1-{(2S)-2-氨基-4-2,4-双(三氟甲基)-5,8-二氢吡啶并3,4-d嘧啶-7(6H)-基-4-氧代丁基}-5,5-二氟-哌啶-2-酮酒石酸盐的水合物

摘要

本发明涉及1-{(2S)-2-氨基-4-[2,4-双(三氟甲基)-5,8-二氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基]-4-氧代丁基}-5,5-二氟哌啶-2-酮酒石酸盐的1.5水合物，其制备方法以及包含所述化合物作为活性成分的用于抑制DPP-IV的药物组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及以下式1所示的1-{(2S)-2-氨基-4-[2,4-双(三氟甲基)-5,8-二 氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基]-4-氧代-丁基}-5,5-二氟哌啶-2-酮(此后，称为 “化合物1”)酒石酸盐的1.5水合物及其制备方法。

背景技术

化合物1公开于韩国专利申请第10-2006-0029138号(其整体援引加入 本文)并且化合物1表现出针对二肽基肽酶-IV(DPP IV)的优越抑制活性，因 此可用作治疗糖尿病的物质。DPP IV引起的疾病的典型实例可以包括但不 限于糖尿病、肥胖等。在糖尿病中，其特别可用于治疗和预防II型糖尿病。 如上文所用的术语“治疗”表示当化合物用于表现出疾病的症状的个体时， 其可以中断或延迟疾病的发展；而如上文所用的术语“预防”表示当化合物 用于不表现出疾病的症状但具有疾病发生的风险的个体时，其可以中断或 延迟疾病的迹象。

新药物的物理和化学特性的研究对于新药的高效和成功开发是必需 的。特别地，通过研究药物的多晶型物和假多晶型物的存在以及各多晶型 物之间物理和化学特性的差异，可以鉴于药学方面选择药物的优选晶形 (Remington’s Pharmaceutics, Chapter 75 Preformulation); (Byrn, S.R., Solid  State Chemistry of Drugs, Academic Press, New York, 1982)。当多晶型物存在 于溶液中时，它们是化学上相同的，但是在固体状态下，它们各自具有明 显不同的X-射线衍射图样，并且在各种物理和化学特性中表现出差异。特 别地，由于溶出速率的差异，各多晶型物可以具有生物利用度的差异，并 且在热力学稳定性方面表现出不期望的特性。

当某种药物以多晶型物的形式存在时，可以获得具有不同结构的晶形， 这取决于制备该药物过程中的重结晶条件如重结晶溶剂、药物浓度、加热 和冷却速率、温度、搅拌速率等。因此，为了获得相同的晶形，需要特别 注意制备过程的管理。

作为假多晶型物之一的水合物在药物的晶体内包含水分子，并且具有 不同于无水物(anhydrate)的晶形。晶体结构的差异可以通过X-衍射图样来 区分。因为在水合物中，仅物理特性如结晶性、吸湿特性、熔点、溶解性、 溶解速率等改变，提供药理作用的化学特性没有任何改变，因此它们在药 学方面具有非常重要的意义，如多晶型物(Morris,K.R.et al.,Int.J.Pharm., 108,1994,15-206)。

目前从与本发明所属技术领域相关的各种参考文献理解的知识是对于 包括药物稳定性、吸湿特性等在内的药学特性的改进，没有普遍的倾向， 例如，优选水合物而不是无水物或者反之亦然。最终，各化合物的具有最 佳药学特性的形式的确定必须由相关技术领域的技术人员通过连续研究具 体进行。

特别地，不可能预见在某种药物的任何可考虑的形式(即游离化合物、 盐、无水物和水合物)中哪种可以表现出吸湿特性的稳定性，不根据环境湿 度改变。此外，在水合物中，不可以预测最稳定的水合数。并且，即使水 合数相同，也不可预测哪种晶形是最稳定的。这是不一致地显示的现象， 因为其不可以预见，并且属于仅可以通过重复实验来证实的实验领域。

发明内容

技术问题

因此，本发明人进行深入研究以提供化合物1的稳定多晶型物或假多 晶型物。结果是，我们惊奇地发现与无水物或具有相似水合数的其他水合 物相比，化合物1的酒石酸盐的1.5水合物表现出针对相对湿度变化的优越 稳定性，并因此完成本发明。目前，尚无人公开披露化合物1的此种晶形。

解决方案

因此，本发明提供化合物1的酒石酸盐的1.5水合物。

此外，本发明提供制备化合物1的酒石酸盐的1.5水合物的方法。

有利效果

因为作为可以根据本发明开发的晶形获得的化合物1的酒石酸盐的1.5 水合物在稳定性，特别是储存稳定性方面优于相似晶形，其可以非常有利 地用于制备包含化合物1作为活性组分的药物组合物。即，本发明的1.5 水合物在广泛的相对湿度中既不损失晶体中的任何水分子也不再接受水分 子以维持其水含量，因此，随湿度的变化显示重量基本上没有变化。在不 稳定的晶形的情况下，其水含量可以随着储存和配制过程中的环境或添加 剂而变化。例如，在为了定量的目的定量标准材料和样品中，如果实验不 在干燥室中进行，可能引起一些实验误差而带来质量控制的问题。然而， 因为在本发明的1.5水合物中，水含量不随着广泛的相对湿度中的环境而灵 敏地变化，所以在储存和配制过程中通常可以获得具有统一标准的产物， 而且，质量控制中的误差非常小。如上所述，本发明的1.5水合物在操作和 质量控制方面表现出很大优势。

此外，本发明的化合物1的酒石酸盐的1.5水合物随湿度的变化不表现 出晶形的任何变化。与此相反，本发明人已确定，化合物1的酒石酸盐的 0.5水合物和无水物在相对湿度升高时吸收许多水以转化为更稳定的本发 明的1.5水合物。还确定甚至在加速稳定性的实验(40°C/75%RH)中，间隔 几小时后0.5水合物转化为1.5水合物。

此外，可以根据本发明提供的各种方法控制化合物1的酒石酸盐的1.5 水合物的制备。

附图说明

图1示出化合物1的酒石酸盐的1.5水合物的晶形I的X-射线粉末衍 射(XRD)谱。

图2示出化合物1的酒石酸盐的1.5水合物的晶形I的红外光谱(FT-IR)。

图3示出化合物1的酒石酸盐的1.5水合物的晶形I的差示扫描量热 (DSC)或热重(TG)分析的结果。

图4示出化合物1的酒石酸盐的1.5水合物的晶形I的动态蒸汽吸附/ 解吸等温线。

图5示出化合物1的酒石酸盐的0.5水合物的晶形II的X-射线粉末衍 射(XRD)谱。

图6示出化合物1的酒石酸盐的0.5水合物的晶形II的红外光谱 (FT-IR)。

图7示出化合物1的酒石酸盐的0.5水合物的晶形II的差示扫描量热 (DSC)或热重(TG)分析的结果。

图8示出化合物1的酒石酸盐的0.5水合物的晶形II的动态蒸汽吸附/ 解吸等温线。

图9示出水分吸收研究过程中化合物1的酒石酸盐的0.5水合物的晶形 II的X-射线粉末衍射(XRD)谱。

图10示出化合物1的酒石酸盐的无水物的晶形III的X-射线粉末衍射 (XRD)谱。

图11示出化合物1的酒石酸盐的无水物的晶形III的红外光谱(FT-IR)。

图12示出化合物1的酒石酸盐的无水物的晶形III的差示扫描量热 (DSC)或热重(TG)分析的结果。

图13示出化合物1的酒石酸盐的无水物的晶形III的动态蒸汽吸附/解 吸等温线。

图14示出在正常温度和正常湿度下随着时间的推移，化合物1的酒石 酸盐的无水物的晶形III的水分吸收曲线。

图15示出在水分吸收研究期间化合物1的酒石酸盐的无水物的晶形III 的X-射线粉末衍射(XRD)谱。

图16示出进行测试例8的实验后获得的X-射线粉末衍射(XRD)谱，从 下至上顺序示出晶形II的XRD、在60°C/5%RH下储存8周后晶形II的样 品的XRD、在40°C/75%RH下储存8周后晶形II的样品的XRD以及晶形 I的XRD。

具体实施方式

如根据本发明鉴定的各自具有特征性晶形，在本说明书中，化合物1 的酒石酸盐的1.5水合物称为“晶形I”；0.5水合物称为“晶形II”；而无水物 称为“晶形III”。这里，1.5水合物的水含量为3.0～5.5%，0.5水合物的水含 量为1.0～2.5%，而无水物的水含量为0～1.0%。

如可以从图1、5和10所示的X-射线衍射图确定的，晶形I、II和III 的结晶性互相不同。

作为通过晶形I的差示扫描量热分析的结果，在90～130°C下随着释放 晶格中所含的水而出现的吸热峰具有宽的截面，其中包括熔点，并且随着 化合物1的酒石酸盐的化学脱水的进行，吸热峰在130～160°C的截面再出 现一次。此外，热重分析显示等于差示扫描量热法的第一吸热截面中晶格 中所含的水的约4.0%的重量损失，以及等于第二吸热截面中通过脱水从化 合物1的酒石酸盐的结构去除的水的约2.5%的重量损失(图3)。通过差示扫 描量热法分析晶形II和III显示3个吸热点。具体地，第一吸热点随着释放 晶格中所含的水而出现，第二吸热点随着熔点出现，而第三吸热点通过化 学脱水反应出现。而且，根据热重分析，第一吸热截面显示等于晶格中所 含的水的重量损失(在晶形II中约1.3%，而在晶形III中约0.6%)，而第三 吸热截面显示等于通过脱水去除的水的约2.4%的重量损失(图7和12)。因 为如上文所述的化合物1的酒石酸盐的晶格中的水含量与通过Karl-Fischer 法(Mettler Toledo DL37KF库仑计)定量的水含量一致，所以证实吸热峰是 由水分子的蒸发引起的。

此后，我们将通过更具体地比较各晶形的特征来解释本发明的晶形I 与其他晶形II或III相比，在任何方面均具有意想不到的优越特征。

晶形I

本发明涉及化合物1的酒石酸盐的1.5水合物的晶形。作为其特性分析 的结果，晶形I表现出以下特征：

(a)晶形I的水含量在3.0～5.5%范围中。

(b)在CuKα，40kV，30mA下测量的XRD谱的特征峰值(2θ)为15、 18、20、21和23°。

(c)红外(IR)谱显示在约3591、3401、3128、1712、1655、1636、1229、 1205、1129和1058㎝^-1处的特征吸收。

(d)差示扫描量热谱显示在约90～130°C和130～160°C的两个宽温度范 围中的吸热峰。

(e)通过Karl-Fisher法测量的水含量为约4.0%。

(f)当温度从25°C升至250°C时，在70～110°C和140～170°C范围中 分别发生约4.0%和约2.5%的重量损失(这是从图3的TG获得的结果。因 为能量变化比重量变化略晚发生，一般在DSC和TG的结果之间有差异)。

(g)化合物1的酒石酸盐可以从水、乙腈/水、乙醇/水、乙醇/己烷或乙 酸乙酯/己烷溶剂中结晶，并且优选从水中结晶。

(h)晶形I可以通过使晶形II或III进行水分吸收来制备。

(i)不存在重量变化，或者如果有，为0.8%或更少，这取决于在5～95% RH范围中的外部湿度的变化，并且该晶形不随着湿度的变化而变化。

晶形II

为了发现除晶形I以外的其他晶形，本发明人制备了化合物1的酒石 酸盐的0.5水合物(晶形II)。虽然0.5水合物是相同化合物的相同酒石酸盐 并具有相似的水合数，但是与1.5水合物(晶形I)相比，其表现出以下不稳 定的储存稳定性：

(a)晶形II的水含量在1.0～2.5%范围中。

(b)在CuKα，40kV，30mA下测量的XRD谱的特征峰值(2θ)为14、 15、17、18、19、21和23°。

(c)红外(IR)谱显示在约3455、2891、1721、1655、1571、1228、1209、 1131、1086和1059㎝^-1处的特征吸收。

(d)差示扫描量热谱显示在约80～115°C、115～135°C和135～173°C的 三个宽温度范围中的吸热峰以及在约117°C的熔点。

(e)通过Karl-Fisher法测量的水含量为约2.0%。

(f)当温度从25°C升至250°C时，在70～104°C和137-168°C范围中分 别发生约1.3%和约2.4%的重量损失。

(g)在5～95%RH范围中的外部湿度变化中发生4.0%或更多的重量变 化，并且从45%RH开始迅速吸收水分，在75%RH产生3.7%的重量增加。 如果包含总计4.0%或更多的水分，则晶形II转化为晶形I。据证实从约60% RH开始晶形II转化为晶形I(见图8和9)。即，晶形随着湿度的改变而变 化以达到更稳定的晶形I。此外，在加速(40°C/75%RH)稳定性测试中其在8 周内转化为晶形I。

晶形III

为了发现除晶形I以外的其他晶形，本发明人制备了化合物1的酒石 酸盐的无水物(晶形III)。与1.5水合物(晶形I)相比，该无水物表现出以下 不稳定的储存稳定性。

(a)晶形III的水含量在0～1.0%范围中。

(b)在CuKα，40kV，30mA下测量的XRD谱的特征峰值(2θ)为6、17、 21、23、24、26和30°。

(c)红外(IR)谱显示在约3470、3187、2940、1640、1570、1229、1206、 1130和1056㎝^-1处的特征吸收。

(d)差示扫描量热谱显示在约65～100°C、100～130°C和132～170°C的 三个宽温度范围中的吸热峰以及在约104°C的熔点。

(e)通过Karl-Fisher法测量的水含量为约0.1%。

(f)当温度从25°C升至250°C时，在62-110°C和120-173°C范围中分 别发生约0.6%和约2.4%的重量损失。

(g)在5～95%RH范围中的外部湿度变化中发生3.5%或更多的重量变 化，并且从5%RH开始迅速吸收水分，从而从约15%RH开始晶形III转 化为晶形I(见图13、14和15)。即，晶形随着湿度的改变而变化以达到更 稳定的晶形I。

上述结果表明在常规操作制剂的相对湿度范围中，晶形II和III不稳定， 因此自动转化为晶形I。这种倾向在晶形III的情况下表现更明显。

本发明的化合物1的酒石酸盐的1.5水合物以与韩国专利申请第 10-2006-0029138号中公开的相应的游离碱相同的方式表现出强DPP-IV抑 制活性。此外，本发明的1.5水合物与具有其他水合状态的晶形相比表现出 改善的物理和化学特性。因此，本发明的1.5水合物与具有其他水合状态的 晶形相比相当易于操作、质量控制和配制。

本发明的1.5水合物具有如上文所述的DPP-IV抑制活性，因此，可以 配制用于药学和兽医领域中的方便给药。配制可以根据与具有DPP-IV抑制 活性的其他制剂相关的领域中已知的技术和方法来进行，特别参考韩国专 利申请第10-2006-0029138号的公开，其整体援引加入本文。

因此，本发明的范围覆盖用于抑制DPP-IV的药物组合物，其包含本发 明的1.5水合物作为活性组分以及药学可接受的载体。本发明的组合物的特 征在于其特别用于治疗和预防糖尿病和肥胖。

本发明通过以下实施例和测试例来更详细地说明。然而，仅提供以下 实施例和测试例以辅助理解本发明，而不是为了通过这些实施例和测试例 以任何方式限制本发明的范围。

实施例1化合物1的酒石酸盐的1.5水合物(晶形I)的制备

将1.87Kg化合物2溶于约9L乙醇。在0～10℃下加入0.94Kg的SOCl₂， 然后在保持低温的同时搅拌。在减压下浓缩后，将浓缩物溶于11.2L的 MTBE(甲基叔丁基醚)，并且将所得的混合物用10N NaOH溶液调整至pH 7～8。在分离层后，将水层用约3.7L的MTBE萃取并用3.7L的MTBE萃 取两次，然后在减压下浓缩。将所得的褐色混浊溶液溶于12L乙醇，向其 加入溶于约1.5L水的0.47kg的L-酒石酸，然后搅拌1小时。将所得的结 晶浆过滤，用水和乙醇(1:8)洗涤，然后干燥以获得1.13kg(收率97.5%)的 标题化合物。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ2.38(m,2H),2.59(m,2H),2.82–2.99(m, 2H),3.11(bt,1H),3.21(bt,1H),3.50–3.55(m,1H),3.72–3.91(m,5H),3.98 (t,J=5.2Hz,1H),4.38(s,2H),4.97–5.00(m,2H).

实施例2化合物1的酒石酸盐的1.5水合物(晶形I)从水中重结晶

将从实施例1获得的50g化合物1的酒石酸盐加入250～500ml水中并 溶于水，同时用10N NaOH将溶液调整至pH6～7。加入溶于23.5ml水的 11.7g的L-酒石酸，并且如下文表1所示，随着改变温度、搅拌速率和搅 拌时间获得晶体。然后，将晶体过滤并干燥以获得晶形I。搅拌速率在50～400 rpm范围中变化，而温度在5～32℃范围中变化。用于重结晶的水的体积、 搅拌速率、温度和搅拌时间如下文表1所示。

表1

实施例3化合物1的酒石酸盐的1.5水合物(晶形I)从混合溶剂中重结晶

将5g化合物1的酒石酸盐溶于25～60ml包含不同比例的水和乙腈的 溶剂混合物。随着改变温度在搅拌存在或不存在的情况下沉淀晶体，将晶 体过滤并干燥以重结晶化合物1的酒石酸盐。用于重结晶的条件如下文表2 所列。

表2

测试例1粉末X-射线衍射学

将约20mg样品装入样品容器并安装在粉末X-射线衍射计上以获得 3～40°/2θ范围中的衍射图样。获得的衍射图样附至本说明书，分别如图1、 5和10。分析的具体条件如下。

仪器：Bruker4D Endeavor

每步的时间：0.3s

步长：0.03°

扫描模式：分步

电压/电流：40kV/30mA

Cu-靶标(Ni-滤器)

发散缝隙：0.3

检测器：PSD:LynxEye

仪器：Philips X-射线发射器(PW1710)

每步的时间：0.5s

步长：0.03°

扫描模式：分步

电压/电流：40kV/30mA

Cu-靶标(Ni-滤器)

源缝隙：1.0mm

检测器缝隙：0.15mm,1.0mm

测试例2红外光谱法

本发明的各晶形的红外光谱图利用提供有DTGS检测器的ZASCO FT-IR4200来获得。各光谱图的分辨率为4cm^-1，并且扫描数为16。在本测 试例中，将1～2mg样品放置在ATR(衰减全反射)的附件上并操作设备以获 得光谱图。通过在ATR中没有任何材料而操作设备来获得背景数据。因此 获得的光谱图附至本说明书，分别如图2、6和11。

测试例3差示扫描量热法(DSC)

利用Mettler Toledo’s DSC821^e进行差示扫描量热法(DSC)。将约2～3mg 样品装入铝盘，并且准确记录其重量。将盘用盖子盖上，将盖子戳个洞。 将盘装在设备上，并且在氮气通气下以10℃/min的速率从25加热至250℃。 铟金属用作校准的标准品。因此获得的光谱图附至本说明书，分别如图3、 7和12。

测试例4热重分析法(TG)

利用Mettler Toledo TGA850进行热重分析法(TG)。将约4～5mg样品 装入铝盘。将盘装在设备上，然后在氮气通气下以10℃/min的速率从25 加热至250℃。Nickel and Aluminum^TM用作校准的标准品。获得的TG分析 的结果附至本说明书，分别如图3、7和12，以及根据所述测试例3的DSC 分析的结果。

测试例5动态蒸汽吸附/解吸分析

在VTI-SA蒸汽吸附分析仪上收集动态蒸汽吸附/解吸数据。在维持 25℃的同时，在相对湿度(RH)5～95%范围中以5%RH的间隔重复蒸汽吸附 和解吸3次。在分析之前不将样品干燥。用于分析的平衡标准品是在2分 钟内重量变化少于0.01%的平衡标准品。

作为分析的结果，图4示出晶形I的蒸汽吸附/解吸等温线的结果，由 此可以看到随5～95%RH范围中的外部湿度变化，晶形I表现出0.8%或更 少的重量变化。即，本发明的晶形I针对相对湿度的变化非常稳定。图8 示出晶形II的蒸汽吸附/解吸等温线的结果，由此可以看到在晶形II中，在 初始水分吸收测试中当相对湿度升至95%时，重量增加4.3%。水分解吸后， 晶形II给出与晶形I相同的水分行为图。由这个结果，可以证实在初始水 分吸收的过程中，晶形II转化为晶形I。图13示出晶形III的蒸汽吸附/解 吸等温线的结果，由此可以看到在晶形III中，当相对湿度升至95%时，重 量增加3.6%。此外，可以看到降低湿度引起0.6%或更少的水分解吸，从而 晶形III变为包含与晶形I相同的水含量。

测试例6水分吸收期间晶形II的粉末X-射线衍射测试

将约50mg晶形II放置于玻璃小瓶中，分别置于11%、32%、53%、 64%、78%和97%的相对湿度下两天或更多天以诱导水分吸收，然后根据如 所述测试例1所示的条件进行粉末X-射线衍射以鉴定水分吸收时晶形的任 何变化(见图9)。

通过制备如下文表3所示的盐的饱和水溶液并将溶液放置在干燥器中， 然后密封来提供各相对湿度。

表3

相对湿度11% LiCl的饱和水溶液 相对湿度32% MgCl₂的饱和水溶液 相对湿度53% Mg(NO₃)₂·6H₂O的饱和水溶液 相对湿度64% NaNO₂的饱和水溶液 相对湿度78% NaCl的饱和水溶液 相对湿度97% KNO₃的饱和水溶液

测试例7水分吸收期间晶形III的粉末X-射线衍射测试

将晶形III放置在XRD容器上并在一定时间中(30分钟、1小时和5小 时后)进行XRD，同时允许在空气下于室温下水分吸收(见图15)。此外，多 次记录在空气下于室温下的重量变化以获得图(见图14)。可知晶形III迅速 吸收水，从而其在约1小时内转化为晶形I。

测试例8晶形I和晶形II的热稳定性

将各约50mg晶形I和晶形II放置于Duma瓶中，然后保持在40±2℃、 75±5%RH或60±2℃、5±5%RH下。2周、4周和8周后，从Duma瓶取 出各样品并通过XRD分析以鉴定晶形的任何变化，通过HPLC分析以鉴定 稳定性。对于HPLC分析，将样品溶于乙腈/水/三氟乙酸=30/70/0.1(v/v/v) 的混合物，然后进行分析。HPLC分析的条件如下：

HPLC分析的条件

柱：Atlantis dC18(4.6mm I.D x250mm L，粒径5μm，Waters)

柱温度：10℃

流动相：

流动相A:MeCN/TFA=100/0.1(v/v)

流动相B:H₂O/TFA=100/0.1(v/v)

梯度条件：

时间(min.) A(%) B(%) 初始 38 62 25 38 62 35 80 20 40 38 62 55 38 62

流速：0.7ml/min.

检测：256nm,UV

进样体积：10μl

总分析时间：55min.

晶形I和晶形II的稳定性的结果如下文表4所示。

表4

如表4所示，可以证实当将晶形I和晶形II保持在40±2℃、75±5%RH 或60±2℃、5±5%RH下时，它们表现出长达8周的优越稳定性。然而，根 据XRD分析的结果，晶形I长达8周未表现出任何变化，但是晶形II在 40°C/75%RH的条件下在8周时转化为晶形I(见图16)。

测试例9确定晶形I和晶形II的密度

将各约20～30ml晶形I和晶形II引入50ml量筒。这里，将样品缓慢 引入，从而它们不互相紧密接触。在读取量筒上的刻度之后，测量其重量 以计算堆密度。在测量堆密度之后，将包含样品的量筒放在ERWEKA密度 计上，然后使其脉冲250次以测量振实密度(表5)。测量的结果显示晶形I 的堆密度和振实密度高于晶形II。从堆密度和振实密度计算Carr指数。结 果，其在晶形I中低于晶形II。因为一般理解Carr指数越低，流动性越好， 所以通过比较Carr指数可以确定晶形I与晶形II相比在包括压片在内的加 工过程中可以容易地操作。

表5

确定晶形I和晶形II的密度和粒径