MLL1抗体和表达抑制剂在制备治疗急性髓性白血病的药物中的应用

摘要

本发明公开了MLL1抗体和MLL1表达抑制剂在制备治疗急性髓性白血病（AML）的药物中的应用，研究结果显示，AML细胞的HOXA10基因表达受MLL1蛋白调控，MLL1介导的HOXA10表达的改变是AML的防治新靶点，应用MLL1抗体处理阻断MLL1或通过基因工程技术抑制MLL1的表达均可以达到降低HOXA10表达进而治疗AML的目的。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及物质的医药用途。

背景技术

急性白血病是严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤，占全国各年龄段恶性肿瘤死亡率 的第6位，占儿童和35岁以下人群恶性肿瘤死亡率的第1位。

正常造血过程依赖于造血调控因子在细胞不同分化阶段有效的活化与失活。研究结果表 明，同源盒（HOX）基因与造血调控有关。HOX基因家族是一类在进化过程中高度保守的基 因，存在于酵母至人类的几乎所有真核细胞中，均含有1个约180个核苷酸的同源异型盒， 可以转录出约60个氨基酸的同源蛋白质区段，其编码产物为一类转录因子。近来有研究发现， HOXA10基因定向表达于髓细胞，并且在造血发育过程中具有双重调节作用，其持续过表达 有助于维持髓细胞的高增殖能力，阻止髓细胞的分化，最终导致急性髓性白血病（AML）。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于通过研究HOXA10在AML细胞中的表达调控机制，探讨 HOXA10调控作为AML防治新靶点的可能性，进而提供一种通过调控HOXA10表达治疗 AML的药物。

对HOXA10启动子区域的结构分析表明，HOXA10启动子区域包含2个雌激素反应元件 （ERE）：ERE1和ERE2，并且ERE在HOXA10启动子区域的位置靠近转录起始位点，提 示HOXA10的表达可能与雌激素受体（ER）的活化相关。另有文献报道，HOXA10启动子 CpG岛在AML患者中呈低甲基化或不甲基化状态，导致HOXA10基因持续过表达，而在正 常人中HOXA10启动子CpG岛呈甲基化状态，导致HOXA10基因低表达或不表达，提示 HOXA10的表达可能是通过其启动子CpG岛甲基化修饰调控。MLL（mixed lineage leukemia） 蛋白具有组蛋白H3K4特异性甲基化转移酶（HMT）的功能，能特异性调控组蛋白H3K4甲 基化，而H3K4的甲基化可导致基因启动子CpG岛低甲基化。文献还报道，MLL蛋白家族 作为ER的辅调节因子调控雌二醇（E₂）介导的E₂敏感基因的活化。

为此，本发明首先以不同浓度的E₂在不同时间点刺激AML细胞株HL-60，以不刺激的 HL-60细胞作参照，应用RT-PCR和Western blot检测HOXA10基因表达活性的差异，以明 确E₂对HOXA10表达的活化作用，并在E₂刺激下以反义寡核苷酸转染技术分别敲除ERα、 ERβ和MLLs（MLL1-4）后再检测HOXA10mRNA和蛋白表达的变化，确定哪一种ER的 活化与HOXA10的表达相关，哪一种MLL对HOXA10表达有调控作用；继而采用染色质 免疫共沉淀（ChIP）实验检测E₂刺激前后MLL和HOXA10启动子上ERE1和ERE2的相互 作用，再通过Western-blot检测E₂刺激前后组蛋白H3K4甲基化状态以明确MLL是否通过 表观遗传学途径调控HOXA10的表达；最后使用MLL1抗体处理AML细胞，观察其对AML 细胞的影响。结果显示：在E₂50nmol/L6h刺激下HOXA10表达明显升高，ERα和ERβ反义 寡核苷酸转染后HOXA10表达均有下降，MLL1表达沉默时HOXA10表达明显降低，MLL1 可以结合到HOXA10启动子上的ERE区域而组蛋白H3K4甲基化状态在E₂刺激后明显高于 刺激前，对AML细胞使用MLL1抗体处理阻断MLL1导致HOXA10表达下降并引起AML 细胞凋亡。由此得出以下结论：AML细胞的HOXA10基因表达受MLL1蛋白调控，MLL1 介导的HOXA10表达的改变是AML的防治新靶点，应用MLL1抗体阻断MLL1或者通过基 因工程技术抑制MLL1的表达均可以达到降低HOXA10表达进而治疗AML的目的。

由此，本发明提出如下技术方案：

1．MLL1抗体在制备治疗AML的药物中的应用。

2．MLL1表达抑制剂在制备治疗AML的药物中的应用。

进一步，所述MLL1表达抑制剂为MLL1反义寡核苷酸。

进一步，所述MLL1反义寡核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明的有益效果在于：本发明提供了MLL1抗体和MLL1表达抑制剂在制药领域中的 新用途，提高了MLL1抗体和MLL1表达抑制剂的自身价值，扩大了其应用范围，为AML 的治疗提供了新的备选药物，并为AML治疗药物的深入研究和开发提供了一个新的方向。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的 详细描述，其中：

图1为RT-PCR（A）与Western blot（B）检测HL-60细胞在不同浓度E₂刺激后不同时 间点HOXA10mRNA和蛋白的表达。M：DL2000标准；1：无刺激对照；2-6：分别代表50 nmol/L E₂刺激4h、6h、8h、12h、24h；7-12：分别代表100nmol/L E₂刺激4h、6h、8h、12h、 24h。a：与无刺激对照相比P<0.01；b：与无刺激对照相比P<0.05。

图2为RT-PCR（A）与Western blot（B）检测HL-60和THP-1细胞分别敲除ERα和ERβ 后HOXA10mRNA和蛋白的表达。M：DL2000标准；1-5：分别代表HL-60细胞转染Scramble  antisense对照、HL-60+ERα、HL-60+ERα+E₂、HL-60+ERβ、HL-60+ERβ+E₂；6-10：分别代 表THP-1细胞转染Scramble antisense对照、THP-1+ERα、THP-1+ERα+E₂、THP-1+ERβ、 THP-1+ERβ+E₂；其中+ERα表示敲除了ERα；+ERβ表示敲除了ERβ。b：与转染Scramble  antisense对照相比P<0.05。

图3为RT-PCR（A）与Western blot（B）检测HL-60和THP-1细胞分别敲除MLL1、 MLL2、MLL3和MLL4后HOXA10mRNA和蛋白的表达。M：DL2000标准；1-6：分别代 表HL-60细胞无转染阴性对照、HL-60细胞转染Scramble antisense对照、HL-60+MLL1、 HL-60+MLL2、HL-60+MLL3、HL-60+MLL4；7-12：分别代表THP-1细胞无转染阴性对照、 THP-1细胞转染Scramble antisense对照、THP-1+MLL1、THP-1+MLL2、THP-1+MLL3、 THP-1+MLL4；其中+MLL1～4分别表示敲除了MLL1～4。a：与转染Scramble antisense对照 相比P<0.01；b：与转染Scramble antisense对照相比P<0.05。

图4为Western blot检测E₂刺激对组蛋白H3K4甲基化状态的影响。1-2：分别代表HL-60 细胞有E₂刺激组和无E₂刺激组；3-4分别代表THP-1细胞有E₂刺激组和无E₂刺激组。

图5为ChIP检测E₂刺激前后MLL1和HOXA10启动子上ERE的结合。M：DL1000标 准；1-4：分别代表THP-1细胞E₂刺激前MLL1和ERE1的结合、E₂刺激后MLL1和ERE1 的结合、E₂刺激前MLL1和ERE2的结合、E₂刺激后MLL1和ERE2的结合；5-8：分别代表 HL-60细胞E₂刺激前MLL1和ERE1的结合、E₂刺激后MLL1和ERE1的结合、E₂刺激前 MLL1和ERE2的结合、E₂刺激后MLL1和ERE2的结合。

图6为流式细胞术检测HL-60细胞经不同浓度MLL1抗体处理后的凋亡率。1：无处理 对照；2-5：分别代表50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L MLL1抗体处理；左图为凋亡区， 右图为全图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

1材料与方法

1.1白血病细胞培养与E₂刺激

HL-60细胞和THP-1细胞（ATCC）培养方法见文献（Cindy Yen Okitsu and Chih-Lin Hsieh. DNA Methylation Dictates Histone H3K4Methylation.Mol.Cell.Biol.2007(27):2746-2757），用 50nmol/L和100nmol/L的E₂（Sigma）分别刺激细胞，并在0、4、6、8、12、24h的时间点 收获细胞。

1.2RNA的提取和RT-PCR检测

RNA提取方法见文献（Cindy Yen Okitsu and Chih-Lin Hsieh.DNA Methylation Dictates  Histone H3K4Methylation.Mol.Cell.Biol.2007(27):2746-2757）。HOXA10各PCR反应引物及 反义寡核苷酸序列见表1。

表1HOXA10各PCR反应引物及反义寡核苷酸序列

引物 序列（5′>3′） RT-HOXA10-F CCCTACACGAAGCACCAGACACT（SEQ ID No.1） RT-HOXA10-R GCGTCGCCTGGAGATTCATC（SEQ ID No.2） β-Actin-F AAGGCCAACCGCGAGAAGAT（SEQ ID No.3） β-Actin-R TCGGTGAGGATCTTCATGAG（SEQ ID No.4） MLL1antisense TGCCAGTCGTTCCTCTCCAC（SEQ ID No.5） MLL2antisense ACTCTGCCACTTCCCGCTCA（SEQ ID No.6） MLL3antisense CCATCTGTTCCTTCCACTCCC（SEQ ID No.7） MLL4antisense CCTTCTCTTCTCCCTCCTTGT（SEQ ID No.8） ERαantisense CATGGTCATGGTCAG（SEQ ID No.9） ERβantisense GAATGTCATAGCTGA（SEQ ID No.10） Scramble antisense CGTTTGTCCCTCCAGCATCT（SEQ ID No.11）

1.3反义寡核苷酸转染

严格按照LipofectamineTM 20009试剂（Invitrogen）说明书进行转染，于转染前1天用 无抗生素的含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640调整细胞密度为1×10⁶/mL，接种于12孔板， 1000μL/孔，转染当天换为500μL无抗生素无血清RPMI1640；取荧光标记的反义寡核苷酸 链1.0μg加到50μL RPMI 1640中混匀，另取LipofectamineTM 20002 μL加到50μL RPMI  1640中混匀，室温放置5min后，将分别混有反义寡核苷酸链和LipofectamineTM 2000的RPMI  1640混合（反义寡核苷酸链与脂质体比值为1.0μg∶2μL），室温放置20min后，将上述混 合物加入前述12孔板中，轻轻混匀，培养6h后将培养基换为500μL含100mL/L胎牛血清 的RPMI1640，继续培养24h后收获细胞。

1.4Western blot

细胞经各因素处理后，收集细胞，加入蛋白裂解液RIPA90μL/孔，冰上静置30min后， 4℃、12000r/min离心30min，取上清液，用BCA法测定总蛋白浓度。每个样本取60μg蛋 白，在12%SDS-PAGE凝胶中电泳，电泳结束后转PVDF膜，分别与HOXA10抗体（稀释度 1:200）、GAPDH抗体（稀释度1:200）、孵育，然后与相应二抗孵育，最后应用化学发光试剂 检测各蛋白的含量。

1.5ChIP

严格按照ChIP试剂盒（Thermo）说明书进行操作：第一步：用甲醛在体内将DNA结合 蛋白与DNA交联；第二步：分离染色体（质），剪切后的DNA小片段与DNA结合蛋白结合； 第三步：用特异性抗体与DNA结合蛋白结合，用沉淀法分离复合体，反向交联操作释放出 DNA并消化蛋白质，以得到的DNA为模板进行PCR扩增。

2结果

2.1在不同浓度E₂刺激后不同时间点的HOXA10mRNA和蛋白表达分析

以RT-PCR和Western blot检测HL-60细胞在不同浓度（50、100nmol/L）E₂刺激后不同 时间点（0、4、6、8、12、24h）HOXA10mRNA表达活性的变化。结果如图1所示，HL-60 细胞在50nmol/L E₂6h和8h刺激下HOXA10的表达较无刺激对照组明显升高，在100nmol/L  E₂6h和8h刺激下HOXA10的表达同样有明显提高。

2.2反义寡核苷酸转染技术分别敲除ERα和ERβ后HOXA10mRNA和蛋白表达分析

以RT-PCR和Western blot检测HL-60和THP-1细胞以反义寡核苷酸转染技术分别敲除 ERα和ERβ后在有E₂刺激和无E₂刺激情况下HOXA10mRNA表达活性的变化。结果如图2 所示，HL-60和THP-1细胞在敲除ERα和ERβ后E₂刺激组的HOXA10表达均明显下降，表 明E₂可以同时和ERα和ERβ结合并导致HOXA10的表达升高。

2.3反义寡核苷酸转染技术分别敲除MLL1、MLL2、MLL3和MLL4后HOXA10mRNA 和蛋白表达分析

以RT-PCR和Western blot检测HL-60和THP-1细胞分别敲除MLL1、MLL2、MLL3和 MLL4后HOXA10mRNA表达活性的变化。结果如图3所示，MLL1的敲除导致HOXA10 表达明显下降，表明MLL1对HOXA10的表达有调控作用。

2.4MLL1蛋白与HOXA10启动子上ERE的相互作用

以ChIP检测HL-60和THP-1细胞在有E₂刺激和无E₂刺激情况下MLL1蛋白与HOXA10 启动子上ERE1和ERE2的结合。结果如图4所示，E₂刺激组MLL1蛋白与HOXA10启动子 上ERE1和ERE2的结合均明显高于无E₂刺激组，表明雌激素依赖的ER活化对MLL1蛋白 具有招募作用，促进MLL1蛋白结合到HOXA10启动子的ERE1和ERE2上。

2.5H3K4组蛋白甲基化分析

用H3K4的甲基化抗体做Western blot，检测HL-60和THP-1细胞在有E₂刺激和无E₂刺 激情况下的组蛋白甲基化状态。结果如图5所示，E2刺激组的H3K4组蛋白甲基化程度明显 高于无E₂刺激组，表明MLL1可能是通过结合到HOXA10启动子的ERE1和ERE2上并导 致组蛋白H3K4甲基化的途径来调控HOXA10的表达。

2.6不同浓度MLL1抗体处理后AML细胞的凋亡率分析

以流式细胞术检测HL-60细胞经不同浓度（50、100、200、400μg/L）MLL1抗体处理 后的凋亡率。结果如图6所示，使用MLL1抗体处理阻断MLL1和HOXA10表达后引起HL-60 细胞凋亡，且细胞凋亡率与MLL1抗体的处理浓度成正相关，表明MLL1抗体可以用于制备 治疗AML的药物。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照上述 实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节 上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。