鉴别纯化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法

摘要

本发明公开了一种鉴别纯化后的胸腺肽α1是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤：(1)将固相合成的胸腺肽α1进行第一次纯化和第二次纯化；(2)将两次纯化后的胸腺肽α1纯品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在20.78min时出现峰面积为0.36％的峰或在27.19min时出现峰面积分别为0.47％的峰，则说明纯化后的胸腺肽α1中含有缺失肽。本发明方法可以准确、灵敏的鉴别出胸腺肽α1纯品是否含有缺失肽，可以有效地保障和控制胸腺肽α1的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α1中有重要应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及胸腺肽α1的质量检测方法，尤其涉及一种鉴别纯化后的胸 腺肽α1是否含有缺失肽的方法，属于胸腺肽α1的固相合成和检测领域。

背景技术

胸腺肽α1是从胸腺素组分5(TF-5)中分离出的一种活性多肽，由28 个氨基酸残基组成，分子量为3108.37。在TF-5中，胸腺肽α1的含量为 0.6％，是人体胸腺激素的重要活性组分。例如胸腺肽α1可调节T淋巴细 胞发育、分化和成熟。此外，胸腺肽α1能修复受损的T淋巴细胞。虽然 从TF-5中分离的胸腺肽α1无明显毒副反应，但由人工固相合成的市售胸 腺肽α1可因不纯而造成不良反应。

目前，人工固相合成胸腺肽α1的操作规程于篇律，几乎没有优化空间。 市售的保护氨基酸和相关试剂的纯度也足以支持人工固相合成高纯度胸腺肽 α1。在操作规程不出差错的前提下，人工固相合成的胸腺肽α1是否纯，取决 于它含的缺失肽的状况。

与小分子药物不同，多肽的生物活性非常强。在人工固相合成的胸腺肽α1 中，即使存在微量的缺失肽也可造成严重的毒副作用。控制人工固相合成的 胸腺肽α1的质量的关键是控制缺失肽。目前国内外即没有披露人工固相合成 的胸腺肽α1中的缺失肽状况，也没有公开测定人工固相合成的胸腺肽α1中 的缺失肽的方法。这种状态不适应胸腺肽α1的临床地位。为了改善这种状况， 保障胸腺肽α1的临床用药安全性，形成了本发明。

发明内容

本发明的主要目的是提供种能够准确、灵敏的检测鉴别纯化后的胸 腺肽α1是否含有缺失肽的方法；

本发明的另一个目的是提供纯化后的胸腺肽α1的缺失肽谱并将该缺 失肽谱作为胸腺肽α1固相合成中的质量控制物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种鉴别胸腺肽α1纯品是否含有缺失肽的方法，包括以下步骤：(1) 将固相合成的胸腺肽α1进行纯化；(2)将纯化后的胸腺肽α1纯品采用 LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在 20.78min时出现峰面积为0.36％的峰或在27.19min时出现峰面积分别为 0.47％的峰，则说明纯化后的胸腺肽α1中含有缺失肽。

其中，所述缺失肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。

本发明中所述的胸腺肽α1纯品可以是采用本领域的常规纯化方法进 行纯化后所得到的纯品；作为参考，本发明中所述的胸腺肽α1纯品可以采 用以下所述的方法进行两次纯化，其中，第一次纯化胸腺肽α1的方法优选 为：采用配备Waters 2487检测器、Waters 600泵和迪马C ₁₈制备柱的制备 型HPLC进行纯化；紫外检测波长为215nm，用A和B梯度洗脱，流速 为10ml/min，梯度为0-5min，10％A/90％B；5-10min，15％A/85％B；10-20 min 18％A/82％B；20-70min 25％A/75％B；其中A为含0.09％TFA的乙腈，B 为含0.1％TFA的水。

所述的第二次纯化胸腺肽α1的方法优选为：采用配备Waters 2487检 测器、Waters 600泵和迪马C₁₈制备柱的制备型HPLC进行纯化；紫外检 测波长为215nm，用乙腈/醋酸/水梯度洗脱，流速为10ml/min，梯度为0-5 min，10％乙腈/1％醋酸/90％水；5-10min，由10％乙腈/1％醋酸/90％水变至 15％乙腈/1％醋酸/85％水；10-20min，由15％乙腈/1％醋酸/85％水变至18％ 乙腈/1％醋酸/82％水；20-70min，由18％乙腈/1％醋酸/82％水变至25％乙腈 /1％醋酸/75％水。

其中，所述纯化方法中的迪马C ₁₈制备柱的规格优选为10μm、250× 21.2mm。

步骤(2)中所述的梯度洗脱条件优选为：用0.1％甲酸/乙腈进行梯度 洗脱，流速为0.4ml/min；梯度为：0-30min，由0.1％甲酸/乙腈＝90/10变 至0.1％甲酸/乙腈＝80/20；30-35min，由0.1％甲酸/乙腈＝80/20变至 0.1％甲酸/乙腈＝75/25。

本发明方法中LC/MS联用仪中的LC采用Agilent 1200自动进样， Waters Xterra RP 18分析柱的规格为5μm，3.0×150mm；LC/MS联用仪中 的MS采用Bruker Solatix FT-ICR-MS，离子流检测器。

本发明进一步提供了胸腺肽α1纯品的缺失肽谱，其氨基酸序列为 SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；可将所述的缺失肽作为胸腺肽α1固相 合成中的质量控制物。

本发明方法可以准确、灵敏的鉴别出胸腺肽α1纯品是否含有缺失肽， 可以有效地保障和控制胸腺肽α1的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α1 中有重要应用价值。

附图说明

图1胸腺肽α1纯品的离子流.

图2胸腺肽α1纯品的质谱.

图3胸腺肽α1纯品中的缺失肽

Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-I le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu- Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID No.1)的质谱。

图4胸腺肽α1纯品中的缺失肽

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Asp-Leu-Lys- Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(SEQ ID No.2)的质谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围 构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和 范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改 和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1固相合成胸腺肽α1

1.制备Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin

称取10g(3.1mmo1)Wang Resin置于固相反应合成柱中。加入60ml  DCM溶胀树脂10min，抽走DCM。用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹 气两分钟，抽走溶剂。于磨口三角瓶中称取5.5g(9.3mmo1)Fmoc-Asn(Trt) 和1.38g(10.23mmol)HOBt，加入50ml DMF溶解。在冰水浴中冷却下 加2.15ml(13.95mmol)DIC活化5min。将活化后的氨基酸加入用DMF 洗好的树脂中，然后加入0.23g(1.86mmol)DMAP，用氮气吹气进行搅拌， 室温反应2-4h。反应结束后用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分 钟，抽干溶剂。取少量树脂，用甲醇收缩三次，真空干燥至恒重，测替代 值，如替代值达到预期，将树脂用乙酸酐封闭未反应的羟基，封闭反应2- 4h后，用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。用甲醇 收缩树脂三次，每次50ml，吹气5min，抽走溶剂，真空干燥至恒重，测 替代值。如替代值达到预期。

2.Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin的溶胀和脱Fmoc

上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反应合成柱中，加 60ml DCM溶胀10min，然后抽走DCM。用DMF洗涤树脂，每次用50ml

DMF，每次洗2min，共洗三次。用浓度为20％的piperidine的DMF溶 液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，一次脱3min，另一次脱8min。然 后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM 洗涤Asn(Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗两次。抽走溶剂。树脂对 茚三酮显黄色。

3.制备Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin

称取2.12g(4.98mmol)Fmoc-Glu(OtBu)和0.74g(5.5mmol)HOBt   于干燥磨口三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷却。加1.15ml (7.47mmol)DIC活化5min。然后将活化后的氨基酸加到上面得到的 Asn(Trt)-Wang Resin中反应2h。抽走反应液。用DMF洗涤树脂，每次 用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。树脂对茚三酮不显色。用浓度 为20％的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，第一 次脱3min，第二次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF 洗2min，共洗四次。最后用DCM洗涤树脂，每次洗2min，共洗两次。 抽走溶剂。树脂对茚三酮显黄色。

4.制备

Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)- Glu-

(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu )-Lys(Boc)-

Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt )-Wang Resin

按照制备Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin的方法依次将1.55g(4.98 mmol)Fmoc-Ala，2.12g(4.98mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，2.12g(4.98mmol) Fmoc-Glu(OtBu)，2.53g(7.47mmol)Fmoc-Val，2.53g(7.47mmol) Fmoc-Val，3.17g(7.47mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，3.50g(7.47mmol) Fmoc-Lys(Boc)，4.67g(9.96mmol)Fmoc-Lys(Boc)，4.23g(9.96mmol) Fmoc-Glu(OtBu)，4.67g(9.96mmol)Fmoc-Lys(Boc)，3.52g(9.96mmol) Fmoc-Leu，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp(OtBu)，4.67g(9.96mmol) Fmoc-Lys(Boc)，3.96g(9.96mmol)Fmoc-Thr(tBu)，3.96g(9.96mmol) Fmoc-Thr(tBu)，3.52g(9.96mmol)Fmoc-Ile，3.17g(7.47mmol) Fmoc-Glu(OtBu)，2.86g(7.47mmol)Fmoc-Ser(tBu)，2.86g(7.47mmol) Fmoc-Ser(tBu)，2.97g(7.47mmol)Fmoc-Thr(tBu)，3.07g(7.47mmol) Fmoc-Asp(OtBu)，2.53g(7.47mmol)Fmoc-Val，2.32g(7.47mmol) Fmoc-Ala，3.10g(9.96mmol)Fmoc-Ala，4.09g(9.96mmol) Fmoc-Asp(OtBu)和3.81g(9.96mmol)Fmoc-Ser(tBu)偶联到 Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin上并脱Fmoc。

5.制备

Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)- Glu-

(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu) -Lys(Boc)-

Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt) -Wang Resin

0℃下将1.18ml(12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中与50ml DMF混合，然后加0.44ml(2.49mmol)DIPEA活化5min。将活化后的乙 酸酐与Ser(tBu)-Asp(OtBu)

-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu) -Thr(tBu)-Lys-

(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-V al-Val-Glu-(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin反应2 h。抽走反应液。树脂用DMF洗涤4次，每次50ml DMF，每次洗2min。 树脂用DCM洗涤2次，每次用50ml DCM，每次洗3min。抽走溶剂。 树脂对茚三酮不显色。树脂用MeOH收缩3次，每次用50ml MeOH，每 次收缩5min，抽干。得18.5g干燥肽树脂。低温保存。

6.从

Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)- Glu-

(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu) -Lys(Boc)-

Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt) -Wang Resin切害胸腺肽α1

0℃下将18.5g干燥的肽树脂与180ml裂解液(TFA/TIS/H₂O)反应0.5h， 室温反应2.5h。反应结束后，用砂芯漏斗过滤分离树脂。树脂用少量TFA 洗涤三次。合并的滤液用0℃的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α1粗品。 离心分离出胸腺肽α1粗品。胸腺肽α1粗品用0℃的乙醚洗涤粗肽三次， 用N2吹走残余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α1粗 品，收率为81％，含量为68％。

实施例2固相合成胸腺肽α1的纯化

1.固相合成胸腺肽α1的一次纯化

Waters 2487检测器，Waters 600泵，迪马C ₁₈制备柱(10μm，250×21.2 mm)，紫外检测器，波长215nm，TFA/乙腈/水梯度洗脱，洗脱梯度列入表 1。

表1胸腺肽α1粗品一次纯化的洗脱梯度

将6.27g固相合成胸腺肽α1粗品溶于250ml水，先用氨水调节pH 8， 再用醋酸调节pH 5，过滤，滤液上柱。按表1梯度洗脱，收集馏分，冷冻 干燥，得到的固体进行二次纯化。

2.固相合成胸腺肽α1的二次纯化

Waters 2487检测器，Waters 600泵，迪马C₁₈制备柱(10μm，250×21.2 mm)，紫外检测器，波长215nm，TFA/乙腈/水梯度洗脱，洗脱梯度列入表 2。

表2胸腺肽α1粗品二次纯化的洗脱梯度

将经一次纯化的固相合成胸腺肽α1粗品80ml水，先用氨水调节pH 8， 再用醋酸调节pH 5，过滤，滤液上柱。按表2梯度洗脱，收集馏分，先减 压浓缩除去乙腈和醋酸，残留的水溶液冷冻干燥，得到1.45g纯度为99.5％ 的胸腺肽α1。总收率为18.7％。

实施例3固相合成胸腺肽α1二次纯化之后的缺失肽谱的鉴别

取少量固相合成胸腺肽α1经二次纯化获得的纯品在LC(Agilent 1200 自动进样，Waters Xterra RP18分析柱，5μm，3.0×150mm)/MS(Bruker  Solatix FT-ICR-MS，离子流检测器)联用仪上进行分析。用0.1％甲酸/乙腈 梯度洗脱，洗脱梯度列入表3。离子流谱见图1。图1由3个峰构成，它们 分别出现在20.78min，22.30min和27.19min。它们的峰面积分别为0.36％， 99.16％和0.47％。

表3胸腺肽α1纯品的洗脱梯度

出现在22.30min的峰的对应的质谱图见图2，该离子的质量为 1036.88553×3，是胸腺肽α1

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的理论质量数3107.50748 加3H。

出现在20.78min的峰的对应的质谱图见图3，该离子的质量为 969.51749×3，是胸腺肽α1

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Ser和Asp的理论质量 数2905.44851加3H。

出现在27.19min的峰的对应的质谱图见图4，该离子的质量为 994.17268×3，是胸腺肽α1

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn缺失Lys的理论质量数 2979.41252加3H。

上述结果表明，固相合成的胸腺肽α1粗品按照本发明在制备型HPLC 上经过两次纯化、在本发明的HPLC-MS条件下提取纯品的离子流谱，然 后分析各个峰对应的缺失肽序列。出现在20.78min的是缺失肽

Ac-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys- Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(含量为0.36％)，出现在22.30min 的是胸腺肽α1(含量为99.16％)，出现在27.19min的是缺失肽

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Asp-Leu-Lys-Gl u-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn(含量为0.47％)。可见，本发 明鉴别方法在固相合成的胸腺肽α1粗品的纯化中有重要的应用价值。