一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法

摘要

本发明揭示了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。本发明提供了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，降低了对生物素的亲和力，提高了对生物素衍生物（如2-亚氨基生物素）的亲和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分离、纯化，其产物可用作亲和色谱填料制备。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程、蛋白质工程和发酵工程领域，涉及一种DNA分子的合成、突变、重组和载体构建技术，尤其涉及一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法。 

背景技术

链霉亲和素（Streptavidin，SA）是由阿维丁链霉菌（Streptomyces avidinii）培养过程中分泌的一种小分子非糖基化蛋白质，全长编码区183个氨基酸（aa），包含24aa的信号肽（见序列表中SEQ ID No: 1），成熟分子159aa (见序列表中SEQ ID No: 2)。菌体外的天然活性形式为从13～139aa的成熟肽(见序列表中SEQ ID No: 3)，分子量15kD，其天然形式为同源四聚体，分子量60kD，SA的成熟活性结构为127个氨基酸的多肽，称为SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr. Stapley首先发现并报道。 

本世纪以来，SA由于其与生物素（Biotin，又称维生素H、辅酶R）有极高的亲和力和特异性而受到国际生物学和医学界的高度重视。SA对其配体生物素的亲和力（10^-16 M/L）比已知的抗原-抗体的亲和力（10^-7～10^-12 M/L）高4～6个数量级。高亲和力和高特异性并不是SA的唯一特性，SA与Biotin的结合速度极快，即便是在极低浓度和4℃环境下也是如此。另外，由于生物素是小分子，因而蛋白生物素化几乎不影响生物功能。SA-Biotin复合物可以耐受变性剂（如6M盐酸胍）、去垢剂（如SDS）、90℃高温和3～11pH环境。与其他靶向标签（如Halo-Tag和SNAP-Tag）相比，SA有更多便利，不论是体外或体内，其可借助大肠杆菌的生物素连接酶（E. coli biotin ligase）将其配体标记到目标蛋白。SA的这些特性，引发了科学家对SA和其配体Biotin进行各种生物改造的兴趣。 

野生型SA（wtSA）分子与Biotin的结合速度（on-rate）虽然很快，但结合力不够稳定持久（high off-rate），这对需要连续长时间观察的动态实验（如细胞生物学领域）与影像研究较为不利。另一方面，wtSA与生物素的异乎寻常的亲和力（10^-16mole/L），又使得分离制备时，需要变性条件下洗脱。尽管wtSA对生物素的亲和力极高，但其对某些极具用途的生物素衍生物，如2-亚氨基生物素，则结合力不够理想（兼容性不理想），这也提出了对SA进行分子改造的必要。 

尽管过去20年来，已经报道有200多种突变型SA（mtSA），但关于SA突变后提高结合稳定性的研究很少。2012年，Mark Howarth，Oxford （GB）公开了稳定性结合SA突变体研究（美国专利申请号: US 2012/0214970 A1），测试并保护了3个双位点突变体S52G/R53D，S52G/R53N，S52G/R53S （见序列表中SEQ ID No: 4，SEQ ID No: 5，SEQ ID No: 6），指出该类突变体的主体序列必须在第23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128与野生型SA相同。 

早在2000年，R. Charles Cantor（Boston University）对SA的亲和兼容性进行了研究，公开了2个SA的突变体（EP0977770 A1），它们是N23A、S27E或S27D（见序列表中SEQ ID No: 7，SEQ ID No: 8），该突变体对Biotin的亲和力降低了至少10个数量级，提高了对2-亚氨基生物素（2-iminobiotin）和 Diaminobiotin的亲和力，可用于分离2-亚氨基生物素化的蛋白。 

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种全人工基因合成的密码子优化和突变引入的亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4及其制备方法，亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4既有兼容性亲和力，又有低的解离速度（off-rate）。 

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现： 

一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。

优选的，上述的一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，其中：所述亲和兼容性链霉亲和素突变体包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。 

一种上述的亲和兼容性链霉亲和素突变体的制备方法，包括以下步骤： 

1）已知的具有127个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，在其N端添加Met氨基酸作为起始密码安置，形成128个氨基酸序列，并在其中引入两个氨基酸的定点突变：S52G、R53D，以及两个氨基酸的换位突变：Y22N、N23Y，得到的128个氨基酸的突变序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；

2）将所述128个氨基酸的突变序列经DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化（E. coli class II），并且在其5’-端添加了NcoI酶切位点，3’-端添加终止密码TAA和XhoI酶切位点，在上下游酶切位点外侧各加4个保护碱基，DNA合成仪合成10条寡核苷酸引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11～20所示；

3）将所述10条寡核苷酸引物通过PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列编码128个氨基酸的突变序列，命名为SA128m4，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:21所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D；

4）构建原核表达工程载体pET28a-SA128m4；

5）构建原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4；

6）原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4的扩增、诱导表达；

7）SA128m4的提取与纯化；

8）SA128m4的生物活性测定，所述SA128m4的突变包含Y22N、N23Y、S52G、R53D，由于已知S52G、R53D突变可以使得结合稳定性加强，解离（off-rate）速度变慢，而新的Y22N、N23Y的转位突变则使得SA与Biotin氢键结合的空间位置发生变化，抑制了SA对Biotin的过高亲和力，提高了对Biotin衍生物（2-iminobiotin，2-亚氨基生物素）的亲和力。

本发明的突出效果为：本发明提供了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4结合了SA（S52G，R53D）突变的结合稳定性（low off-rate）和SA（N23A，S27D）的亲和兼容性，降低了对生物素的亲和力，提高了对生物素衍生物（如2-亚氨基生物素）的亲和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分离、纯化，其产物可用作亲和色谱填料制备。 

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。 

附图说明

图1是重组表达载体pET28a-SA128m4的物理结构图。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 

实施例： 

本实施例提供一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法。

1．全人工基因合成和突变引入 

1.1已知的具有127个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，在其N端添加Met氨基酸作为起始密码安置，形成128个氨基酸序列，并在其中引入两个氨基酸的定点突变：S52G、R53D，以及两个氨基酸的换位突变：Y22N、N23Y，得到的128个氨基酸的突变序列（SEQ ID NO:9）；

1.2将上述128个氨基酸的突变序列经美国国家生化信息中心（NCBI）网上软件DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，上述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化（E. coli class II），并且在其5’-端添加了NcoI酶切位点，3’-端添加终止密码TAA和XhoI酶切位点，在上下游酶切位点外侧各加4个保护碱基，DNA合成仪合成10条寡核苷酸引物（SEQ ID NO:11～20）；

1.3将上述10条寡核苷酸引物通过PCR合成人工DNA序列为403个碱基对的脱氧核糖核酸，所述人工DNA序列编码128个氨基酸的突变序列，命名为SA128m4（SEQ ID NO:21），包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D（SEQ ID NO:9）；

1.4将PCR产物克隆进盘古基因科技（苏州）有限公司的TOPO克隆载体TopFast^TM pACK4a-Bs，挑取单克隆扩增、PCR鉴定重组体；

1.5通过DNA序列分析获得了序列正确的SA128m4克隆（命名为pACK4a-SA128m4）。

2．亚克隆技术构建原核表达载体 

2.1用NcoI/XhoI双酶切消化pACK4a-SA128m4，琼脂糖电泳和胶回收法回收SA128m4目的片段，同法用NcoI/XhoI处理pET28a载体，胶回收纯化；

2.2 T4 DNA连接酶连接，转化Top10感受态菌，挑取单菌落鉴定阳性克隆；

2.3测序分析验证插入片段正确，取得pET28a-SA128m4重组表达载体（如图1所示）；

2.4用该载体转化BL21（DE3）感受态菌，取得表达菌株BL21-pET28a-SA128m4。

3．测试表达 

3.1LB培养基扩增表达菌株BL21-pET28a-SA128m4，IPTG诱导表达，诱导条件：IPTG 0.1mMole/L，25℃诱导4小时；

3.2取1mL菌液，离心收集菌体，PBS洗涤1次，0.5mL PBS重悬浮，超声裂解菌体；

3.3在4℃，12,000RPM，离心15min，保留上清和沉淀，分别上样SDA-PAGE，考马斯亮蓝染色-脱色，观察表达条带。SA128m4的表达量占细菌总蛋白的8%，其中可溶性表达>90%。

4．SA128m4蛋白质纯化 

4.1 LB+M9培养基2L，摇瓶扩菌至OD≈0.5；

4.2加IPTG诱导（0.1mMole/L）， 25℃诱导表达4小时；

4.3收集菌体，超声破碎菌体，离心收集上清；

4.4饱和硫酸铵（加至80%）共沉淀，离心收集沉淀，去离子水重悬；

4.5分子筛Sephadex G-50，分选加脱盐，5%甘油水溶液洗柱，收集SA128m4蛋白组份，20mM 磷酸盐缓冲液，pH5.0（含10mM NaCl, 5%甘油）透析平衡；

4.6Mono S 阳离子交换层析：20mM磷酸盐缓冲液,pH5.0（含10mM NaCl,5% Glycerol）平衡离子交换柱，上样，5倍柱体积平衡液淋洗，20mM磷酸盐缓冲液,pH7.0（含100mM NaCl, 5% Glycerol），洗脱目标产物SA128m4；

4.7Mono Q 阴离子交换层析: pH8.5，20mM 的Tris-Cl缓冲液（含5% Glycerol）平衡色谱柱，将上一步收集的SA组份以柱平衡液透析平衡后上柱，5倍柱体积淋洗，离子梯度洗脱SA（20mM 的磷酸盐缓冲液，pH8.5，200mM NaCl）；

4.8Sephadex G-200 凝胶过滤层析( 60cm×5cm)，收集合并含有SA的活性峰，并对其含量，纯度进行鉴定，超滤浓缩。

5．SA128m4活性测定 

BioCORE 100生物传感器测定亲和力，SA128m4与Biotin的Kd = 1.52×10^-8M/L，与2-亚氨基生物素的Kd = 1.23×10^-6M/L。

SA128m4的比活性（Specific Activity）达到14.8U/mg (wtSA的比活性为13～16U/mg，1U结合Biotin 1μg)。 

SA128m4与生物素结合的半寿期为12小时（据报道，wtSA为6.6小时，单体SA（Monomeric SA）为3分钟）。 

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。 

<110>盘古基因科技（苏州）有限公司

<120>一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法

<160>21

 

 

<210>1

<211>183

<212>PRT

<213>链霉亲和素

<400>1

Met Arg Lys Ile Val Val Ala Ala Ile Ala Val Ser Leu Thr Thr

1               5                   10                  15

Val Ser Ile Thr Ala Ser Ala Ser Ala Asp Pro Ser Lys Asp Ser

                20                  25                  30

Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp

                35                  40                  45

Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp

                50                  55                  60

Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu

                65                  70                  75

Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr

                80                  85                  90

Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn

                95                  100                 105

Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

                110                 115                 120

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr

                125                 130                 135

Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly

                140                 145                 150

His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp

                155                 160                 165

Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala

                170                 175                 180

Val Gln Gln

 

 

<210>2

<211>159

<212>PRT

<213>链霉亲和素159个成熟氨基酸

<400>2

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala

1               5                   10                  15

Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile

                20                  25                  30

Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser

                35                  40                  45

Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

                50                  55                  60

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp

                65                  70                  75

Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr

                80                  85                  90

Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn

                95                  100                 105

Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp

                110                 115                 120

Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro

                125                 130                 135

Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn

                140                 145                 150

Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

                155                

 

 

<210>3

<211>127

<212>PRT

<213>链霉亲和素127个核心氨基酸

<400>3

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser

1               5                   10                  15

Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr

                20                  25                  30

Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr

                35                  40                  45

Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala

                50                  55                  60

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His

                65                  70                  75

Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala

                80                  85                  90

Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala

                95                  100                 105

Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys

                110                 115                 120

Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

                125        

 

 

<210>4

<211>127

<212>PRT

<213>链霉亲和素127个核心氨基酸突变体S52G/R53D

<400>4

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser

1               5                   10                  15

Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr

                20                  25                  30

Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Gly Asp Tyr Val Leu Thr

                35                  40                  45

Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala

                50                  55                  60

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His

                65                  70                  75

Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala

                80                  85                  90

Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala

                95                  100                 105

Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys

                110                 115                 120

Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

                125       

 

 

<210>5

<211>127

<212>PRT

<213>链霉亲和素127个核心氨基酸突变体S52G/R53N

<400>5

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser

1               5                   10                  15

Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr

                20                  25                  30

Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Gly Asn Tyr Val Leu Thr

                35                  40                  45

Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala

                50                  55                  60

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His

                65                  70                  75

Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala

                80                  85                  90

Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala

                95                  100                 105

Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys

                110                 115                 120

Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

                125        

 

 

<210>6

<211>127

<212>PRT

<213>链霉亲和素127个核心氨基酸突变体S52G/R53S

<400>6

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser

1               5                   10                  15

Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr

                20                  25                  30

Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Gly Ser Tyr Val Leu Thr

                35                  40                  45

Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala

                50                  55                  60

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His

                65                  70                  75

Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala

                80                  85                  90

Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala

                95                  100                 105

Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys

                110                 115                 120

Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

                125         

 

 

<210>7

<211>127

<212>PRT

<213>链霉亲和素127个核心氨基酸突变体N23A/S27E

<400>7

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Leu Gly Glu

1               5                   10                  15

Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr

                20                  25                  30

Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr

                35                  40                  45

Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala

                50                  55                  60

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His

                65                  70                  75

Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala

                80                  85                  90

Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala

                95                  100                 105

Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys

                110                 115                 120

Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

                125          

 

 

<210>8

<211>127

<212>PRT

<213>链霉亲和素127个核心氨基酸突变体N23A/S27D

<400>8

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Leu Gly Asp

1               5                   10                  15

Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr

                20                  25                  30

Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr

                35                  40                  45

Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala

                50                  55                  60

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His

                65                  70                  75

Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala

                80                  85                  90

Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala

                95                  100                 105

Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys

                110                 115                 120

Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

                125           

 

 

<210>9

<211>128

<212>PRT

<213>链霉亲和素突变体SA128m4

<400>9

 

Met Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Asn Tyr Gln Leu Gly

1               5                   10                  15

Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly

                20                  25                  30

Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Gly Asp Tyr Val Leu

                35                  40                  45

Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr

                50                  55                  60

Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala

                65                  70                  75

His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu

                80                  85                  90

Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu

                95                  100                 105

Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr

                110                 115                 120

Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

                125         

 

 

<210>10

<211>384

<212>DNA

<213>链霉亲和素突变体SA128m4

<400>10

atggcggaag cgggtatcac gggcacctgg aactaccagc tcggttctac cttcatcgtt 60

accgcgggtg cggacggtgc gctgaccggt acttacgaat ctgcggttgg taatgcggaa 120

ggtgactacg ttctgacggg tcgttacgac agcgcgcctg caaccgacgg ttctggtacg 180

gcgctgggtt ggaccgttgc gtggaagaac aactaccgta acgcgcactc tgcgaccacc 240

tggtctggtc agtacgttgg tggcgctgaa gcgcgtatca acacccagtg gctgctgacc 300

tctggcacca ccgaagcgaa cgcatggaaa tctaccctgg ttggtcacga caccttcacc 360

aaagttaaac cgtctgcggc gtct                                        384

 

 

<210>11

<211>46

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

aaaaccatgg cggaagcggg tatcacgggc acctggaact accagc 46

 

 

<210>12

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

gcgcaccgtc cgcacccgcg gtaacgatga aggtagaacc gagctggtag ttccaggtgc 60

 

 

<210>13

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

tgcggacggt gcgctgaccg gtacttacga atctgcggtt ggtaatgcgg aaggtgacta 60

 

 

<210>14

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

gtcggttgca ggcgcgctgt cgtaacgacc cgtcagaacg tagtcacctt ccgcattacc 60

 

 

<210>15

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

gcgcctgcaa ccgacggttc tggtacggcg ctgggttgga ccgttgcgtg gaagaacaac 60

 

 

<210>16

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

tactgaccag accaggtggt cgcagagtgc gcgttacggt agttgttctt ccacgcaacg 60

 

 

<210>17

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

ccacctggtc tggtcagtac gttggtggcg ctgaagcgcg tatcaacacc cagtggctgc 60

 

 

<210>18

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>18

agggtagatt tccatgcgtt cgcttcggtg gtgccagagg tcagcagcca ctgggtgttg 60

 

 

<210>19

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>19

gaacgcatgg aaatctaccc tggttggtca cgacaccttc accaaagtta aaccgtctgc 60

 

 

<210>20

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>20

aaaactcgag ttaagacgcc gcagacggtt taactttggt g 41

 

 

<210>21

<211>403

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

aaaaccatgg cggaagcggg tatcacgggc acctggaact accagctcgg ttctaccttc 60

atcgttaccg cgggtgcgga cggtgcgctg accggtactt acgaatctgc ggttggtaat 120

gcggaaggtg actacgttct gacgggtcgt tacgacagcg cgcctgcaac cgacggttct 180

ggtacggcgc tgggttggac cgttgcgtgg aagaacaact accgtaacgc gcactctgcg 240

accacctggt ctggtcagta cgttggtggc gctgaagcgc gtatcaacac ccagtggctg 300

ctgacctctg gcaccaccga agcgaacgca tggaaatcta ccctggttgg tcacgacacc 360

ttcaccaaag ttaaaccgtc tgcggcgtct taactcgagt ttt                   403