抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及功能验证

摘要

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以脱水、腹泻、肠绒毛严重萎缩为主要病变的传染病。2010年以来，PEDV变异株在世界多国猪场相继暴发流行，其对哺乳仔猪致病性强、死亡率高，一周龄以下的仔猪感染后其致死率可高达100％。该PEDV变异株的出现在中国及全球造成重大经济损失，严重威胁着养猪业的健康发展，开发用于检测PEDV感染的制剂和相应方法显得尤为重要且紧迫。核衣壳蛋白(N)在不同的PEDV毒株间高度保守、且在宿主感染早期合成，因此，PEDV N蛋白是作为感染早期检测的理想靶标。为有助于开发一系列检测PEDV感染的方法，本研究制备了抗PEDVN蛋白的单克隆抗体，并测试了其在不同检测方法中的应用前景。 首先，本研究从PEDV LJX/2014毒株中采用RT-PCR方法扩增获得了N基因，随后将其因克隆至pET-30a(+)原核表达载体，获得了表达PEDVN蛋白的重组表达质粒，并将其命名为pET-N。将pET-N转化至BL-21(DE3)感受态细胞中表达N蛋白，结果表明，该目标蛋白以分泌型及包涵体形式同时表达。经优化表达条件，最终获得大量分泌型表达的N蛋白。采用镍柱亲和层析技术对所获得的重组N蛋白进行纯化，结果显示，本研究获得高纯度的PEDVN蛋白。 将200μg纯化后的PEDV N蛋白与ISA15佐剂混合后于背部皮下多点免疫BALB/c小鼠，每两周以相同剂量及方式进行加强免疫。第三次免疫一周后，采用等量N蛋白于腹腔注射进行加强免疫，3d后处死小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过三轮亚克隆筛选后，共获得6株稳定分泌抗PEDVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经单克隆抗体分型试剂盒鉴定，该6株单克隆抗体(mAbs)的重链均为IgG1亚类，轻链为κ链。制备6株mAbs的腹水，其抗体滴度均在稀释度128000倍以上。 除采用ELISA检测纯化后的PEDVN蛋白与mAbs的反应性外，还采用IFA和流式细胞术检测PEDV LJX/2014毒株接种的Vero-E6细胞与6株mAbs的反应性，同时用Western blotting检测其细胞裂解物与mAbs的反应性，上述结果均显示，本课题制备的mAbs均能用于间接免疫荧光(IFA)、Western blotting以及流式细胞术的检测分析。 采用截短表达的策略，对mAb进行表位鉴定，采用间接ELISA方法分析这6株mAbs的表位所在区段。结果表明，3F12单抗株识别线性表位VAAKDALKSLGI，推测其余单抗株分别识别N181-379区段内的不同构象表位。 综上所述，本研究成功制备了6株针对PEDV N蛋白的mAbs;测定了6株rnAbs的亚型及其亲和性;分析了它们在ELISA、IFA、Western blotting和流式细胞术等方法中的应用;制备了6株mAbs的腹水，鉴定了mAbs的抗原表位。