酶切鉴 定结果；其中，1为1kb DNA Maker；2为500bp marker；3为 pET-28a-SBV-N重组质粒；4为pET-28a-SBV-N重组质粒的EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定；5为pET-28a-SBV-N重组质粒的PCR鉴定；6为 DL2000Marker；7为pET-28a质粒；8为pET-28a质粒EcoRⅠ和XhoⅠ双 酶切鉴定。

图3为本发明实施例1中重组N蛋白在E.coli BL21(DE3)中诱导表 达情况的SDS-PAGE分析结果；其中，1为蛋白质相对分子质量标准； 2为诱导前的pET-28a-SBV-N重组质粒阳性BL21菌体蛋白；3为诱导6h 的pET-28a-SBV-N重组质粒阳性BL21菌体蛋白；4为诱导6h的 pET-28a-SBV-N重组质粒阳性BL21菌体裂解产物的沉淀（即包涵体）； 5为诱导6h的pET-28a-SBV-N重组质粒阳性BL21菌体裂解产物的上 清液；6为诱导前的pET-28a-c(+)空载体BL21菌体蛋白；7为诱导6h 的pET-28a-c(+)空载体BL21菌体蛋白；8为诱导前的BL21空菌菌体蛋 白；9为诱导6h的BL21空菌菌体蛋白。

图4为本发明实施例1中纯化后的重组N蛋白的SDS-PAGE分析结 果；其中，1为蛋白质相对分子质量标准；2为经镍离子金属螯合柱纯 化的重组N蛋白。

图5为本发明实施例4中单克隆抗体2C8与重组N蛋白反应性的 Western blot分析结果；其中，1为蛋白质相对分子质量标准；2为洗脱 缓冲液对照；3为经镍离子金属螯合柱纯化的重组N蛋白。

图6为本发明实施例4中单克隆抗体2C8与SBV不同毒株反应性的 Western blot分析结果；其中，1为蛋白质相对分子质量标准；2为未感 染的BHK-21细胞；3为SBV BH80株感染的BHK-21细胞；4为SBV BH652株感染的BHK-21细胞；5为SBV BH619株感染的BHK-21细胞。

图7为本发明实施例5中SBV N蛋白单克隆抗体2C8的间接免疫荧 光分析结果；其中，A为SBV感染的BHK-21细胞；B为未接毒的 BHK-21细胞。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1施马伦贝格病毒核衣壳蛋白N的原核表达

1SBV N基因的扩增

根据GenBank中已公布的SBV S基因序列（登录号HE649914，S 基因序列中含N基因序列）设计了一对用于N基因克隆的特异性引物， 并分别在上下游引物的5’端引入了限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的 识别序列。其中，上游引物序列为： 5’-CGCGAATTCATGTCAAGCCAATTCATTTTTGAA-3’（下划线处为 EcoRⅠ识别位点），下游引物序列为： 5’-TTACTCGAGGATGTTGATACCGAATTGCTGCAAG-3’（下划线处 为XhoⅠ识别位点），预期扩增片段的大小为717bp（包括EcoRⅠ、Xho  Ⅰ的识别序列和保护性碱基）。以德国FLI研究所提供的SBV RNA为 模板，利用RT-PCR扩增SBV N基因序列。50μL的RT-PCR反应体系 包括：10×One-Step RNA PCR缓冲液5μL、MgCl₂（25mmol/L）10μL、 dNTP混合物（10mmol/L）5μL、RNase抑制剂（40U/μL）1μL、 AMV RTase XL（5U/μL）1μL、AMV-Optimized Taq（5U/μL）1μL、 上游引物（10μmol/L）2μL、下游引物（10μmol/L）2μL、SBV RNA 4μL、无RNA酶双蒸水19μL。反应条件为：50℃反转录30min；94 ℃热灭活反转录酶2min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸45s， 进行30个循环。琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增产物的大小约为717 bp，与预期大小一致（图1）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回 收，并测定回收产物的浓度。

2重组表达载体pET-28a-SBV-N的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切PCR胶回收产物以及原核 表达载体pET-28a-c(+)，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收， 并利用T4DNA连接酶连接回收的SBV N基因片段与pET-28a-c(+)载 体回收片段，以构建重组质粒pET-28a-SBV-N，然后将重组质粒转化 E.coli BL21（DE3），经PCR鉴定和双酶切鉴定后，送生工生物工程（上 海）股份有限公司测序。鉴定结果表明，N基因序列、插入位置以及 阅读框都准确无误（图2）。

3重组N蛋白的诱导表达与可溶性分析

将pET-28a-SBV-N重组质粒阳性的E.coli BL21（DE3）划线接种 于含卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑取阳性重组菌的单菌落， 接种于100mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃活化过夜后，以1：100 比例接种2×YT培养基，37℃200rpm振摇培养至对数生长期（OD600 ≈0.6）。加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于28℃150rpm振摇诱导 培养6h。分别于诱导前和诱导后取出适量菌液，收集菌体进行 SDS-PAGE验证重组N蛋白的表达情况。此外，为了确定重组N蛋白的 表达形式，另取100mL诱导6h的菌液，12000rpm离心5min，收集 菌体沉淀，用3mL PBS重悬菌体沉淀，并用超声波破碎菌体（工作 循环30%，超声10s，间歇10s，破碎时间30min），然后将裂解液以 12000rpm离心20min，分别收集上清液和沉淀（包涵体）进行 SDS-PAGE分析。结果表明，目的蛋白在上清及包涵体中均有所表达， 而且在上清中的表达量稍多一些（图3）。

4重组N蛋白的纯化

将1L阳性重组菌液诱导表达6h后，以6000rpm离心5min，收 集菌体沉淀。向沉淀中加入50mL PBS重悬菌体，并向其中加入终浓 度为1mg/mL溶菌酶，置冰上放置30min。对菌体进行超声波破碎（工 作循环30%，超声10s，间歇10s，破碎时间为3min），然后将菌体裂 解液以12000rpm离心30min，收集上清液，用0.22μm滤器过滤去除 杂质。按照QIAGEN Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook的操作说 明对重组N蛋白进行纯化，并采用Bradford法测定重组N蛋白的终浓 度。

5重组N蛋白的SDS-PAGE分析

配制12%分离胶和5%浓缩胶，用PBS将纯化的重组N蛋白做1：100 倍稀释后，取50μL蛋白稀释液与等体积的1×SDS-PAGE上样缓冲液 混匀，沸水浴煮5min，12000rpm离心5min，收集上清液做 SDS-PAGE，每个泳道的上样量为10μL。电泳条件为：60V30min、 120V2h。SDS-PAGE结果表明，重组N蛋白得到了高度纯化（图4）。

实施例2施马伦贝格病毒核衣壳蛋白N单克隆抗体的制备

1BALB/c小鼠免疫流程

以纯化后的重组N蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠。具体免疫程序 及流程如下：

1）初次免疫：重组N蛋白加弗氏完全佐剂皮下多点注射小鼠， （80μg/只，250μL/只）；完全佐剂，背部皮下多点免疫；

2）第二次免疫：1周后剂量减半，加弗氏不完全佐剂皮下多点注 射小鼠；

3）第三次免疫：1周后剂量同上，加弗氏不完全佐剂皮下多点注 射小鼠（5～7天后采血测其效价，检测免疫结果）；

4）加强免疫：三免1周后加强免疫1次，剂量为80μg/只，皮下多 点注射小鼠；

5）加强免疫3天后，无菌取脾细胞，制备脾细胞悬液。

2免疫脾细胞的制备

加强免疫3天后，无菌取脾细胞，制备脾细胞悬液，具体操作如下：

1）脱臼法处死小鼠；

2）将小鼠放于75%酒精中浸泡消毒后，以无菌剪刀剪开其腹部， 取出脾脏，置于无菌的含少量培养液（1640培养液）的平皿中不锈钢 晒网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数；

3）冰上收集脾细胞悬液，离心去上清；

4）将沉淀用新鲜RPMI-1640培养液再次离心洗涤；

5）加入新鲜RPMI-1640培养液；计数脾细胞。

3骨髓瘤细胞的复苏

骨髓瘤细胞SP2/0保存于-196℃液氮罐中，试验时将其复苏、增 殖、传代即可。在融合前48-36h，应先用含15μg/mL8-氮鸟嘌呤的培 养基作扩大培养，取约1×10⁷～5×10⁷/mL对数生长期的骨髓瘤细胞， 在室温离心（400rpm）10min，沉淀用2.5%胎牛血清（FCS）-1640培 养液再悬浮离心，重悬混匀待用，并最后计数。

4饲养细胞的制备

在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细 胞会有严重污染。具体操作如下：

1）脱臼处死小鼠，75%酒精浸泡消毒10min；

2）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔；

3）用注射器将4～5mL无血清RPMI-1640培养液注入腹腔，用手 指轻柔按摩腹部，仍用该注射器回抽腹腔液体，移入离心管；

4）1000rpm离心10min，去上清；

5）用含20%小牛血清（NCS）的RPMI-1640培养液混悬，调整细 胞数4×10⁵/mL；

6）用1mL吸管将细胞加入96孔培养板，每孔0.05mL（含2万个细 胞），放入37℃、5%CO₂培养箱培养，所得饲养细胞即可供细胞融合 和克隆化之用。

5细胞融合

细胞融合的基本步骤是将骨髓瘤细胞与免疫细胞混合后，在 PEG4000的作用下使两种细胞彼此融合，将融合后的细胞适当稀释， 分置含滋养细胞的培养板中培养。具体操作如下：

1）将经预先处理好的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:5的比例混 合，在50mL塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8min；

2）弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG浓度。轻轻弹 击离心管底，使细胞沉淀略加松动；

3）将37℃水浴中保温的50%PEG（分子量4000）0.5mL，缓慢滴 入离心管，1min内加完，边滴边摇；

4）加预热的不完全培养液，每隔2min分别加入1mL、2mL、3mL、 4mL、5mL和10mL，终止PEG4000作用。

5）离心，800rpm，6min；

6）弃上清，先用约6mL含20%小牛血清的RPMI-1640培养基 （Gibco，美国）轻轻混悬，切忌用力吹打，以免使融合在一起的细 胞散开；

7）用无菌吸管将融合后细胞悬液加入含有预先接种了滋养细胞 的96孔板，100μL/孔，放入37℃、5%CO₂培养箱培养。

6HAT筛选杂交瘤

一般在融合24h后，加次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶核苷（HAT， Sigma，美国）选择培养液。用时将1mL加入50mL含20%小牛血清的 完全培养液中。由于脾细胞在体外培养条件下只能存活几天，不影响 杂交瘤细胞生长；而骨髓瘤细胞由于在叶酸抑制剂氨基蝶呤存在时无 法合成嘌呤环合胸腺嘧啶甲基而不能合成DNA，同时又因为它是 HGPRT-和TK-的缺陷型，无法利用培养液中的HGPRT和TK来合成 DNA，因此骨髓瘤细胞在这种培养液中无法存活。这样最后能在HAT 培养液中存活的就只有杂交瘤细胞，因为它具有两种亲代细胞的染色 体，可以产生原来脾细胞所具有的HGPRT，又从骨髓瘤细胞中获得 了在细胞培养基中长期生存繁殖的能力。

当HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培 养一周，改用一般培养液。

通过选择性培养而获得的杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫 原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始 检测特异性抗SBV N蛋白的抗体，筛选出所需要的高分泌的杂交瘤细 胞系。

7杂交瘤细胞的克隆化

融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后应有36%的孔为1个细胞/孔。 依据ELISA检测筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化。克隆 化的原则是，经间接ELISA检测为N蛋白抗体阳性的杂交瘤细胞孔应 尽早进行克隆化，即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆。 具体操作如下：

1）制备饲养细胞悬液（同融合前的饲养细胞准备）；

2）阳性孔细胞的计数，并调节细胞数在1×10³～5×10³/mL；

3）取130个细胞放入6.5mL含饲养细胞完全培养液（即20个细胞 /mL），以100μL/孔加A、B、C三排，即为每孔2个细胞；余下2.9mL 细胞悬液补加2.9mL含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/mL， 以100μL/孔加D、E、F三排，既为每孔1个细胞；余下2.2mL细胞悬液 补加2.2mL含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/mL，以100μL/孔， 加G、H两排，即为每孔0.5个细胞；

4）培养4～5天后，补加完全培养液200μL/孔；

5）第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗N蛋白的单克隆 抗体的检测。

将分泌抗体的阳性孔经有限稀释法进行3次亚克隆，获得了1株 可以稳定分泌抗SBV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（命名为SBV-N  McAb2C8，简称2C8）。

8抗SBV N蛋白单克隆抗体的腹水制备

筛选出的阳性抗N蛋白杂交瘤细胞株应及早进行单克隆抗体的 大量制备。本试验采用的是小鼠腹腔接种法，在小鼠体内接种抗SBV N蛋白的杂交瘤细胞，制备腹水。具体操作如下：

1）BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只；

2）1～2周后，同法对上述小鼠进行腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞；

3）接种细胞7～14天后可产生腹水，此时小鼠腹部明显隆起，手 触有波动感，用16号针头采集腹水；

4）将收集到的腹水1500rpm，离心30min，及时纯化。

2.9抗SBV N蛋白单克隆抗体的纯化

腹水中的特异性抗SBV N蛋白的抗体浓度较抗血清中的浓度高， 纯化效果好。本试验采用的是Protein G-Sepharose亲和层析进行抗体 纯化，具体操作如下：

1）平衡：用Binding Buffer（20mmol/L、pH7.0PBS）平衡蛋白G 亲和柱至基线平稳；

2）上样：将腹水样品上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱， 继续平衡至基线平稳；

3）洗脱：加入洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE 检测纯度；

4）用0.01M，pH7.2PBS透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保 存在0.01M，pH7.2PBS环境中；

5）用蛋白定量检测仪测定纯化后单抗（2C8）的浓度。结果表明， 单抗2C8的浓度为1.2mg/mL。

2.10阳性杂交瘤细胞培养上清的抗体亚型的鉴定

抗体亚型的检测试剂盒由Southern Biotech公司生产，具体实验方 法参照厂家说明书。鉴定结果表明，单抗2C8的亚型为IgG2a+kappa。

实施例3抗SBV N蛋白单克隆抗体效价测定——ELISA检测

1、包被：以纯化的重组N蛋白为检测抗原，包被浓度为2μg/ml， 100μL/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。

2、封闭：加150μL/孔的封闭液，37℃2小时后，洗涤3次，拍 干。置4℃冰箱保存备用。

3、加待测样品：

1）对于血清/抗体/腹水效价检测，第一个孔1:1000稀释，往 下以1:2的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

2）对于细胞上清检测，吸取细胞上清100μL，加入对应的酶 标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。

3）加二抗：取辣根酶标记的羊抗鼠IgG（IgG特异二抗）按1： 5000倍稀释后，100μL/孔，37℃孵育20至30min,洗涤4次，拍干。

5、显色：稀释20×TMB至1×TMB，按100μL/孔加入，37℃显 色15-30min。

6、终止：加入终止液（2M H₂SO₄）50μL/孔。

7、读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD 值的比值（P/N）大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。 效价测定结果表明，单抗2C8的效价为1:64000。

注：a.筛选阳性细胞时，P/N>2.1的判别为阳性细胞；1<P/N<2.1 的细胞孔加大包被浓度后再次检测，P/N>2.1的仍判为阳性。

b.单抗效价以P/N>2.1时杂交瘤细胞上清或纯化单抗的最大稀释 倍数表示。

实施例4抗施马伦贝格病毒核衣壳蛋白N单克隆抗体（2C8）的 Western blot鉴定

1试验目的

验证单克隆抗体2C8能否与重组N蛋白以及SBV的天然核衣壳蛋 白（N）发生反应。

2试验材料

细胞系：BHK-21。

SBV毒株：BH80/11-4、BH652/12-1、BH619/12、D512/12、 D495/12-1和D495/12-2；病毒储存液的病毒含量为10⁶TCID₅₀/mL。

HRP-山羊抗鼠IgG（货号P0447）：购自丹麦的Dako公司。

3操作步骤

3.1蛋白样品的制备

用胰酶将被SBV不同毒株感染的细胞和对照组细胞（约2.0×10⁶个/瓶）从细胞瓶的瓶壁上消化下来，用吸管将其转移至15mL离心 管中，4℃300×g离心6min，轻轻倒掉细胞上清液，用2mL PBS重悬 细胞沉淀，置4℃冰箱保存备用。

3.2SDS-PAGE

3.2.1制胶①按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液使其混合均 匀，然后将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃板中，再在液面上小心注入 一层去离子水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置约30min以使分离 胶完全聚合。②按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以 避免过多地接触氧气。吸去分离胶上面的去离子水后，将浓缩胶平稳 地注入分离胶上层，然后小心插入梳子并防止齿尖留有气泡，静置约 30min以保证胶液完全聚合。

3.2.2煮样按照每10μL蛋白样品加入10μL2×蛋白上样缓冲液 的比例，混合蛋白样品和2×蛋白上样缓冲液；用沸水将样品加热5 min，以使蛋白充分变性；冷却至室温后，12000rpm离心5min，保 留上清液。

3.2.3加样预电泳后，各取5μL蛋白标准（Marker）和15μL待 分析的蛋白样品（重组N蛋白和SBV感染BHK-21细胞的总蛋白）上样 至SDS-PAGE胶加样孔内即可（加样时间要尽量短，以免样品扩散， 可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应）。

3.2.4电泳加样完毕，100V电泳约90min，电泳至溴酚蓝染 料前沿到达凝胶末端，即可停止电泳。

3.3Western Blot

3.3.1转膜采用半干电转印法将蛋白质（重组N蛋白和SBV感染 BHK-21细胞的总蛋白）从SDS-PAGE凝胶中转移至固相支持物PVDF 膜上。连接电极，开通电源，60mA转印45min。

3.3.2膜的封闭用PBS漂洗转印后的PVDF膜，然后将PVDF膜放 入含5%脱脂奶的PBS内，于摇床上室温摇动封闭1h。

3.3.3一抗孵育将单克隆抗体2C8用10mL TBST作1:1000倍稀 释后，将剪开的PVDF膜放入其中，于摇床上室温摇动孵育1h。

3.3.4洗膜用PBST洗膜3次，每次5min。

酶标二抗孵育将HRP-山羊抗鼠IgG TBST分别作1:10000稀释 后，将膜置于二抗稀释液中并于摇床上室温摇动孵育1h。

3.3.5洗膜用PBST洗膜3次，每次5min。

3.3.6底物反应配制化学发光检测液（GE Healthcare,RPN2135） 20mL；用平头镊子将免疫反应后的膜放入其中，室温避光反应5min。 然后，将膜置于洁净的平皿上。

3.3.7拍照将膜置ChemoCam成像系统内拍照，保存。

4试验结果

Western blot结果表明，中国检科院制备的鼠抗施马伦贝格病毒 （SBV）核衣壳蛋白（N）的单克隆抗体2C8不仅能与重组N蛋白发生 特异性反应，而且还能识别SBV的不同毒株（图5和图6）。

实施例5抗施马伦贝格病毒核衣壳蛋白N单克隆抗体（2C8）的间 接免疫荧光鉴定

1试验目的

进一步验证鼠抗施马伦贝格病毒（SBV）核衣壳蛋白（N）的单 克隆抗体2C8能否与SBV的天然核衣壳蛋白（N）发生反应。

2试验材料

细胞系：BHK-21。

SBV毒株：BH80/11-4。

FITC-山羊抗鼠IgG（货号F0479）：购自丹麦的Dako公司。

3操作步骤

3.1铺板选择形态正常、生长良好的BHK-21细胞，用胰酶消化 后，将单细胞悬液以约10⁵个/mL的密度接种于96孔细胞培养板 （Corning Incorporated,3599）中，每孔100μL；于37℃5%CO₂培养 箱中过夜培养，形成90%左右的单层细胞。

3.2接毒小心吸弃上清后，以200TCID₅₀/孔的剂量（20μL）将 施马伦贝格病毒（SBV）接种于细胞板1、3、5、7、9和11垂直行各 孔内的BHK-21细胞中，而2、4、6、8、10和12垂直行各孔内的BHK-21 细胞为不接毒阴性对照，于37℃5%CO₂培养箱中继续培养2d。

3.3固定小心吸弃各孔内的病毒残液，用TBST洗涤1次，然后 用风扇将其吹干或置室温过夜干燥。将细胞板置80℃加热箱固定2h 以使细胞完全固定。

3.4一抗孵育用TBST将鼠抗SBV衣壳蛋白N单抗McAb（1:100） 和兔抗SBV衣壳蛋白N多抗PcAb稀释后，向相应孔内加入100μL抗体 稀释液，于室温摇床上孵育1h。

3.5洗涤用TBST洗涤3次，每次5min。

3.6二抗孵育用TBST将FITC标记的山羊抗鼠IgG（1:200）和 FITC标记的猪抗兔IgG（1:200）稀释后，向相应孔内加入100μL FITC 标记抗体稀释液，于室温摇床上孵育1h。

3.7洗涤用TBST洗涤3次，每次5min。最后，向各孔加入50μL 荧光保护缓冲液（Fluorescence conservation buffer，Sigma,Cat.No. D2522）。

3.8荧光显微镜观察寻找最佳拍照区域，调整对比度及放大倍 数后，进行拍照，保存照片。

4试验结果

结果表明，单抗2C8能够识别SBV（图7）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。