依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法

摘要

本发明公开了一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，属于生物医药领域。该方法采用反相液相色谱法，利用带紫外检测器的高效液相色谱仪对肝素苄基酯在碱性环境下脱落生成的苯甲醇进行定量检测，并以此反映肝素苄基酯的酯化率，从而达到控制依诺肝素钠成品质量的目的。与现有技术相比，本发明的检测方法可以简单、快速、准确地监测肝素苄基酯的酯化率，从而降低依诺肝素钠成品的不合格风险和企业生产成本，具有很好的推广应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄 基酯的酯化率的检测方法。

背景技术

肝素类药物是抗凝血药的首选药物，使用历史已有70多年，除具有抗凝血、 抗血栓作用外，还有降血脂等作用，但具有生物利用度低、副作用大等缺陷， 限制了肝素在临床上的应用。近年来具有高抗栓活性和低出血副作用的新一代 抗凝药物——低分子量肝素(LMWH)被开发上市。新一代抗凝药的抗血栓作 用优于肝素，而抗凝血作用却低于肝素，并具有生物利用度高、体内半衰期长、 出血倾向小、口服易吸收等特点。除用于治疗血栓病外，还可抑制动脉粥样硬 化，抗肿瘤、抗炎等，且临床应用无需监护，用药便捷。

低分子量肝素(LMWH)(Robert J.Linhardt，PH.D.And Nur Sibel  Guany，M.S，Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25(3)：5-16)是在分离普通 肝素时得到的一些低分子量组分，或肝素裂解后产生的小分子片段，长度约普 通肝素的1/3。LMWH分子量在3000-8000Da之间，平均分子量为5000Da 左右。与普通肝素相比，通过体内、外实验发现，在同等剂量下，LMWH的抗 凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于普通肝素。

依诺肝素钠(Enoxaparin Sodium)作为其中的一种低分子肝素，占有低分子 肝素60％以上的市场份额，是最为主要的低分子肝素。它通过对猪肠粘膜肝素 的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得。其中肝素苄基酯的制备中酯化程度的控制 是生产工艺的关键。

肝素苄基酯的酯化程度直接影响依诺肝素成品中1，6-脱水结构、分子量及其 分布、活性等关键指标的情况，其酯化率决定了后期降解的工艺参数，从而影 响和制约依诺肝素钠的生产收率和产品成本，但目前还没有任何一种对肝素苄 基酯的酯化率进行检测的方法面世，造成了酯化率控制的实施困难。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种依诺肝素钠生产 过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法。利用该方法可以简单、快速、准确地 监测肝素苄基酯的酯化率，对下一步的降工艺解提供数据支持，从而实现控制 依诺肝素钠成品的1，6脱水结构、分子量及其分布、活性等关键指标的目的。

本发明的技术任务是按以下方式实现的：依诺肝素钠生产过程中肝素苄基 酯的酯化率的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)测试液配制

检测液：称取一定量的肝素苄基酯样品，将样品置于碱性环境下使其发生 beta-消除反应以生成苯甲醇，反应一定时间后加入冰乙酸终止反应，并用超纯 水稀释定容，备用；

对照液：称取一定量的苯甲醇标准品，加入超纯水溶解，备用；

(2)样品检测

利用辛基硅胶柱，采用带紫外检测器的高效液相色谱仪对步骤(1)所述检 测液和对照液做进样检测，并通过如下公式计算得到酯化率X：

$X=\frac{\mathrm{As}/C_S}{A_R/C_R\times (1-E\%)}\times 100\%$

A_S：检测溶液色谱图中苯甲醇峰峰面积；

A_R：对照溶液色谱图中苯甲醇峰峰面积；

C_S：检测溶液肝素苄基酯的浓度(mg/ml)；

C_R：对照溶液苯甲醇的浓度(mg/ml)；

E％：肝素苄基酯的干燥失重。

步骤(1)中检测液的配制过程优选为：称取0.5～1.0g肝素苄基酯样品于 反应容器中，加入10ml的5mol/L的氢氧化钠溶液溶解，水浴控温60～70℃， 反应120分钟，加入10ml冰乙酸终止反应，用超纯化水稀释定容至100ml，摇 匀，备用。

步骤(2)中高效液相色谱仪所用流动相优选为甲醇、乙腈的混合水溶液， 甲醇、乙腈、超纯水的体积比为10∶20∶70。

步骤(2)中高效液相色谱仪的紫外检测波长为256nm，流速为1.0± 01ml/min。

步骤(2)中辛基硅胶柱的内径为4.6mm，长为150mm，每米检测柱的理论 塔板数不低于20000。

所述肝素苄基酯的干燥失重(E％)可利用卤素快速水分测定仪测定。

肝素苄基酯的苄基在碱性条件下脱落生成苯甲醇，本发明的检测方法用紫 外检测器对苯甲醇进行定量检测，并以此反映肝素苄基酯的酯化率，与现有技 术相比具有以下突出的有益效果：

(1)提出了一种明确的肝素苄基酯酯化率的检测方法，克服了依诺肝 素钠生产过程中肝素苄基酯酯化率难以控制的难题，能够有效的 监测肝素苄基酯的酯化率，控制依诺肝素钠成品的关键性指标的 药典符合性，大大降低依诺肝素钠成品的不合格风险和企业生产 成本；

(2)整个检测方法简单、快速、准确率高，便于工业化推广应用。

附图说明

附图1是实施例一中对照液色谱图；

附图2是实施例一中检测液色谱图；

附图3是实施例二中对照液色谱图；

附图4是实施例二中检测液色谱图。

具体实施方式

以具体实施例对本发明的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检 测方法作以下详细地说明。

实施例一：

1、仪器与器具：

液相色谱仪(VWD检测器)、电子天平(十万分之一)、容量瓶(10mL，25mL， 100mL)、微量移液器(1000μl)

2、试剂与试药：

甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、超纯水、苯甲醇标准品、冰乙酸(分析纯)、 氢氧化钠(分析纯)

3、溶液制备：

3.1对照溶液：精密称取0.5g苯甲醇标准品于1000ml容量瓶中，用超纯水溶 解并稀释至刻度，即得。

3.2检测液的配制：精密称取0.5g肝素苄基酯样品(ZKE120709)于100ml容 量瓶中，加入10ml的5mol/L的氢氧化钠溶液溶解，水浴控 温60～70℃，反应120分钟，加入10ml冰乙酸终止反应，用 超纯化水稀释定容，摇匀，作为检测溶液。

4、检测条件：

4.1仪器：液相色谱仪；检测器：VWD(Variable Wavelength Detector)。

4.2色谱柱：Water-SymmtryShieldTMRP8分析柱和保护柱。长150mm，内径为 4.6mm的不锈钢柱，以色谱专用的辛基硅凝胶为固定相。以长20mm，内径 为3.9mm的柱子为保护柱，用相同的固定相填装。

4.3流动相：甲醇∶乙腈∶水＝10∶20∶70；

4.4检测波长：256nm；

4.5柱温：35℃；

4.6流速：1.0mL/min；

4.7运行时间：30min；

4.8进样体积：25μl。

5、数据处理：

称取待测样品(ZKE120709)约3.0g，按卤素快速水分测定仪操作规定测 定待测样品的干燥失重，E％＝1.2％。

由谱图可知：

A_S＝10.7

C_S＝5.1mg/ml

A_R＝22.2

C_R＝0.5mg/ml

酯化率(m/m)$X=\frac{\mathrm{As}\times C_R}{A_R\times C_S\times (1-E\%)}\times 100\%=\frac{10.7\times 0.5}{22.2\times 5.1\times (1-1.2\%)}\times 100\%=4.8\%$

对照液谱图如附图1所示，检测液谱图如附图2所示。

实施例二：

以实施例一所述方法对肝素苄基酯样品ZKE120715进行检测。

E％＝1.8％。

由谱图可知：

A_S＝10.6

C_S＝4.8mg/ml

A_R＝22.2

C_R＝0.5mg/ml

酯化率(m/m)$X=\frac{\mathrm{As}\times C_R}{A_R\times C_S\times (1-E\%)}\times 100\%=\frac{10.6\times 0.5}{22.2\times 4.8\times (1-1.8\%)}\times 100\%=5.1\%$

对照液谱图如附图3所示，检测液谱图如附图4所示。