一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法

摘要

本发明公开了一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法，采用现有方法进行初代诱导（种子萌发）、继代增殖步骤获得丛生芽，与现有技术不同的是：生根壮苗阶段采用以假鳞茎诱导假鳞茎的方法。采用本方法可以将繁殖系数在原有的基础上再增加3～5倍，提高繁殖系数，组培苗健壮，根系发达，可大大降低白芨组培苗生产成本。而且本方法操作简单，生产成本低，可在短时间内生产出大量优质种苗，为白芨大规模人工栽培提供种苗保障和技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体是一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法。

背景技术

白芨（Bletilla striata(Thunb.) Reichb.f.）又名白及、地螺丝、白鸡儿、刀口药、连及草，为兰科多年生草本植物。在我国白芨作为药用已有上千年的历史，其假鳞茎具收敛止血、补肺、消肿生肌之功效，外敷治疗创伤出血、痛肿、烫伤和疗疮，内治吐血、肺病、咳血、慢性胃溃疡以及肿瘤等。现代研究表明，白芨的提取物不仅无毒副作用，还具有较强的抗氧化和抗衰老作用，添加到化妆品中可以起到消炎、止痒、消退色斑、消除痤疮、防止粗糙、抗冻防裂等作用，兼备保健、护肤及美容之功效。此外，白芨在化工、陶瓷以及观赏园林等领域广泛应用。

白芨原产我国，分布于广西、贵州、云南、安徽和四川等省，广西为主产区之一。白芨生于荫蔽草丛、林下潮湿地或岩石缝中，产量低。一直以来，市场上流通的白芨原料以野生为主。由于其应用日益广泛，需求量与日俱增，价格大幅攀升，已由2000年的8元/kg上升到目前的200元/kg。然而白芨遭连年掠夺式地采挖、其天然生境日益恶化以及自身繁殖能力差等因素，野生蕴藏量正以10%～15%逐年递减，分布范围逐年缩小，濒临灭绝边缘，已被国家列为重点保护的野生药用植物之一。因此，白芨的人工栽培不仅可以获取丰厚的经济回报，而且还可以有效保护白芨的野生自然资源，维护生态系统多样性，具有良好的社会效益。

目前白芨的主要繁殖方式为分株繁殖，不仅繁殖系数低、用种量大、占用药用资源以及品种退化等诸多问题，使得白芨很难大面积规模化生产。随着现代生物技术的应用和发展，白芨组培快繁技术得到很大发展。该技术分为初代诱导、继代增殖、生根培养和移栽等环节，繁殖系数主要体现在继代增殖这一技术环节，目前白芨快繁技术的繁殖系数为2~5，以此计算其组培苗的成本，价格居高不下，成了制约其组培苗推广应用的主要因素。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术不足，提供一种白芨组培苗更高繁殖系数的方法，在白芨组培快繁技术的生根阶段，以假鳞茎诱导假鳞茎，进一步提高繁殖系数。该方法操作简单，生产成本低，高效稳定。

实现本发明目的的技术方案是：

一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法，采用现有方法进行初代诱导（种子萌发）、继代增殖步骤获得丛生芽，与现有技术不同的是：生根壮苗阶段采用以假鳞茎诱导假鳞茎的方法，包括以下步骤：

（1)在超净工作台上，将白芨丛生芽切分成单芽接入生根培养基中，培养20～40 d，白芨芽的基部膨大形成假鳞茎，并长有根；所述生根培养基为：1/2MS+6-BA 0.1～0.5 mg/L+IBA 0.3～0.8 mg/L+IAA 0.5～1.5 mg/L+0.1%活性炭+15%马铃薯+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.5；

（2）在超净工作台上，将灭菌过的诱导剂加入步骤（1）中诱导出小假鳞茎的组培苗中，每瓶加入10～20 ml，培养40～50 d，原假鳞茎上长出3～5个新的小假鳞茎，形成丛生假鳞茎，每个小假鳞茎基部都长有3～8条不定根；所述诱导剂为：KT 0.5～2.5 mg/L+IAA 0.2～1.0 mg/L+2,4-D 0.1～1.0 mg/L，pH值为6.5；

（3）将步骤（2）中生长有丛生假鳞茎、芽高达2～5 cm的组培苗移出培养室，室内炼苗3 d，取苗，小心地将根部附着的培养基洗净，用刀将丛生假鳞茎从每个假鳞茎的基部切分为单个小假鳞茎，在消毒药液中浸泡10 s，放于盘中备用；所述消毒液为：噻唑锌500倍液；

（4）将步骤（3）的小假鳞茎假植于消毒过的树皮屑中30～60 d，在温室大棚内保持温度为22～28℃，湿度为65%～80%；之后，移栽于1/2腐殖土+1/2沙子中，成活率可达87.9%～98.2%。

所述步骤（1）中生根培养基优选为：1/2MS+6-BA0.2 mg/L+IBA0.5 mg/L+IAA1.0 mg/L+0.1%活性炭+15%马铃薯+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.5。

所述步骤（2）中诱导剂优选为：KT 1.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L +2,4-D 0.5 mg/L，pH值为6.5。

所述步骤（2）中诱导小假鳞茎培养阶段的培养条件是：培养温度为25±3℃, 光照时间为12 h/d, 光照强度为2000 lx。

本发明中，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，KT为激动素，IBA为吲哚丁酸，IAA为吲哚-3-乙酸，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，试剂均为分析纯，水为超纯水。

本发明的优点：采用本方法可以将繁殖系数在原有的基础上再增加3～5倍，提高繁殖系数，组培苗健壮，根系发达，可大大降低白芨组培苗生产成本。而且本方法操作简单，生产成本低，可在短时间内生产出大量优质种苗，为白芨大规模人工栽培提供种苗保障和技术支持。

表中是采用现有白芨的快繁方法与采用本发明方法的繁殖系数对比：

从表中可以看出采用本发明方法，生根培养阶段的繁殖系数是现有方法的3～5倍。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例1

一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法，采用现有方法进行初代诱导（种子萌发）、继代增殖步骤获得丛生芽，生根壮苗阶段采用以假鳞茎诱导假鳞茎的方法，包括以下步骤：

（1)在超净工作台上，将白芨丛生芽切分成单芽接入生根培养基中，培养30 d，白芨芽的基部膨大形成假鳞茎，并长有根；所述生根培养基为：1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+0.1%活性炭+15%马铃薯+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.5；

（2）在超净工作台上，将灭菌过的诱导剂加入步骤（1）中有假鳞茎的组培苗中，每瓶加入10～20 ml，10 d假鳞茎上长芽，14 d芽基部开始长出不定根，23 d芽的基部膨大，32 d形成丛生假鳞茎，45 d统计原假鳞茎上的新的小假鳞茎的数量为5.06个，大小为4.78 mm，根数为6.27条/个,所述诱导剂为：KT 1.5 mg/L+IAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5 mg/L，pH值为6.5；

（3）将步骤（2）中生长有丛生假鳞茎、芽高达2～5 cm的组培苗移出培养室，室内炼苗3 d，取苗，小心地将根部附着的培养基洗净，用刀将丛生假鳞茎从每个假鳞茎的基部切分为单个小假鳞茎，在消毒药液中浸泡10 s，放于盘中备用；所述消毒液为：噻唑锌500倍液；

（4）将步骤（3）的小假鳞茎假植于消毒过的树皮屑中30～60 d，在温室大棚内保持温度为22～28℃，湿度为65%～80%；之后，移栽于1/2腐殖土+1/2沙子中，成活率可达98.2%。

实施例2

一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法，采用现有方法进行初代诱导（种子萌发）、继代增殖步骤获得丛生芽，生根壮苗阶段采用以假鳞茎诱导假鳞茎的方法，包括以下步骤：

（1)在超净工作台上，将白芨丛生芽切分成单芽接入生根培养基中，培养30 d，白芨芽的基部膨大形成假鳞茎，并长有根；所述生根培养基为：1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+0.1%活性炭+15%马铃薯+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.5；

（2）在超净工作台上，将灭菌过的诱导剂加入步骤（1）中有假鳞茎的组培苗中，每瓶加入10～20 ml，12 d假鳞茎上长芽，18 d芽基部长出白色的根，27 d芽的基部膨大，38 d形成丛生假鳞茎，45 d统计原假鳞茎上的新的小假鳞茎的数量为3.98个，大小为3.54 mm，根数为5.34条/个；所述诱导剂为：KT 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L，pH值为6.5；

（3）将步骤（2）中生长有丛生假鳞茎、芽高达2～5 cm的组培苗移出培养室，室内炼苗3 d，取苗，小心地将根部附着的培养基洗净，用刀将丛生假鳞茎从每个假鳞茎的基部切分为单个小假鳞茎，在消毒药液中浸泡10 s，放于盘中备用；所述消毒液为：噻唑锌500倍液；

（4）将步骤（3）的小假鳞茎组培苗假植于消毒过的树皮屑中30～60 d，在温室大棚内保持温度为22～28℃，湿度为65%～80%；之后，移栽于1/2腐殖土+1/2沙子中，成活率为92.4%。

实施例3

一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法，采用现有方法进行初代诱导（种子萌发）、继代增殖步骤获得丛生芽，生根壮苗阶段采用以假鳞茎诱导假鳞茎的方法，包括以下步骤：

（1)在超净工作台上，将白芨丛生芽切分成单芽接入生根培养基中，培养30 d，白芨芽的基部膨大形成假鳞茎，并长有根；所述生根培养基为：1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+0.1%活性炭+15%马铃薯+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.5；

（2）在超净工作台上，将灭菌过的诱导剂加入步骤（1）中有假鳞茎的组培苗中，每瓶加入10～20 ml，8 d假鳞茎上长芽，13 d芽基部开始长出不定根，20 d芽的基部膨大，30 d形成丛生假鳞茎，45 d统计原假鳞茎上的新的小假鳞茎的数量为3.26个，大小为5.33 mm，根数为3.85条/个，叶片呈不规则卷曲状，变异苗比较多；所述诱导剂为：KT 2.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L，pH值为6.5；

（3）将步骤（2）中生长有丛生假鳞茎、芽高达2～5 cm的组培苗移出培养室，室内炼苗3 d，取苗，小心地将根部附着的培养基洗净，用刀将丛生假鳞茎从每个假鳞茎的基部切分为单个小假鳞茎，在消毒药液中浸泡10 s，放于盘中备用；所述消毒液为：噻唑锌500倍液；

（4）将步骤（3）的小假鳞茎假植于消毒过的树皮屑中30～60 天，在温室大棚内保持温度为22～28℃，湿度为65%～80%；之后，移栽于1/2腐殖土+1/2沙子中，成活率为87.9%。

实施例4

一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法，采用现有方法进行初代诱导（种子萌发）、继代增殖步骤获得丛生芽，生根壮苗阶段采用以假鳞茎诱导假鳞茎的方法，包括以下步骤：

（1)在超净工作台上，将白芨丛生芽切分成单芽接入生根培养基中，培养30 d，白芨芽的基部膨大形成假鳞茎，并长有根；所述生根培养基为：1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.3 mg/L +IAA 0.5 mg/L+0.1%活性炭+15%马铃薯+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.5；

（2）在超净工作台上，将灭菌过的诱导剂加入步骤（1）中有假鳞茎的组培苗中，每瓶加入10～20 ml，12 d假鳞茎上长芽，16 d芽基部开始长出不定根，25 d芽的基部膨大，35 d形成丛生假鳞茎，45 d统计原假鳞茎上的新的小假鳞茎的数量为4.77个，大小为4.28 mm，根数为5.42条/个,所述诱导剂为：KT 1.5 mg/L+IAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5 mg/L，pH值为6.5；

（3）将步骤（2）中生长有丛生假鳞茎、芽高达2～5 cm的组培苗移出培养室，室内炼苗3 d，取苗，小心地将根部附着的培养基洗净，用刀将丛生假鳞茎从每个假鳞茎的基部切分为单个小假鳞茎，在消毒药液中浸泡10 s，放于盘中备用；所述消毒液为：噻唑锌500倍液；

（4）将步骤（3）的小假鳞茎假植于消毒过的树皮屑中30～60 d，在温室大棚内保持温度为22～28℃，湿度为65%～80%；之后，移栽于1/2腐殖土+1/2沙子中，成活率为96.4%。

实施例5

一种以假鳞茎诱导假鳞茎的白芨高效繁殖方法，采用现有方法进行初代诱导（种子萌发）、继代增殖步骤获得丛生芽，生根壮苗阶段采用以假鳞茎诱导假鳞茎的方法，包括以下步骤：

（1)在超净工作台上，将白芨丛生芽切分成单芽接入生根培养基中，培养30 d，白芨芽的基部膨大形成假鳞茎，并长有根；所述生根培养基为：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.8 mg/L +IAA 1.5 mg/L+0.1%活性炭+15%马铃薯+蔗糖20 g/L+琼脂5 g/L，pH值为6.5；

（2）在超净工作台上，将灭菌过的诱导剂加入步骤（1）中有假鳞茎的组培苗中，每瓶加入10～20 ml，10 d假鳞茎上长芽，14 d芽基部开始长出不定根，23 d芽的基部膨大，32 d形成丛生假鳞茎，45 d统计原假鳞茎上的新的小假鳞茎的数量为4.50个，大小为4.93 mm，根数为5.20条/个,叶片稍有卷曲，所述诱导剂为：KT 1.5 mg/L+IAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5 mg/L，pH值为6.5；

（3）将步骤（2）中生长有丛生假鳞茎、芽高达2～5 cm的组培苗移出培养室，室内炼苗3 d，取苗，小心地将根部附着的培养基洗净，用刀将丛生假鳞茎从每个假鳞茎的基部切分为单个小假鳞茎，在消毒药液中浸泡10 s，放于盘中备用；所述消毒液为：噻唑锌500倍液；

（4）将步骤（3）的小假鳞茎假植于消毒过的树皮屑中30～60 d，在温室大棚内保持温度为22～28℃，湿度为65%～80%；之后，移栽于1/2腐殖土+1/2沙子中，成活率为95.0%。

通过以上的实施案例和实验结果对比表可以看出，生根培养基（1/2MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L）为固定因素，诱导剂中植物生长调节剂的浓度影响效应呈抛物线关系，在浓度为KT 0.5~1.5 mg/L+IAA 0.2~0.5mg/L+2,4-D 0.1~ 0.5 mg/L范围时，诱导出的假鳞茎的数量和大小均随着植物生长调节剂浓度的提高而增加，浓度增至KT 1.5 mg/L+IAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5 mg/L时，假鳞茎的数量达到最大，继续增加浓度，假鳞茎的数量呈下降趋势，虽然假鳞茎的个头有所增加，可苗已开始出现变异，影响成活率和以后的生长；诱导剂中的植物生长调节剂的浓度（KT 1.5 mg/L+IAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5 mg/L）为固定因素，改变生根培养基中的植物生长调节剂浓度时，产生的效应呈抛物线关系，与诱导剂中植物生长调节剂的浓度变化效应基本相同，但对于假鳞茎的数量增幅方面来说，诱导剂的作用明显优于生根培养基的作用，说明诱导剂在假鳞茎诱导假鳞茎中起主要作用，生根培养基起辅助作用。因此，诱导剂和生根培养基中的植物生长调节剂浓度合适（生根培养基为1/2MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L，诱导剂为KT 1.5 mg/L+IAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5 mg/L），诱导的假鳞茎数量最多，个头较大，成活率最高。

实施例的结果对比表