导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法

摘要

本发明属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。导致西瓜两性花发育的基因a，具有序列表中的SEQ ID NO:1～6的核苷酸碱基序列，该获取方法包括以下步骤：A、供试材料选取，B、基因组DNA的提取，C、长距离PCR扩增反应与产物的检测，D、特异性扩增序列的获得，E、候选SNP的获得，F、对所述的候选SNP位点进行验证，最终获得所述的导致西瓜两性花发育的基因a序列。本发明通过F

说明书

技术领域

本发明属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及导致西瓜两性花发育的 基因a序列及其获得方法。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)为葫芦科黄瓜属一年生蔓生草本植物，是一种国内外 广泛栽培的重要经济作物。我国自汉代以来就有种植西瓜的历史，是世界上最 早栽培西瓜的国家之一，也是目前世界上西瓜栽培面积最大、产量最高的国家。

西瓜是植物性别分化机理研究的模式作物，研究西瓜性别机制有助于植物 性别分化研究发展，并能提高育种效率、降低育种成本。西瓜植株的主要性型 有雌雄异花同株（A-Gy-）、雄花完全花同株（雄完株，aaGy-）、雌性系(A-gygy) 和完全花系（aagygy）三种，由两个主效基因控制，分别为a基因和gy基因。 其中a基因主要控制雌花中雄蕊的发育，gy基因主要控制雄花中雌蕊的发育。 在这两个基因的共同作用决定了西瓜植株的性别发育模式。a基因在西瓜性别发 育模式中具体相当重要的作用，它直接控制着雄蕊原基是否发育，对雌雄同株 植物的性别发育模式研究至关重要。且培育雌性系品种必须保证每个节位均长 出纯雌花。纯雌性系品种对于降低育种人工成本、提高种子纯度有极其重要的 意义，具有很强的实用价值。故对于a基因的研究具有相当大的参考意义。

比较基因组学是现代分子生物学研究的一个重要手段，通过对同源生物的 同源基因进行全基因组比对，可迅速获得候选基因。在对候选基因序列分析的 基础上即可获得目标性状的差异位点并设计特异性分子标记。通过遗传分离群 体验证及表型分析，即可迅速锚定目标基因，大大缩短了分子标记开发进程。 因此，本项研究拟利用比较基因组学方法，利用已发表的甜瓜a基因在西瓜深 度序列上进行全基因组搜索，结合遗传分离群体检测及自然群体分析结果确定 导致西瓜两性花发育的基因a基因序列。

但是，利用比较基因组学原理进行同源克隆的准确率一般只在50%左右。 虽是获取目标基因的一种重要手段，却不能作为唯一的衡量标准。在西瓜育种 的科研和实践中需要，利用同源克隆技术获取多个目标基因并对进行逐一验证， 以便最终确定候选基因开展下一步工作。

发明内容

本发明的目的是提供导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

导致西瓜两性花发育的基因a，具有序列表中的SEQ ID NO:1～6的核苷酸 碱基序列。

导致西瓜两性花发育的基因a，具有翻译为序列表中的SEQ ID NO:7～8的 氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。

本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：

导致西瓜两性花发育的基因a序列的获得方法，包括以下步骤：

A、供试材料选取：

选取供试体材料；

B、基因组DNA的提取：

将所述的供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA；

C、长距离PCR扩增反应与产物的检测：

以所述的供试材料基因组DNA为模板，进行长距离PCR扩增反应，得到 长距离扩增产物；

D、特异性扩增序列的获得：

将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与质粒载体进行连接反应，得到 重组质粒；再将所述的重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测序， 得到特异性扩增序列；

E、候选SNP的获得：

将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列进行分析比对并结合内含子剪切预 测结果，得到候选SNP位点；

F、对所述的候选SNP位点进行验证，获得所述的导致西瓜两性花发育的基 因a序列。

本发明的有益效果为：

本发明应用比较基因组学原理，在西瓜深度序列上比对甜瓜CmACS-7基因 序列，通过全基因组搜索获得候选基因，并利用长距离PCR技术扩增出候选基 因片段并克隆、测序，通过分析其DNA序列和蛋白质序列确定目的基因；大大 缩短了定位基因的时间；

本发明通过F₂代分离群体dCAPs分子标记检测及表型鉴定、各核心种质资 源dCAPs分子标记检测及表型鉴定确认该SNP位点为共分离标记；获得的SNP 位点，能够开发基因标记用于辅助育种，达到获得西瓜雌性系品种的目的。

附图说明

图1为实施例1的亲本及重测序材料a基因DNA序列比对结果图；

图2为实施例1的亲本及重测序材料a基因蛋白质序列比对结果图；

图3为实施例1的对亲本进行长距离PCR扩增的电泳结果图；

图4为实施例1的引物a_FspBI对亲本及西瓜22个重测序材料的扩增并利 用FspBI限制性酶切后的结果图；

图5为引物a_FspBI对F₂群体的扩增并利用FspBI限制性酶切后的结果图。

具体实施方式

实施例1：

本实施例为导致西瓜两性花发育的基因a序列及其获得方法。

导致西瓜两性花发育的基因a，具有序列表中的SEQ ID NO:1～6的核苷酸 碱基序列。

导致西瓜两性花发育的基因a，具有翻译为序列表中的SEQ ID NO:7～8的 氨基酸残基序列的核苷酸碱基序列。

序列表中SEQ ID NO:1为雄花完全花同株材料长距离PCR特异性扩增的序 列；

序列表中SEQ ID NO:2为雌雄异花同株材料长距离PCR特异性扩增的序 列；

序列表中SEQ ID NO:3为雄花完全花同株材料CDS区的序列；

序列表中SEQ ID NO:4为雌雄异花同株材料CDS区的序列；

序列表中SEQ ID NO:5为雄花完全花同株材料dCAPs引物特异性扩增的序 列；

序列表中SEQ ID NO:6为雌雄异花同株材料dCAPs引物特异性扩增的序 列。

序列表中SEQ ID NO:7为雄花完全花同株材料蛋白质氨基酸残基序列；

序列表中SEQ ID NO:8为雌雄异花同株材料蛋白质氨基酸残基序列。

该获取方法包括以下步骤：

A、供试材料选取：

所述的供试体材料包括：父本阿柯克孜外，为典型雌雄完全花同株材料； 母本新红宝，为典型的雄花完全同株性型材料；以二者为亲本进行杂交获取的 F₁代；该F₁代自交获得F₂代；22个西瓜基因组重测序材料（详见表1）；519 份西瓜种质资源构成的自然群体（详见表2）；

B、基因组DNA的提取：

将所述的供试材料分别进行DNA提取处理，得到供试材料基因组DNA；

所述的DNA提取处理为参照Murry等（1980）的方法（Murray M,Thompson  W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8: 668-673.）的基础上改进而成；具体步骤如下：

a.取1.5克叶片，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml2%CTAB提取液（2% CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1%PVP-40， 0.2%β-巯基乙醇），混匀，于65℃水浴1小时，得到混合物A；

b.将所述的混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀， 冰浴20分钟；再加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提两次，得到上清液A；

c.向所述的上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液 （76%乙醇，10mM乙酸铵）洗涤一次，吹干，再加TE缓冲液（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH7.4）溶解，得到溶液A；

d.向所述的溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/ml，再混匀37℃ 水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提一次，得到上清液B；

e.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇， 得到DNA沉淀；

f.用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀，吹干，加适量ddH₂O溶解DNA，得 到供试材料基因组DNA；

再用紫外分光光度计（Shimadzu UV-1201，日本）以OD₂₆₀值测定所述的供 试材料基因组DNA的浓度，再用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测供试材料基因组DNA 的提取质量；

C、长距离PCR扩增反应与产物的检测：

以所述的供试材料基因组DNA为模板，进行长距离PCR扩增反应，得到 长距离扩增产物；

所述的长距离PCR扩增反应选用的引物由上海生工公司北京合成部合成， 序列如下：

上游引物序列：5’-CCAATTTCTATCAAATATGGGCAATG-3’

下游引物序列：5’-TCTCTGGATCTTAAAACCCGATT-3’；

所述的长距离PCR扩增反应的反应体系（25μL）中含有：

2.5μL含15mM MgCl₂的10×long PCR Buffer；2.5μL浓度为2.5mM的 dNTPs；0.4U long PCR Taq DNA聚合酶；1μL10mM上游引物，1μL10mM下 游引物，；50ng模板DNA；ddH₂O补足到25μL；其中，Taq DNA聚合酶及反 应缓冲液购自Fermantas公司，dNTPs购自TaKaRa公司；

反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，68℃ 2min，共10个循环；阶段3：94℃30s，55℃30s，68℃2min，第一个循环 的时间为2分钟，从第二个循环开始，时间在前一个循环的基础上增加5秒， 共25个循环；阶段4：68℃延伸10min；阶段5:4℃保存；其中，PCR仪为购自 Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler；

取上述长距离扩增产物5μL与载样缓冲液（6×Loading Buffer，北京全式金 生物技术有限公司）1μL混匀，再加入1.2%的琼脂糖凝胶中，180V/90A进样， 90V/100A电泳；其中，琼脂糖为：Agarose RA（购自amresco公司）；缓冲液为： 1×TAE缓冲液；电泳仪为购自JINGYI公司的JY600电泳仪；扩增结果如图3 所示；

D、特异性扩增序列的获得：

将所述的长距离扩增产物进行纯化处理后与pEASY-T1载体进行连接反应， 得到重组质粒；再将所述的重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测 序，得到特异性扩增序列；该特异性扩增序列的核苷酸碱基含有序列表SEQ ID  NO:1或SEQ ID NO:2；

步骤如下：

a.纯化处理：用刀片将电泳后上述琼脂糖上的目的条带切下,分别放入标记 好的2ml离心管中，用购自北京全式金生物技术有限公司的切胶回收纯化试剂 盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit对产物进行回收纯化，操作方法详见产品说 明书；

b.将所述的纯化后的长距离扩增产物与pEASY-T1载体连接反应，得到重 组质粒；该连接反应采用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T1Cloning Kit 试剂盒；

c.将所述的重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测序，得到特异 性扩增序列；

具体操作如下：

将所述的重组质粒转入购自北京全式金生物技术有限公司的Trans-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受态细胞中，再在SOC液体培养基 中，37℃、200rpm/m的条件下培育1小时后，将菌液均匀涂抹于预先涂抹了IPTG （8μL,500mM）、X-gal（40μL,20mg/ml）的LB/Amp⁺（100mg/ml）固体培养基 中，在37℃条件下培养过夜；之后用10μL枪头挑取呈白色的单菌落加入1ml LB/Amp⁺液体培养基中，在37℃、200rpm/m下培育8小时后，取1μL利用通用 引物M13进行菌液PCR检测，若为阳性克隆则将对应菌液送北京诺赛基因组研 究中心有限公司测序；其中菌液PCR所用的M13引物由上海生工公司北京合成 部合成，DNA聚合酶为Trans easy Taq DNA Polymerase；

E、候选SNP的获得：将所述的特异性扩增序列的核苷酸碱基序列进行分析 比对并结合内含子剪切预测结果，得到候选SNP位点；

如图1所示，将所述的特异性扩增序列的核苷酸序列利用DNA MAN软件 对测序所得DNA序列全长比对，获得共分离标记；图1为22个重测序材料与 亲本阿柯克孜外、新红宝母本a基因DNA序列比对图，由图1可知在a基因 CDS区里共有五个候选SNP，其中只有两个候选SNP处于ORF区（该ORF区 的核苷酸碱基序列含有序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4），只有一个SNP 位点（即G1477C）是aa基因型特有的SNP。

如图2所示，对基因全长序列进行分析，获得基因的CDS序列，进一步分析获 得一个位于CDS序列上的SNP位点；图2为a基因编码蛋白质序列（该蛋白质 序列的氨基酸残基含有序列表SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8）比对图，C364W 为序列唯一差异位点，该位点由图1中的G1477C造成的。

再结合蛋白质结构预测结果，确定该SNP位点（C364W）为候选SNP；

以上步骤A-E中，在西瓜全基因组深度序列上比对甜瓜CmACS-7基因序列， 获取候选基因。通过linux系统上已构建西瓜全基因组数据库，对比甜瓜 CmACS-7基因序列，针对各比对结果进行分析，最终获得可能性最大的基因序 列，进行下一步试验验证。上述西瓜全基因组数据库的网站为 http://www.iwgi.org；

F、对所述的候选SNP位点进行验证，获得所述的导致西瓜两性花发育的基 因a序列；

本步骤提取验证材料基因组DNA，所述的验证是利用dCAPs技术，针对 该候选SNP位点设计dCAPs标记特异性引物a_dCAPs，在所述的验证材料材料 上进行验证，得到扩增序列，以确定该段DNA序列（该扩增序列的核苷酸碱基 含有序列表SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6），为影响西瓜两性花发育的基因a 的DNA序列；

所述的验证材料包括：父本阿柯克孜外，为典型雌雄完全花同株材料；母 本新红宝，为典型的雄花完全同株性型材料；以二者为亲本进行杂交获取的F₁代；该F₁代自交获得的F₂代；22个西瓜基因组重测序材料（详见表1）；519 份西瓜种质资源构成的自然群体（详见表2）；

以上F₂代分离群体及BC群体于2010年秋在海南培育、采种，于2011年8 月在大棚中催芽直播，其中：父本、母本、F₁各取20粒种子播种，F₂群体取300 粒种子播种，定植于北京市农林科学院蔬菜技术研究中心四季青试验基地，其 中父本、母本、F₁各定植15株，F₂定植278株。

步骤如下：

a.以所述的验证材料基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR 扩增产物；

所述的验证材料基因组DNA的提取方法参见步骤B；

该PCR扩增反应选用的dCAPs引物a_dCAPs由上海生工公司北京合成部 合成，序列如下：

上游引物序列：5’-CAATAACGGGCTTAAATTCATCCG-3’，

下游引物序列：5’-CATGTTGTCGAACCGGAAGTTTAC-3’；

所述的PCR扩增反应的反应体系（20μL）中含有：

10×TransStart buffer2.0μL，0.8μL2.5mM dNTPs，0.75U TransStart Taq DNA  Polymerase，2μL dCAPs引物mix，50ng模板DNA，ddH₂O补足到20μL；Trans  Start Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，dNTPs购自 TaKaRa公司；

反应程序为：阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，72℃ 30s，共35个循环；阶段3：72℃延伸8min；阶段4：4℃保存；

b.将该PCR扩增产物进行酶切反应，得到酶切产物；

所述的酶切反应的反应体系（15μL）中含有：

1μL10×Buffer Tango^TM，0.5μL FspBI DNA内切酶（购自Fermantas公司）， 5μLPCR扩增产物；

所述的酶切反应程序为：37℃酶切反应12~16小时，然后68℃变性20分钟， 于4℃保存。所述的酶切反应结果如图4、图5所示。图为4基因标记a_dCAPs 扩增阿柯克孜外（P₁）XHBF（P₂）F₁（P₁×P₂）与22个重测学材料的电泳图 （GS1-GS22）；图5为为基因标记a_dCAPs检测阿柯克孜外（P₁）XHBF（P₂） 所得F1（P₁×P₂）自交后获得的F₂代群体单株基因型的电泳图。

本实施例中的验证结果与分析如下：

1、a基因DNA序列及蛋白序列分析

E步骤中，对雌雄异花同株性型亲本材料XHBF、雄花完全花同株性型材料 阿柯克孜外及22个西瓜重测序材料进行a基因扩增、克隆及测序后，测序结果 显示有一个重要SNP位点，它是一个存在于a基因CDS区的AA G→C aa突变， 其转化为蛋白质序列后的变异为C364W。

通过比对甜瓜CmACS-7蛋白质序列后并结合蛋白质结构分析结果，发现该 位点使西瓜a基因所编码的ACS合成酶蛋白第364个氨基酸残基由半胱氨酸转 变色氨酸。其中，半胱氨酸是含巯基的极性氨基酸，它在蛋白质内部形成二硫 键可能减弱蛋白质的结构稳定性，而色氨酸是一种芳香族非极性氨基酸，其苯 环结构的改变极有可能造成a基因编码蛋白质结构的变化。当ACS合成酶第364 个氨基酸残基由色氨酸变成半胱氨酸时，其空间结果极可能变化导致蛋白质稳 定性减低，致使酶失活。

ACS合成酶在植物乙烯合成路径中的主要作用是催化S-腺苷甲硫氨酸 （SAM）氧化成1-氨基环丙烷1-羧酸（ACC）在对a基因编码的ACS合成酶蛋 白进行结构分析后，发现其该位点变化之后，蛋白质的亲水性发生了较大的变 异。后对其三维结果进行预测发现，SNP位点所编码氨基酸残基位于酶结合PLP 的活性区域。而SAM氧化成ACC的生理过程依赖于PLP，故认为该SNP位点 （C364W）为导致西瓜两性花发育的基因a基因的SNP位点。

2、a基因研究F₂代群体遗传规律分析

F步骤中，对雌雄异花同株亲本新红宝、雄花完全花同株亲本阿柯克孜外、 F₁、F₂的278个单株进行花性型表型鉴定，其结果表明：新红宝为典型雌雄异花 同株性型，阿柯克孜外为典型雄花完全花同株性型，F₁为典型雌雄异花同株性 型，而F₂群体鉴定结果表明278个株系有205个雌雄异花同株单株和73株雄花 完全花同株单株，卡平方检验χ²=0.23<α²_0.05,1=3.84，符合3:1分离比例。

通过a基因dCAPs标记对F₂群体进行基因型分析，发现其AA基因型植株 为70株，Aa基因型植株为135株，aa基因型为73株，符合1:2:1分离比率。 结合表型鉴定结果分析，其表型与基因型的符合率为100%。

综合双亲、F₁、F₂的278个单株性型表型与基因型鉴定结果，表明影响西瓜 雌花上雄蕊发育的基因a基因为隐性单基因。

3、22个西瓜基因组重测序材料及519份自然群体a基因验证

F步骤中，利用西瓜a基因长距离PCR扩增特异性引物p60_4对西瓜基因 组22个重测序材料进行全长扩增并测序比对结果，发现其中有3个材料：Black Diamond、PI482271、PI500301具有a基因SNP位点。结合表型鉴定结果发现 这3个材料均为雄花完全花系材料。同时，对22个重测序材料进行a基因 a_dCAPs标记扩增，其结果与表型相符。

利用a基因dCAPs标记对本试验室519份种质资源构成的自然群体进行基 因型验证，并结合表型分析结果显示：在自然群体中，共有204个材料为异花 同株材料、315个材料为雄完株材料，其表型与基因型的符合比率为100%。

综上所述，dCAPs标记a_FspBI为导致西瓜两性花发育的基因a基因的基 因标记，其所在基因全长序列为的DNA序列导致西瓜两性花发育的基因a基因 全长序列。

附表：

表1：步骤A和步骤F中，西瓜22个基因组重测序材料：

材料编号 材料名称 性别表型 GS1 97103 雌雄异花同株 GS2 RZ-900 雌雄异花同株 GS3 RZ-901 雌雄异花同株 GS4 Sugarlee 雌雄异花同株 GS5 JX-2 雌雄异花同株 GS6 JLM 雌雄异花同株 GS7 JXF 雌雄异花同株 GS8 XHBFGM 雌性系 GS9 Calhoum Gray 雌雄异花同株 GS10 Black Diamond 雄完株 GS11 PIa96341-FR 雌雄异花同株 GS12 PI595203 雌雄异花同株 GS13 PI386019 雌雄异花同株 GS14 PI482271 雄完株 GS15 PI482303 雌雄异花同株 GS16 PI482276 雌雄异花同株 GS17 PI904304 雌雄异花同株 GS18 PI249010 雌雄异花同株 GS19 PI248178 雌雄异花同株 GS20 PI189317 雌雄异花同株 GS21 PI500301 雄完株 GS22 PI482326 雌雄异花同株

表2：步骤A和步骤F中，部分种质资源材料

材料编号 材料名称 性别表型 E1 周绿网 雌雄异花同株 E2 京欣6母本 雌雄异花同株 E3 新102 雌雄异花同株 E4 京丽母本 雌雄异花同株 E5 印度母本-1 雌雄异花同株 E6 印度大籽父本 雄完株 E7 PI500307-① 雄完株 E8 303 雌雄异花同株 E9 ENGA 雄完株 E10 旧102杂瓜 雌雄异花同株

E11 198 雌雄异花同株 E12 PM2 雌雄异花同株 E13 花皮克仑生 雌雄异花同株

注：上述父本、母本、西瓜基因组重测序材料及自然群体材料均为北京市农 林科学院蔬菜研究中心西瓜种质资源库保存的种质资源材料。