一种鉴定棉花枯萎病抗性的适乐时包衣菌土营养钵法

摘要

本发明涉及植物病理学领域，具体地，本发明涉及一种鉴定棉花枯萎病抗性的适乐时包衣菌土营养钵法。本发明的方法包括以下步骤：1）病原菌的培养，将棉花枯萎病菌接种至查比克液体培养基中培养4-5天，再转接到玉米沙土培养基中；2）制备枯萎菌土营养钵，在生砂壤土中混入质量百分比为0.6%的棉花枯萎菌的玉米沙土培养物，装入无底纸钵中；3）播种及棉苗管理，1%的适乐时包衣，播种，并在可控温控湿的日光温室中培养棉苗；4）评价棉花枯萎病抗性，分级调查病害发生情况，计算病情指数。本发明的方法具有快速、准确、经济等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病理学领域，具体地，本发明涉及一种鉴定棉花枯萎病抗性的 适乐时包衣菌土营养钵法。

背景技术

棉花枯萎病是一种世界性的危险病害，和黄萎病被并列成为棉花上的两大病害， 严重影响棉花生产，也是棉花入境的检疫对象。选育抗病品种是防治棉花枯萎病最 经济有效的措施之一。棉花品种和资源材料的抗枯萎病性鉴定是抗病育种的基础工 作。由于枯萎病菌在子叶期即可发病，因此科研工作者往往在棉花苗期开展抗枯萎 病性鉴定工作。早期主要采用苗床病圃法，但由于病圃的建立需要相对隔离的环境， 还要设置活动防雨遮光棚，受到自然条件的制约较大，所以已被逐渐淘汰。

棉花枯萎病是一种土传维管束病害，可以在棉花的整个生育期为害，主要症状 有：黄化型、黄色网纹型、青枯型、紫红型和皱缩型。在大田条件下，枯萎病在苗 期至现蕾期为害都十分严重，重病田蕾期可造成大面积死苗，甚至绝产。为了达到 快速鉴定的目的，往往选择苗期鉴定棉花品种和资源材料的枯萎病抗性。但是，如 果棉苗管理不当，环境湿度过大或通风不好就会导致苗期病害的发生，因此选用防 治苗病、而又对枯萎病发生无影响的药剂拌种，就可以降低苗病危害，使得试验结 果准确可靠。目前，普遍依据国家标准（GB/T22101.4-2009）采用纸钵土壤接菌盆 栽法，对棉花品种（系）进行抗枯萎病鉴定，但是，由于标准中菌土浓度过高，用 多菌灵拌种等原因，可操作性不强，重复性差，导致试验结果不可靠。

枯萎病菌的接种量是苗期鉴定棉花品种和资源材料抗病性的关键环节，决定发 病时间的早晚和轻重。此外，还必须考虑环境温度、湿度和光照条件的控制及抗病 和感病对照的设置等因素。

发明内容

本发明的目的是建立一种鉴定棉花枯萎病抗性的适乐时包衣菌土营养钵法。

发明的鉴定棉花枯萎病抗性的适乐时包衣菌土营养钵法包括以下步骤：

1）病原菌的培养，将棉花枯萎病菌接种至查比克液体培养基中培养，再转接到 玉米沙土培养基中；

2）制备枯萎菌土营养钵，在生砂壤土中混入质量百分比为0.6%的棉花枯萎菌玉 米沙土培养物，装入无底纸钵中；

3）播种及棉苗管理，1%的适乐时（2.5%咯菌腈(国际通用名Fludionil)悬浮种衣 剂）包衣，播种，并在可控温控湿的日光温室中培养棉苗；

4）评价棉花枯萎病抗性，分级调查病害发生情况，计算病情指数。

根据本发明的具体实施方式，所述鉴定棉花枯萎病抗性的适乐时包衣菌土营养 钵法包括以下步骤：

1）枯萎病菌的培养，将棉花枯萎病菌菌种接种至查比克液体培养基振荡培养， 然后再转接入玉米沙土培养基静置培养；

2）棉花枯萎病菌菌土基质的制备和营养钵的制作，将在太阳下暴晒过2-3天的 生砂壤土中混入一定质量百分比的棉花枯萎菌的玉米沙土培养物，充分混合均匀， 分装到无底纸钵中；

3）最佳接种浓度的确定，苗期鉴定中适量接种是关键技术之一，由于棉花枯萎 病抗性鉴定往往都是多批次试验，为了使各批试验之间的结果具有可比性，一般选 用相对病情指数来评价棉花品种（系）的抗病性，当感病对照的实际病指在40.0～ 66.7之间的时候，将其相对病指校正到50才较为可靠。枯萎病菌菌土接种浓度过低 会减轻病害的发生且发病不均匀，而浓度过高则会影响出苗率，造成出苗迟缓，还 会导致病害过重，实际病指高出阈值66.7，不能准确评价棉花品种和材料的抗病性。 综合出苗率和发病情况的结果，使用的枯萎病菌培养物接种浓度为0.6%。

4）适乐时包衣，并培养棉苗。培育健壮整齐的棉苗是苗期抗病鉴定的最基本要 求，也是保证鉴定准确的前提。在最适浓度枯萎菌土接种浓度下（0.6%），为了提高 棉苗的出苗率，选用防苗病药剂（1%适乐时）包衣，冀棉11、中棉所45和中植棉2 号的出苗率分别是100%，100%和88.9%，略高于温汤浸种。枯萎病情指数为52.2、 18.9和9.1。而采用国家标准中所述的5%多菌灵拌种，各品种的出苗较好，但是发 病极显著减轻，感病品种冀棉11的病情指数仅为23.1，远远低于阈值40.0，说明 5%多菌灵对枯萎病的发生有明显的抑制作用，不可选用多菌灵包衣。棉花苗期抗枯 萎病性鉴定对温度的要求较为严格，要求日平均温度26℃左右，适宜发病的温度为 20℃～32℃。鉴定要求有相对较高的湿度，土壤相对湿度为60%以上较为合适，并且 要均匀一致。试验还要求有良好的光照，在春秋季节，日光温室的光照一般均可达 到要求。

5）评价棉花枯萎病抗性。在适宜的条件下，一般播种后15天开始发病，21天 普遍发病。试验要求感病对照病情指数为50左右（40.0～66.7），就可以进行分级调 查。一般采用相对病情指数，即将感病对照校正到50，从而计算得到待测棉花品种 的相对病指，以便不同批次的鉴定结果进行比较。

根据本发明的方法具有以下特点：

1、鉴定基质枯萎菌土浓度合适，发病充分均匀，鉴定结果准确，不同批次可比 性强。棉花枯萎病抗性鉴定基质中，枯萎菌的浓度是影响棉花品种和资源材料病害 发生的最直接的因素。要求感病对照的病情指数为50左右（40.0～66.7），才能够进 行科学校正，采用相对病情指数评价棉花品种抗性，使得各批次试验有可比性。过 低浓度菌土，会造成病害发生过轻，发病不均匀。反之，高浓度菌土就严重影响出 苗，并且会导致病害过严重发生，使得感病对照实际病指过高，无法进行科学校正 （表1）。所以我们推荐0.6%的菌土浓度为最适，可以保证在同样环境条件下，不同 批次的供试棉花材料，表现出其不同的抗病性。

2、棉花出苗率高，且出苗整齐。采用1%的适乐时拌种可有效防治棉花苗病的特 效药剂，且不影响棉花枯萎病的正常发生。采用1%的适乐时拌种，可以有效降低苗 期病害的发生，提高出苗率，比国家标准中所用的多菌灵拌种效果好。多菌灵可以 明显抑制枯萎菌的生长，导致鉴定结果失真。枯萎病作为一种土传病害，主要是从 棉苗的根系侵入，因此要求棉苗的根系发育良好。播种前，从无底营养钵底部灌入 充足的水分，营养钵吸水迅速均匀，有利于棉花出苗整齐一致，无底营养钵是由废 旧报纸制作而成，通透性好，棉苗根系发育好。

3、鉴定周期短，可快速鉴定棉花品种和资源材料的抗枯萎病性。棉花枯萎病抗 性的适乐时包衣菌土营养钵法鉴定棉花品种和资源材料的抗枯萎病性，播种后15天 左右开始发病，21天普遍发病，且发病均匀，达到鉴定要求（感病对照冀棉11病情 指数在40.0～66.7）。鉴定周期为30天左右，试验可在控温控湿的日光温室中进行， 不像人工病圃那样受季节的限制，可快速多批次进行品种的抗病性鉴定。尤其可对 当年收获的种子进行抗病性鉴定，为加速抗病品种选育进程提供强有力的技术支撑。

根据本发明的鉴定棉花枯萎病抗性的适乐时包衣菌土营养钵法，其在以下四方 面产生有益效果：

1、快速。采用适乐时包衣菌土营养钵法鉴定棉花枯萎病抗性，鉴定周期为30 天左右，且不受季节限制，也可对当年收获的种子进行及时鉴定，该鉴定方法大大 缩短了鉴定周期，加速抗病品种选育进程。

2、准确。选用了防治苗病效果好且不影响枯萎病发生的适乐时包衣，而没有使 用国家标准中推荐的广谱性杀菌剂多菌灵，鉴定结果可靠。再者，采用合适的菌土 浓度（0.6%）进行抗病性鉴定，再此浓度下发病均匀，感病对照实际病指接近50， 用校正后的相对病指衡量棉花品种或材料的抗病性，数据准确，使得不同批次的试 验可比性强。2012年采用适乐时包衣菌土营养钵法，分三个批次对60个棉花品种进 行了抗病性鉴定，不同批次感、耐、抗品种的一致性较好。

3、经济。选用的深层生砂壤土，在太阳下暴晒2-3天即可，省去高温灭菌的步 骤。并且将枯萎病菌培养物混匀到生砂壤土中作为抗病性鉴定的基质，可以多次重 复利用，且易储存。

4、环保。采用废旧报纸钉做纸钵，与使用塑料钵和铁钵相比，成本低廉，实现 了废物的二次利用。

附图说明

图1显示适乐时包衣菌土营养钵法鉴定棉花品种枯萎病抗性的现场。

图2显示播种后21天抗病品种和感病品种的发病情况。

具体实施方式

实施例1

1、棉花枯萎病菌培养

选用棉花枯萎病菌7号生理小种，分离自中国农业科学院棉花研究所白壁试验 田，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（将200g马铃薯洗净后去皮切碎，加水800mL 煮沸20-30min，用纱布过滤后，加入葡萄糖18g，琼脂粉24g，加水定容至1000mL。） 上进行单孢纯化。从PDA平板上的菌落边缘挑取2mm²的新鲜菌块，接种到查比克液体 培养基（NaNO₃,2.00g;K₂HPO₄,1.00g;KCI,0.50g;MgSO₄·7H₂O,0.50g;FeSO₄,0.01 g;蔗糖30.00g;加蒸馏水定容至1000ml）中，置于25℃下，150rpm，暗培养4～ 5天。吸取上述液体培养的菌悬液15ml转接至装于广口瓶的玉米沙土（质量比=1:1） 培养基里，之后放入到25℃培养箱中静置培养7天，待枯萎病菌的菌丝布满广口瓶， 将培养物掏出，自然风干备用。

2、棉花枯萎病菌菌土基质制备

取多年未种植过棉花的生砂壤土，在太阳下暴晒2-3天，过40目筛。然后，拌 入质量百分比为0.6%的棉花枯萎菌的玉米沙土培养物，充分混合均匀，分装到6cm ×10cm的纸钵中。

3、浇水备播

从盘子中间空隙处灌水，使营养钵内的土充分吸水，以纸钵内上层土湿润而盘 子内没有积水为宜。

4、种子处理及拌药播种

供试棉花品种种子经硫酸脱绒，晾晒干燥，用1%的适乐时（购自先正达公司） 拌匀包衣，每钵播种5粒，将种子均匀分散在营养钵内，轻轻按压，覆盖灭菌沙土 1.5cm厚，用手抚平。

5、试验设计及管理

每品种3行，每行6个钵，棉花出苗后，每钵留苗3～4株。中植棉2号为抗病 对照，冀棉11为感病对照。环境温度控制在20℃～32℃，浇水要均匀一致，土壤相 对湿度控制在60%以上，光照良好,温室棉苗生长状况如图1所示。

6、试验调查

播种后15天棉苗开始发病，21天普遍发病，跟踪监测感病对照的发病情况，感 病对照病情指数达到50左右，进行病情分级调查，分级标准为：0级，健苗，无病 状；1级，1～2片子叶表现病状，子叶变黄，真叶不显病状；2级，子叶和1片真叶 表现病状；3级，2片真叶表现病状；4级，全部叶片表现病状，严重时叶片脱落， 顶心枯死，接菌后21天抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11发病情况如图2所 示。

7、统计分析

根据调查结果,计算出病株率、病情指数和相对病情指数。

病株率(%)=(发病株数/调查总株数)×100

病情指数=[∑(各级病株数×相应病级)/调查总株数×最高病级(4)]×100

相对抗病指数=K×鉴定材料的实际病指

K＝50÷感病对照实际病指，并要求K值为0.75～1.25(50为规定感病对照品种 的标准病指，感病对照的病情指数应为40.0～66.7，方可应用相对病情指数)。

8、抗病性评价

以相对病情指数(IR)来划分各品种的抗病类型。根据各参试品种IR将其抗病 性分为I(免疫)、HR(高抗)、R(抗病)、T(耐病)和S(感病)共5级(见表1)。

表1：棉花对枯萎病的抗病类型划分标准

分三批试验，使用适乐时包衣菌土营养钵法对表3中所示的60个品种进行棉花 品种枯萎病抗性鉴定，结果如表2所示。从三组试验的对照来看，一致性好，可比 性强，鉴定结果可靠。

表2：适乐时包衣菌土营养钵法对60个棉花品种的鉴定结果

实施例2最佳接种浓度的确定

最佳接种浓度的确定，苗期鉴定中适量接种是关键技术之一，由于棉花枯萎病 抗性鉴定往往都是多批次试验，为了使各批试验之间的结果具有可比性，一般选用 相对病情指数来评价棉花品种（系）的抗病性，当感病对照的实际病指在40.0～66.7 之间的时候，将其相对病指校正到50才较为可靠。枯萎病菌菌土接种浓度过低会减 轻病害的发生且发病不均匀，而浓度过高则会影响出苗率，造成出苗迟缓，还会导 致病害过重，实际病指高出阈值66.7，不能准确评价棉花品种和材料的抗病性。在 以上所述生砂壤土中分别混入0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和2.0%的枯萎菌培养物，播 种供试棉花对照品种，抗病品种中植棉2号、耐病品种中棉所45和感病品种冀棉11， 综合比较出苗率和发病情况确定棉花枯萎病菌最佳接种浓度。结果显示，枯萎菌培 养物的接种浓度越高出苗率越低，浓度≤0.8%为最适，当菌土浓度超过0.8%就会使 出苗率骤减。从病害发生来看，0.4%浓度的菌土发病不均匀，感病对照冀棉11的病 情指数仅为26.3，远低于阈值40.0；在0.6%-1.0%浓度范围内，感病对照的病情指 数都在阈值范围内，但是0.8%和1.0%的浓度下，抗病对照的病指偏高，分别达到了 14.5和13.8；当菌土浓度达到2.0%时，病害发生较为严重，造成大量光杆死苗，致 使感病对照的病情指数高达83.2（表3）。综合出苗率和发病情况的结果，使用枯萎 病菌培养物接种浓度为0.6%。

表3：1%适乐时包衣不同接菌量下的出苗和发病情况

实施例3适乐时包衣剂的确定

培育健壮整齐的棉苗是苗期抗病鉴定的最基本要求，也是保证鉴定准确的前提。 在最适浓度枯萎菌土接种浓度下（0.6%），为了提高棉苗的出苗率，选用防苗病药剂 （1%适乐时）包衣，冀棉11、中棉所45和中植棉2号的出苗率分别是100%，100% 和88.9%，略高于温汤浸种。枯萎病情指数为52.2、18.9和9.1。而采用国家标准 中所述的5%多菌灵拌种，各品种的出苗较好，但是发病极显著减轻，感病品种冀棉 11的病情指数仅为23.1，远远低于阈值40.0，说明5%多菌灵对棉花枯萎病的发生 有明显的抑制作用，在枯萎抗性鉴定中不可选用多菌灵包衣（表4）。棉花苗期抗枯 萎病性鉴定对温度的要求较为严格，要求日平均温度26℃左右，适宜发病的温度为 20℃～32℃。鉴定要求有相对较高的湿度，土壤相对湿度为60%以上较为合适，并且 要均匀一致。试验还要求有良好的光照，在春秋季节，日光温室的光照一般均可达 到要求。

表4:0.6%枯萎菌土不同药剂包衣的出苗和发病情况比较