具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的DNA片段及其应用

摘要

本发明涉及一种具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的DNA片段及其应用。该DNA片段为SEQNO1所示的碱基序列。本发明设计DIAPH1基因的干扰质粒，并应用脑胶质瘤细胞模型研究其对细胞迁移和侵袭的抑制作用，为胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的DNA片段及其应用。

背景技术

脑胶质瘤（Gliolma）是起源于中枢神经系统的一种常见的恶性肿瘤，其特点为侵润性生长，与正常的脑组织无明显界限，多数不限于一个脑叶，向脑组织外呈指状深入破坏脑组织，其发病率约占成人颅内肿瘤的35%～60%。近年来，因其预后差、病死率高等特点使得单纯手术治疗恶性脑胶质瘤的存活率很低。患有恶性脑胶质瘤的病人通常预后很差，特别是老年人，在美国，每年大约有10,000人会患此病，但50%的病人在治疗之后的平均存活时间也不到12个月， 面临这种现状，研究一种对恶性脑胶质瘤有效的治疗体系迫在眉睫。

DIAPH1是属于果蝇透明基因的一种同源性基因。其表达的蛋白因具有成蛋白同源结构域FH1和FH2而从属于成蛋白家族，在应力纤维，丝状伪足，黏着斑，微管的形成中起重要作用。同时该蛋白作为肌动蛋白成核因子，它参与了众多以肌动蛋白为基础的生物学过程，包括形态发生、胞质分裂、细胞极性的形成、细胞黏附和运动等，并常在病理情况下如肿瘤分化、侵袭和转移中表达失调。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的DNA片段。

本发明的目的之二在于提供含有该DNA片段的干扰质粒。

本发明的目的之三在于提供该干扰质粒的制备方法。

本发明的目的之四在于提供该DNA片段在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的DNA片段，其特征在于该DNA片段为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种制备上述的具有抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭功能的DNA片段的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit中的设计要求，设计对应于DIAPH1基因的干扰DNA片段，即GGA ACA AGC ATG AGA TCA TTC的shRNA的寡核苷酸序列，各为62bp。

一种干扰质粒，其特征在于该质粒含有上述的片段。

一种制备上述的干扰质粒的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit基因质粒构建试剂盒中载体设计的具体要求，将上述的shRNA的寡核苷酸序列引物和pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector进行连接，得到DIAPH1基因的干扰质粒。

一种上述的用于抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭的DNA片段在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

本发明设计DIAPH1基因的干扰质粒，并应用脑胶质瘤细胞模型研究其对细胞迁移和侵袭的抑制作用，为胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。

附图说明

图1为pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector 图。

图2为Western blot分析脑胶质瘤细胞系U87中DIAPH1的蛋白表达量变化。其中None为：未转染对照组；NC为：阴性对照组；RNAi为：转染DIAPH1基因干扰质粒组。

图3为Radius?? 24-Well Cell Migration Assay分析脑胶质瘤细胞系U87迁移的能力。其中None为：未转染对照组；NC为：阴性对照组；RNAi为：转染DIAPH1基因干扰质粒组。

图4为BD BioCoat?? Matrigel?? Invasion Chamber分析脑胶质瘤细胞系U87侵袭的能力。其中A为：未转染对照组；B为：阴性对照组；C为：转染DIAPH1基因干扰质粒组；D为：统计分析图，其中None为：未转染对照组；NC为：阴性对照组；RNAi为：转染DIAPH1基因干扰质粒组。

具体实施方式

一、脑胶质瘤细胞系U87的培养：脑胶质瘤细胞系U87培养于37℃，5%CO₂恒温培养箱。当细胞进入对数生长期时，吸去培养皿中的旧培养液，用2ml无菌Hanks清洗，以除去含有胰蛋白酶抑制剂的血清，加入1ml 0.05%Trypsin-EDTA-D-Hanks溶液于培养皿中，37℃，5%CO₂ 培养箱中放置2min，然后在显微镜下观察细胞是否分离皿壁（如未分离完全，可适当延长胰酶消化的时间，直至基本完全分离）；加入2ml新鲜培养液，用枪轻轻吹打，再加入适量培养液以易于混匀细胞；取1ml细胞悬液加入装有2ml新鲜培养基的新培养皿中，放入37℃，5%CO₂ 培养箱中培养，约3天左右传代1次（主要看细胞有无铺满细胞培养皿）。

 

二、DIAPH1基因干扰质粒与阴性对照质粒的设计和转染：根据pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit中设计的具体要求，设计对应于DIAPH1基因 (GGA ACA AGC ATG AGA TCA TTC)的shRNA的寡核苷酸序列，各为62bp，并进行合成。

该shRNA的寡核苷酸序列为：

Sense： 5’- CAC CGG AAC AAG CAT GAG ATC ATT CTT CAA GAG AGA ATG ATC TCA TGC TTG TTC CTT TTT TG-3’

Anti-sense:：5’- gaT CCA AAA AAG GAA CAA GCA TGA GAT CAT TCT CTC TTG AAG AAT GAT CTC ATG CTT GTT CC-3’；

根据pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit中设计的具体要求，设计阴性对照，即不会干扰细胞中任何基因表达(GTT CTC CGA ACG TGT CAC GT)的shRNA的寡核苷酸序列引物，各为59bp，并进行合成。

阴性对照的shRNA对应的序列为：

Sense： 5’- CAC CGT TCT CCG AAC GTG TCA CGT CAA GAG ATT ACG TGA CAC GTT CGG AGA ATT TTT TG-3’

Anti-sense:：5’-GAT CCA AAA AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT AAT CTC TTG ACG TGA CAC GTT CGG AGA AC-3’

根据pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit中设计的具体要求，将前面设计的两种shRNA的寡核苷酸序列分别和pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector连接，然后分别转染脑胶质瘤细胞系U87。

转染前一天，将细胞接种至24孔细胞培养板上，用不含抗生素的DMEM培养基培养，待细胞汇合度达到60%-70 %时，进行FuGENE^?? HD Transfection Reagent介导的DNA转染。

100μl不含血清的无抗DMEM培养基稀释2μg质粒，轻轻混合；随后稀释3μl FuGENE^?? HD Transfection Reagent到上述已加入质粒的100μl DMEM无抗无血清培养基中，轻轻混合后室温下孵育15分钟。将以上转染复合物加入到每一个待转细胞的孔中，轻轻前后摇动培养板混合。细胞在37 ℃，5%CO₂饱和湿度下常规培养。

 

三、实验分组与检测指标  未转染对照组：正常培养的脑胶质瘤细胞系U87；阴性对照组：转染阴性对照质粒的脑胶质瘤细胞系U87。实验组: 转染DIAPH1基因干扰质粒的脑胶质瘤细胞系U87。

    DIAPH1基因表达下调的检测：用Western blot技术检测。

脑胶质瘤细胞系U87迁移能力的检测：用Radius?? 24-Well Cell Migration Assay检测。

脑胶质瘤细胞系U87侵袭能力的检测：用BD BioCoat?? Matrigel?? Invasion Chamber检测。

 

四、结果

1．在转染三天后，抽提脑胶质瘤细胞的总蛋白，用DIAPH1特异性的抗体进行Western blot分析。结果表明，转染DIAPH1基因干扰质粒组中DIAPH1的蛋白表达量明显低于未转染对照组和阴性对照组中DIAPH1的蛋白表达量，参见图2。

2. 在转染后，用Radius?? 24-Well Cell Migration Assay分析细胞迁移能力。结果表明，转染DIAPH1基因干扰质粒组中细胞的迁移能力明显低于未转染对照组和阴性对照组，参见图3。

3. 在转染两天后，用BD BioCoat?? Matrigel?? Invasion Chamber分析细胞侵袭能力。结果表明，转染DIAPH1基因干扰质粒组中细胞的侵袭能力明显低于未转染对照组和阴性对照组，参见图4。