用于提高植物中非生物胁迫耐受性的核酸构建体

摘要

提供了包括可操作地连接至胁迫相关启动子上的编码磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）的多核苷酸的核酸构建体。还提供了用所述核酸构建体转化的宿主细胞、在胁迫相关启动子的转录调控下表达IPT编码序列的转基因植物以及使用其来提高植物在胁迫状态或正常状态下的非生物胁迫耐受性和植物的生物量的方法。

说明书

技术领域和背景技术

本发明在其一些实施方式中，涉及在胁迫相关启动子（stress-relatedpromoter）下编码磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）（adenosinephosphate-isopentenyltransferase）的核酸构建体，尤其但不唯一地涉及使用该核酸构建体来产生在正常或胁迫状态下具有提高的非生物胁迫耐受性和提高的产量、生物量和生长率（生长速率）的转基因植物的方法。

非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，对于主要作物植物降低超过50%的平均产量，每年引起价值数百万美元的损失。非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长和产率的形态学、生理学、生物化学和分子上的变化。

对骤冷（chilling）响应的表型症状包括诱导型损伤，如叶片扩展、萎蔫、萎黄、和坏死。骤冷也严重地阻碍植物的生殖发育，而且当骤冷时，植物可能遭受代谢功能障碍。

冷冻状态引起严重的膜损伤，而且响应冷冻胁迫而产生的活性氧簇（ROS）进一步促进膜损伤。

热胁迫扰乱细胞的自动调节，并可以导致严重的生长发育迟缓，甚至死亡。

高盐度，尤其是钠离子（Na⁺），可以消散膜电势，对细胞代谢是有毒的，对一些植物的酶的机能具有有害作用。此外，高浓度的Na⁺引起渗透失衡、膜组织破坏、生长降低、抑制细胞分裂/扩展，可以导致光合作用和活性氧簇生产量的降低。

严酷的干旱条件破坏正常的膜的双层结构。除膜损伤之外，当脱水时，细胞溶质蛋白和细胞器蛋白会表现出降低的活性或甚至会经历完全的变性。干旱也可以引起细胞的代谢瓦解并减少营养生长，尤其是芽生长。

脱落酸（ABA）在休眠的种子和芽的萌发和保持中以及在植物对胁迫（例如，冷冻、盐胁迫和水胁迫（缺水））的响应中起到初级（主要，primary）调控的作用。此外，ABA通常作为拮抗物通过与生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯和油菜素甾醇类的相互作用，影响植物生长的许多其他方面。

几个胁迫诱导的基因的启动子的研究已经导致有关不同胁迫的基因的特异性调控序列的识别。已经报道在许多ABA应答基因中的保守序列充当ABA应答元件（ABAR），其可能结合至有关ABA调节基因活化所涉及的转录因子上。在这些基因的启动子中发现的第二序列元件是有关对脱水或盐的第一快速应答的脱水应答元件（DRE）。在转基因植物中DREcDNA的过表达显示出在正常的生长条件下活化许多胁迫耐受性基因的表达，并改善对干旱、盐负荷和冷冻的耐受性。

缺乏大量营养元素导致矮化生长、降低生物量产量以及加速老化叶片的枯萎。抑制植物生长和降低生物量产出可以归因于光合作用的降低。受到不足的硫（S）和钙（Ca）供给的植物在生长中表现出比氮（N）缺乏的植物更大的抑制，可能由于S和Ca适当的固定性质。烟草植株中磷（P）缺乏已经表现出通过限制生长过程而降低片需求（sink demand）。由于矿质营养素缺乏而对下沉需求的改变可能影响光合产物的分配和干物质分布，导致降低的茎/根比（shoot/root ratio）。

预测在21世纪期间，营养缺乏是限制农作物产量的单独的最重要的因素，尤其是在发展中国家。土壤酸度、碱度和盐度，人为活动，单种栽培农田以及风和水侵蚀过程是对于耕作土壤的主要的退化因素。在酸和盐影响的土壤中生长的农作物的不良产率主要是由于结合了元素的毒性以及缺乏或不能利用必需营养素。为了达到适当的营养供给并使这些土壤的产率最大化，加入肥料和改良剂（尤其是石灰）是必要的。然而，施加肥料的效率非常低，并且随着农作物物种和物种内的基因型/栽培品种，以及它们与环境的相互作用而改变。到2030年，世界对食物的总需求可能接近其当前水平的两倍，而对于为了达到该生产量水平的耕作的扩张存在有限的可用的新土地。因此，提高每单位土地的农作物产量的潜力是急需考虑的。必须充分探究植物中较高的营养物利用效率，来增加食物生产量以供给增长的人口，并且要在不因过度使用肥料而加速环境退化的情况下将其实现。

植物枯萎（senescence），尤其是对于单次结实性（大部分是每年）物种，对于植物生活史的所有阶段是相关受控的发育过程。然而，某些胁迫（如干旱和营养缺乏）和激素能促进或抑制枯萎。在叶片枯萎期间，营养素再循环至植物的其他部分，如嫩叶或贮藏组织。从而，由于叶片光合同化作用的退化，枯萎对产量有消极影响。

在调节枯萎的过程中，植物激素中主要参与者是作为枯萎延缓激素的细胞分裂素和作为促进激素的乙烯。细胞分裂素控制植物生长和发育的各种过程，如植物细胞的增殖（促进细胞分裂）和分化（例如，血管的发育、叶片扩展、叶绿素积累和黄化体向叶绿体的转化）；它们在顶端优势、营养信号的转导、茎根平衡的控制、农作物产率和枯萎（延迟叶片枯萎）中起作用。细胞分裂素存在于所有植物组织中，并且大量存在于根尖、苗端和未成熟种子中。若干研究已经表明细胞分裂素从根向上通过木质部的通量的减少是叶片枯萎的重要因素。细胞分裂素的表达水平显示出在新发育的组织中最高，而在成熟组织中减少，使枯萎开始。

磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）催化细胞分裂素的生物合成，发现拟南芥IPT（AtIPT）基因的过度表达导致指示细胞分裂素生产过剩的表现型，由于它们表现出发育的和形态学的变化（Miyawaki K.等2004，PlantJ.37:128-38）。

叶片枯萎程序伴随着基因表达的变化并由其驱动。在枯萎期间cDNA库的示差筛选表明绝大多数基因的表达是负调节的（down-regulated），然而其他基因[枯萎相关基因（SAG）]的表达是正调节（up-regulated）（Buchanan-Wollaston V.，1994.Plant Physiol.105:839–846；Davies KM和Grieson D.，1989.Planta,179:73-80；Lohman KN，等，1994.PhysiologiaPlantarum92:322–328；Hajouj T，等，2000.Plant Physiol.124:1305-1314;Gepstein,S.，等，2003.The plant journal36:629-642；Buchanan-WollastonV等，2003.Plant Biotechnology Journal1:3-22）。预测重要的SAG涉及用于营养素重复利用的大分子和酶类的大量退化。在叶片枯萎期间是正调节的一些基因在非生物和生物胁迫下也是正调节的（Binyamin L，等，2000.Planta,211:591–597；Buchanan-Wollaston V，1997.J.Exp.Bot.48:181–199；Gepstein等，2003(Supra)；Guo Y，等，2004.Plant,Cell andEnvironment27:521–549；Hanfrey C，等，1996.Plant Mol Biol.30:597–609;Quirino BF，等，1999.Plant Mol.Biol.40:267–278；Weaver LM，等，1997.Leaf senescence:gene expression and regulation.In:Setlow JK,ed.Genetic engineering,Vol19.New York:Plenum Press,215–234）。

在豆苗（bean leaves）（菜豆（Phaseolus vulgaris））中识别出枯萎相关受体激酶（SARK）基因作为早期的SAG。SARK表达的开始发生在叶片成熟的后期，但是在一些枯萎症状之前立即出现。

Gan S.和Amasino RM.，1995（Inhibition of leaf senescence byautoregulated production of cytokinin.Science270:1986-1988）开发了枯萎抑制系统，其中，通过用含有融合至IPT编码序列的高度调节枯萎特异性基因-12（SAG12）的启动子（P_SAG12-IPT）的嵌合构建体来转化植物，将细胞分裂素的产生特异性地靶向至枯萎过程。P_SAG12-IPT转基因植物在枯萎阶段之前正常生长，然而，当叶片枯萎在野生型植物中发展时，转基因植物在这个阶段没有显示出明显的枯萎的迹象。

PCT公开号WO2006/102559披露了用含有融合至IPT基因的SARK启动子的构建体转化的转基因烟草植株的产生。当在有限的水分状况下生长时，SARK-IPT转基因植物显示出显著的枯萎延迟和对于干旱状态增强的耐受性以及植物的生物质和种子产量的最小降低，通过增强的光合率和水利用效率表现出对干旱状态的极大的抗性，由细胞分裂素表达提供（Rivero RM，等，2007.PNAS104:19631-19636）。此外，这些植物中产生的细胞分裂素，导致与光合作用有关的生化过程的保护以及光呼吸的诱导，细胞分裂素可以促进在水胁迫期间光合作用的保护（Rivero RM，等，2009.Plant Physiol.150:1530-40)。

金属硫蛋白（MT）基因编码富半胱氨酸、低分子量蛋白家族，它们存在于包括细菌、真菌和所有真核植物和动物物种的各种有机体中，这些有机体通过它们的半胱氨酸（Cys）残基的硫醇基结合重金属。在一些植物中发现金属硫蛋白是由各种非生物胁迫（例如，干旱、低温）诱导的，包括金属胁迫[例如，镉（Cd）、铵、铜（Cu）或锌（Zn）]，随后用ABA（Clement.等，2008，Gene.426,15-22）或乙烯处理、营养缺乏，以及在枯萎期间（Gepstein等，2003，Supra）。此外，用MT基因转化的烟草植株对低温、干旱和盐胁迫表现出增强的耐受性。（Xue T.，2009，J.Exp.Bot.60:339-49）。

另外的背景技术包括Beinsberger SEI，等，1992[Effects of enhancedcytokinin levels in ipt transgenic tobacco.In:Kamínek M，Mok DWS，ZazímalováE，编辑。Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants.TheHague,The Netherlands:SPB Academic Publishing;pp.77–82]。

发明内容

根据本发明一些实施方式的一方面，提供一种核酸构建体，其包含编码可操作地连接至胁迫相关启动子的磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）的多核苷酸。

根据本发明一些实施方式的一方面，提供一种核酸构建体，其包含编码可操作地连接至金属硫蛋白（MT）的启动子的磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）的多核苷酸。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供用本发明的一些实施方式的核酸构建体转化的宿主细胞。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供包含本发明的一些实施方式的核酸构建体或本发明的一些实施方式的宿主细胞的转基因植物。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供生产转基因植物的方法，包括在植物内表达本发明的一些实施方式的核酸构建体。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供提高植物的非生物胁迫耐受性（ABST）的方法，包括在植物内表达本发明的一些实施方式的核酸构建体，从而提高植物的非生物胁迫耐受性。

根据本发明的一些实施方式，胁迫相关启动子包括由选自由SEQ IDNO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19组成的组中的核酸序列所组成的顺式调控元件的至少一个拷贝。

根据本发明的一些实施方式，胁迫相关启动子是非生物胁迫相关启动子。

根据本发明的一些实施方式，胁迫相关启动子是ABA相关基因的启动子。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫相关启动子选自由SEQ IDNO:20-266、267、268、269、270、237、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、70、71、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、188、343、344、345、346、347、348、215、349、350、351、352、353、354、120、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、218、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、314、405、77、78、301、82、83、406、407、90、408、93、95、96、97、409、322、323、410、411、412、413、100、414、415、416、417、418、118、120、419、420、126、421、135、422、423、424、425、426、427、144、147、148、428、429、171、185、188、430、431、369、432、433、434、435、436、202、203、205、437、438、207、439、440、215、441、442、218、380、221、443、444、287、227、228、445、237、446、249、447、448、449、450、451、452、453、258、261、55、454、56、58、59、60、61、62、63、65、68、69、405、70、73、74、75、77、455、78、456、457、458、459、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、95、96、97、98、99、322、410、460、461、462、463、413、102、103、104、110、112、117、118、120、121、122、125、131、133、134、135、140、142、143、144、147、464、148、149、465、150、466、151、467、155、156、160、161、163、166、168、428、170、172、175、178、179、181、184、186、189、191、200、201、202、203、468、469、205、437、206、470、208、30、209、211、471、212、213、214、215、441、218、380、219、472、220、473、474、475、476、443、223、477、224、478、225、227、228、229、479、230、231、232、233、480、234、237、238、239、240、244、245、246、481、248、249、448、482、483、449、450、250、253、254、255、451、452、484、485、257、258、259、260、486、261、263、264、487、265、266、584、585、586、587、588、589、395、590、233、591、592、593、594、595、596、597、598、599、314、600、601、602、603、604、605、606、607、442、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、393、620、386、621、622、376、623、624、625、626、627、628、403、629、630、631、632、633、410、634、635、385、368、636、387、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、221、667、和668组成的组。

根据本发明的一些实施方式，ABA相关基因的启动子选自由SEQ IDNO:55、488、489、56、490、57、59、60、61、491、64、65、492、68、493、69、405、70、71、72、73、74、75、78、494、457、495、458、496、459、301、80、497、82、83、85、86、407、89、90、91、92、93、95、96、97、409、99、498、460、461、462、413、102、104、105、106、499、500、108、501、111、502、113、503、114、504、505、418、506、118、119、120、121、507、122、123、508、509、510、511、125、126、127、512、421、513、514、515、516、131、134、517、518、519、520、521、522、523、136、139、145、146、524、147、464、525、149、150、151、152、526、159、160、161、527、162、163、528、165、168、428、529、429、530、171、172、176、178、179、531、181、532、533、188、534、189、190、194、196、535、536、537、367、538、203、204、468、469、539、205、540、541、437、438、206、207、542、439、543、544、30、209、545、211、471、212、546、547、548、549、550、442、218、380、551、472、552、553、554、555、473、556、557、221、474、476、222、443、477、224、558、559、478、225、226、227、228、229、479、230、231、232、560、233、561、480、562、234、235、236、563、564、238、239、241、242、243、565、566、244、245、481、567、247、568、569、248、249、482、570、483、449、571、250、251、572、573、574、253、254、575、576、577、578、256、451、579、452、484、485、580、257、259、581、260、582、583、262、264、和265组成的组。

根据本发明的一些实施方式，胁迫相关启动子是金属硫蛋白（MT）启动子。

根据本发明的一些实施方式，金属硫蛋白（MT）启动子包含选自由SEQ ID NO:686-693组成的组中的核酸序列。

根据本发明的一些实施方式，金属硫蛋白（MT）启动子由SEQ ID NO:693示出。

根据本发明的一些实施方式，IPT包含选自由SEQ ID NO:673-378组成的组中的氨基酸序列。

根据本发明的一些实施方式，编码IPT的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:679-685组成的组中的核酸序列。

根据本发明的一些实施方式，细胞是植物细胞。

根据本发明的一些实施方式，植物细胞形成植物的一部分。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫选自由干旱、冷胁迫（coldstress）、骤冷胁迫（chilling stress）、热胁迫、盐胁迫（盐分胁迫）、渗透胁迫、冷冻胁迫、营养缺乏和重金属胁迫组成的组。

根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括在非生物胁迫下培育（grow）植物。

根据本发明的一些实施方式、本发明的一些实施方式的宿主细胞、本发明的一些实施方式的植物、或本发明的一些实施方式的方法，其中，IPT由SEQ ID NO:694示出。

根据本发明的一些实施方式，核酸构建体包含由SEQ ID NO:1示出的核酸序列。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域的任何普通技术人员通常理解的具有相同的意义。虽然类似于或相当于本文中描述的那些的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或试验，但是在下面描述了示例性的方法和/或材料。如果有矛盾，以专利说明书（包括定义）为准。另外，材料、方法、和实施例仅是示例性的，并不意在必要地限制。

附图说明

参考附图，在此仅通过实施例描述本发明的一些实施方式。现在详细地具体参考附图，重点是通过实施例显示细节，并且为了示例性的讨论本发明的实施方式的目的。在这点上，结合附图的描述使得如何实施本发明的实施方式对本领域技术人员而言是显而易见的。

在附图中：

图1是描述根据本发明的一些实施方式的核酸构建体的结构的示意图。包含35S启动子的质粒pJHA212K[Yoo,S.Y.，Bomblies,K.，Yoo,S.K.，Yang,J.W.，Choi,M.S.，Lee,J.S.，Weigel,D.，Ahn,J,H.(2005).“The35Spromoter used in a selectable marker gene of a plant transformation vectoraffects the expression of the transgene.”Planta221:523-530]用作模板，以产生本发明的一些实施方式的表达载体，其中，35S启动子被金属硫蛋白启动子替代。

图2描述根据本发明的一些实施方式的金属硫蛋白启动子-IPT-NOS终止子构建体（pM-IPT）的核酸序列（SEQ ID NO:1）。金属硫蛋白启动子（以蓝色字母显示）通过SEQ ID NO:1的核苷酸57-1208示出；IPT编码序列（以黑色字母显示）通过SEQ ID NO:1的核苷酸1233-2051示出；以及NOS终止子（以红色字母显示）通过SEQ ID NO:1的核苷酸2075-2328示出。

图3是描述在受限的水分状况下生长的表达金属硫蛋白-启动子-IPT编码序列构建体的转基因植物（M-IPT8植物）中的IPT表达（任意单位）的柱状图。植物在模拟的干旱条件下生长8-14周，每两天用100ml、200ml和400ml的水浇灌。8周（绿色柱）；10周（红色柱）；12周（黑色柱）；和14周（白色柱）。检查IPT表达并相对于18s表达进行量化。结果是两个独立校对（revision）的平均值。

图4A至图4C是描述在限制水的条件下，转基因（pM-IPT）在株高（图4A）、叶片数（图4B）和鲜重（图4C）上的作用的柱状图。植物（M-IPT7、M-IPT8、和野生型）在不同的干旱条件下生长，每两天用400ml（红色柱）、200ml（绿色柱）和100ml（黑色柱）的自来水浇灌。检查在这些条件下生长2个月的植物的生物量（鲜重）、高度和叶片数。相对于如在每行（对照或转基因）中测得的400ml浇灌处理的值以百分率给出这些值。

图5A-图5C是描述野生型（WT）和pM-IPT转基因植物在最佳的和有限的水分状况下生长的照片。四个月大的植物在不同的干旱条件下生长，每两天用400ml、200ml和100ml的水浇灌。在这个实验中，400ml水是植物生长的最佳水量。叶绿素含量的缺失暗示着枯萎，而且可以看到，该缺失在WT植物中远远超过在转基因植物中。此外，如通过植株高度和叶片尺寸（生物量的量度）所显示的，转基因植物表现出生长加速，高于同龄的WT植物（4个月大的植物）。

图6A-图6C是描述有限的水分状况对WT和pM-IPT转基因植物根生长的影响。在实验的最后，将在模拟的干旱条件下生长的，每两天用400ml、200ml和100ml的水浇灌的四个月大的植物的根上的土壤清除。400ml水是植物生长的最佳水量。

图7是描述在有限的水分状况中生长的植物的种子重量的柱状图，表示为相对于最佳水分状况（regime）的百分比。植物在模拟干旱条件下生长，每两天用400ml（红色柱）、200ml（绿色柱）和100ml（黑色柱）的水浇灌。将果实留下干燥，检测成熟种子的重量。值以相对于400ml浇灌处理的值的百分比给出；

图8A-图8D是描述在干旱条件下WT和pM-IPT转基因植物的生长的照片。对成熟烟草植株的浇灌停止两周，然后再浇灌。图8A-干旱之前的WT和pM-IPT植物；图8B-干旱两周之后的WT和pM-IPT植物；图8C-再浇灌之后一天的WT和pM-IPT植物。图8D-再浇灌之后三天的WT和M-IPT植物。

图9是描述在干旱条件下生长的WT和pM-IPT植物（M-IPT7和M-IPT8）的生物量的柱状图。对成熟烟草植株的浇灌停止两周后重新开始。比较两周无水生长的植物和在最佳供水下生长的植物的生物量（鲜重）。

图10A-图10D是描述M-IPT烟草植株在热胁迫之后的生长和恢复的照片。WT和M-IPT（M-IPT8和M-IPT7）植物在热胁迫下生长1周，然后转移回到室温下进行恢复。图10A-胁迫之前三周大的烟草植株；图10B-在37°C下热胁迫1周之后的烟草植株；图10C-恢复1周之后的烟草植株；图10D-从热胁迫中恢复2周之后的烟草植株。

图11A-图11D是描述M-IPT烟草植株在低温胁迫之后的生长和恢复的照片。WT和M-IPT（M-IPT8和M-IPT7）植物在冷胁迫下生长1周，然后转移回到室温下进行恢复。图11A-胁迫之前三周大的烟草植株；图11B-在4°C下冷胁迫1周之后的烟草植株；图11C-恢复2周之后的烟草植株。按从左至右的行（row）描述：从左侧的第一个两行-WT；中间的两行-M-IPT8；最后的两行-M-IPT7；图11D-从冷胁迫中恢复4周之后的烟草植株。注意M-IPT植物出乎意料地比WT植物大很多。

图12A-图12D是描述M-IPT烟草植株在盐胁迫之后的生长和恢复的照片。WT和M-IPT（M-IPT8和M-IPT7）植物在盐胁迫下生长3周，用300mM的NaCl浇灌，然后转变回正常浇灌进行恢复。图12A-胁迫之前三周大的烟草植株；图12B-在高盐度下3周之后的烟草植株；图12C-恢复1周之后的烟草植株；图12D-从盐胁迫中恢复2周之后的烟草植株。

图13A-图13C是描述M-IPT（M-IPT8和M-IPT7）烟草植株在渗透胁迫之后的生长和恢复的照片。WT和M-IPT植物在盐胁迫下生长3周，用20%的PEG6000浇灌，然后转移回正常浇灌进行恢复。图13A-胁迫之前三周大的烟草植株；图13B-渗透胁迫3周之后的烟草植株；图13C-恢复2周之后的烟草植株。

图14A-图14C是描述M-IPT（M-IPT8和M-IPT7）烟草植株在严重的非生物胁迫之后的恢复的照片。WT和M-IPT植物在冷胁迫下生长1周，在热胁迫下生长1周，在盐胁迫下生长3周（用300mM的NaCl浇灌）然后转移至室温并正常浇灌进行恢复。图14A-从冷胁迫中恢复4周时间之后的WT和M-IPT植物；图14B-从热胁迫中恢复4周之后的WT和M-IPT植物；图14C-从盐胁迫中恢复2周之后的WT和M-IPT植物。

图15是描述SAG12启动子-IPT构建体的示意图。

图16是描述在最佳的（400ml）和有限的（200ml或100ml）的水分状况下生长的WT和M-IPT植物的生物量（克）的柱状图。每两天用400ml、200ml和100ml的水浇灌在不同的干旱条件下生长植物（烟草）。两个月后，检查在这些条件下生长的每株植物中全部叶片的生物量（鲜重）。结果代表在每个处理中3株植物的平均值。

图17A-图17D是描述M-IPT烟草植株在盐胁迫下的生长的照片。野生型（WT）和M-IPT1转基因植物在包含1/2MSO培养基（具有或不具有150mM的NaCl，以分别用于盐胁迫或正常状态）的培养皿（Petri dishes）中生长3周。生长条件包括在25°C下，日长168（白天黑夜）。图17A-无盐胁迫的WT；图17B-有盐胁迫的WT；图17C-无盐胁迫的M-IPT1；图17D-有盐胁迫的M-IPT1。注意M-IPT构建体赋予植物对盐胁迫的提高的耐受性。

图18A-图18D是描述M-IPT烟草植株在盐胁迫下的生长的照片。野生型（WT）和M-IPT2转基因植物在包含1/2MSO培养基（具有或不具有150mM的NaCl，以分别用于盐胁迫或正常状态）的培养皿中生长3周。生长条件包括在25°C下，日长168（白天黑夜）。图18A-无盐胁迫的WT；图18B-有盐胁迫的WT；图18C-无盐胁迫的M-IPT2；图18D-有盐胁迫的M-IPT2。注意M-IPT构建体赋予植物对盐胁迫的提高的耐受性。

图19A-图19D是描述M-IPT烟草植株在盐胁迫下的生长的照片。野生型（WT）和M-IPT5转基因植物在包含1/2MSO培养基（具有或不具有150mM的NaCl，以分别用于盐胁迫或正常状态）的培养皿中生长3周。生长条件包括在25°C下，日长168（白天黑夜）。图19A-无盐胁迫的WT；图19B-有盐胁迫的WT；图19C-无盐胁迫的M-IPT5；图19D-有盐胁迫的M-IPT5。注意M-IPT构建体赋予植物对盐胁迫的提高的耐受性。

图20A-图20D是描述SARK-IPT烟草植株在盐胁迫下的生长的照片。野生型（WT）和SARK-IPT5转基因植物在包含1/2MSO培养基（具有或不具有150mM的NaCl，以分别用于盐胁迫或正常状态）的培养皿中生长3周。生长条件包括在25°C下，日长168（白天黑夜）。图20A-无盐胁迫的WT；图20B-有盐胁迫的WT；图20C-无盐胁迫的SARK-IPT；图20D-有盐胁迫的SARK-IPT。注意SARK-IPT构建体没有赋予植物对盐胁迫的抗性或提高的耐受性。

具体实施方式

本发明在其一些实施方式中，涉及在胁迫相关启动子下编码IPT的核酸构建体，更具体但不是唯一地，涉及使用该核酸构建体来产生在正常或胁迫状态下具有提高的非生物胁迫耐受性和提高的产量、生物量和生长率的转基因植物的方法。

在详细说明本发明的至少一个实施方式之前，应理解不是必需将其应用限制在以下说明中所给出的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够是其他实施方式，或能够以各种各样的方式实践或进行。

本发明人已经揭示了包含在胁迫相关启动子的转录调控下的磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）编码序列的核酸构建体，可以用于提高表达该核酸构建体的转基因植物对各种非生物胁迫的耐受性和抗性。

从而，如在随后的实施例部分中显示的，在胁迫相关启动子的调节下IPT编码序列的自动调控表达在有限的水分状况下比在最佳条件下更高（图3，实施例1）。此外，用本发明的一些实施方式的胁迫启动子-IPT核酸构建体转化的转基因植物对干旱胁迫表现出提高的耐受性，如通过以下各项所显示的：每株植物的叶片数目的减少显著降低（图4B，实施例1）；在50%水分状况下维持稳定的生物量（图4C，实施例1）；在干旱条件下在延长的时间内的高叶绿素水平和提高的生物量（图5A-图5C，实施例1）；在干旱条件下提高的根系尺寸和重量（图6A-图6C，实施例1）；在干旱胁迫下维持稳定的产量（图7，实施例1）；从长期的干旱胁迫下恢复良好（图8A-图8D和图9，实施例1）；从热胁迫（图10A-图10D，实施例2）、冷胁迫（图11A-图11D，实施例2）；盐胁迫（图12A-图12D，实施例2）；渗透胁迫（图13A-图13C，实施例2）和严重的非生物胁迫（图14A-图14C，实施例2）中快速恢复良好，在相同生长条件下与非转化野生型植物相比；以及对盐胁迫表现出提高的耐受性，如通过与在相同条件下野生型植物相比植物存活和叶片尺寸而证明的（图17-图19；实施例6）。总而言之，这些结果提出了包括在胁迫启动子转录调控下的IPT编码序列的核酸构建体的应用，用以在正常条件下，甚至是在野生型植物通常开始枯萎的延长的生长期之后来提高植物对各种非生物胁迫的耐受性并用以增加生物量和叶绿素含量。

从而，根据本发明一些实施方式的一方面，提供了包括可操作地连接至胁迫相关启动子的编码磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）的多核苷酸的核酸构建体。

如在本文中使用的短语“磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）”、“异戊烯基转移酶”（也被称为“tmr”）是指参与细胞分裂素生物合成的多肽。IPT是从包括植物和细菌的各种物质克隆而来，如根癌土壤杆菌[gi190014648，GenBank登记号YP_001967412.1（SEQ ID NO:673），GeneID:6382121]；NP_396529（SEQ ID NO:674，GeneID:1137335）；gi10955021，GenBank登记号NP_059677.1（SEQ ID NO:675），GeneID:1224196]，大豆[GeneID:547754，GenBank登记号AAT28191.1（SEQ ID NO:676），GeneID:547754]；玉米[GeneID:100174970；GenBank登记号NP_001127753；（SEQ ID NO:677）]，以及葡萄土壤杆菌（Agrobacteriumvitis）[GeneID:7365249，GenBank登记号YP_002540151(SEQ ID NO:678)]。因此，各种多核苷酸编码序列可以经由各种来源获得，如在HypertextTransfer Protocol://World Wide Web(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov上的美国国家生物技术信息中心（NCBI）。

IPT编码序列的非限制性实例包括，AY550884.1（SEQ ID NO:679）、NM_001134281.1（SEQ ID NO:680）、GenBank登记号NC_011982.1（仅为通过核苷酸位置的选定区的SEQ ID NO:681）的核苷酸221625-222335，GenBank登记号NC_010929.1（仅为通过核苷酸位置的选定区的SEQ IDNO:682）的核苷酸11107-12012，GenBank登记号NC_003065.3（仅为通过核苷酸位置的选定区的SEQ ID NO:683）的核苷酸19337-20059，GenBank登记号NC_002377.1（仅为通过核苷酸位置的选定区的SEQ IDNO:684）的核苷酸7664-8586，以及GenBank登记号NC_003065.2（AGR_pTi_50，也被称为Tmr，异戊烯基转移酶，GeneID1142635；SEQID NO:685）的核苷酸52740-53462。

应当注意的是，通过本发明的一些实施方式也设想了编码与选自由SEQ ID NO:673-678组成的组中的IPT多肽具有至少80%同一性（例如，通过总体同源性）的多肽的同源基因。

根据本发明的一些实施方式，IPT编码序列由SEQ ID NO:694给出，其包括SEQ ID NO:1的核苷酸1233-2051。

如在本文中使用的，“可操作地连接”是指相对于核酸序列（例如，编码IPT的多核苷酸）定位调控区（在这种情况下是胁迫相关启动子），以这样一种方式以便允许或便于核酸序列在宿主细胞中的转录。

如在本文中使用的，术语“启动子”是指RNA聚合酶结合其上以开始由基因编码的RNA转录的DNA区域。当在某处表达基因时（例如，在植物的部分/组织处）和/或当表达基因时（例如，在有机体的寿命中的阶段或状态下），启动子控制基因表达水平。

根据本发明的一些实施方式，启动子位于基因的转录起始位点的上游。

根据本发明的一些实施方式，启动子序列的第一核苷酸（即，5'末端）定位于可操作地连接其上的编码核酸序列的翻译起始位点（在大多数基因中，是ATG密码子）上游的1-500碱基对（bp）处，尽管也可以领会到当定位于相对于编码核酸序列的其他位置时（例如，在内含子内）调控序列也可以发挥其作用。

根据本发明的一些实施方式，将启动子序列的第一核苷酸（即，5'末端）定位于可操作地连接其上的编码核酸序列的翻译起始位点上游的约1-600bp、约1-700bp、约1-800bp、约1-900bp、约1-1000bp、约1-1100bp、1-1200bp、约1-1300bp、约1-1400bp、约1-1500bp、约1-1600bp、约1-1700bp、约1-1800bp、约1-1900bp、约1-2000bp、约1-2500bp、约1-3000bp或更多处。

如在本文中使用的短语“胁迫相关启动子”是指，与在正常（例如，非胁迫、最佳）状态下相比，在胁迫状态下其转录的启动活性上调的任何启动子。因此，在胁迫状态下可操作地连接至胁迫相关启动子的编码序列的表达水平比在非胁迫状态下更高。

在本文中使用的短语“胁迫”是指对植物的新陈代谢、生长、生物量、繁殖产量和/或生存能力的任何不良影响。因此，非生物胁迫可以通过不是最适宜的环境生长条件诱导，像是例如，盐度、缺水、洪水、冷冻、低温或高温、重金属毒性、乏氧生活、营养缺乏（还包括营养不易接近，如由于淋溶（leaching））、大气污染或UV照射。例如，生物胁迫是由在环境中发现的病原体引起的，如细菌、病毒、真菌、寄生物（parasite）、以及昆虫和杂草。

根据本发明的一些实施方式，非生物或生物胁迫引起植物的新陈代谢、生长、生物量、繁殖产量和/或生存能力的下降。

已知各种各样的启动子在胁迫下是上调的，即，在胁迫状态下能够提高可操作地连接至其上的编码序列的表达水平。这类启动子可以通过在启动子的转录调控下监测内源基因的表达谱（expression pattern）来识别。从而，如果在胁迫状态下的基因表达相对于在非胁迫状态下（例如，最佳状态）相同基因的表达而言是上调的，那么认为该启动子序列是胁迫相关启动子。这些启动子中的一些共有常见的调控序列（例如，出现于与编码序列相同的染色体的上游的顺式调控序列），这些调控序列充当用于辅助调控的编码序列转录的转录因子的结合位点。

以下是胁迫相关的顺式调控元件的非限制性清单，其包括在本发明的一些实施方式的核酸构建体的胁迫相关启动子中：ABRE（ABA应答元件）-PyACGTG(T/G)C（SEQ ID NO:2）如TACGTGTC（SEQ ID NO:3）、CACGTGGC（SEQ ID NO:4）、PyACGTGGC（SEQ ID NO:7）、ACGTGTC（SEQ ID NO:10）、ACGTGTC（SEQ ID NO:11）、ACGTGGC（SEQ IDNO:14）；DRE（脱水应答元件）–TACCGACAT（SEQ ID NO:5）；CCGAC核心基序（Core Motif）-CCGAC（SEQ ID NO:6）；CE1–TGCCACCGG（SEQ ID NO:8）；CE3–ACGCGTGCCTC（SEQ ID NO:9）；MYBR–TGGTTAG（SEQ ID NO:12）；MYCR–CACATG（SEQ ID NO:13）；CRT–GGCCGACAT（SEQ ID NO:15）；LTRE–GGCCGACGT（SEQ ID NO:16）；NACR–ACACGCATGT（SEQ ID NO:17）；ZFHDR；ICEr1–GGACACATGTCAGA（SEQ ID NO:18）；ICEr2–ACTCCG（SEQ IDNO:19）。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫启动子是在盐胁迫（盐度）下有活性的启动子。根据本发明的一些实施方式可以使用的盐胁迫相关启动子的非限制性实例包括由SEQ ID NO:20-266给出的启动子序列（表2，随后实施例部分的实施例5）。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫启动子是在冷胁迫下具有活性（例如，诱导或控制基因表达）的启动子。根据本发明的一些实施方式可以使用的冷胁迫相关启动子的非限制性实例包括通过以下各项给出的启动子序列：SEQ ID NO：267、268、269、270、237、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、70、71、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、188、343、344、345、346、347、348、215、349、350、351、352、353、354、120、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、218、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、314、405、77、78、301、82、83、406、407、90、408、93、95、96、97、409、322、323、410、411、412、413、100、414、415、416、417、418、118、120、419、420、126、421、135、422、423、424、425、426、427、144、147、148、428、429、171、185、188、430、431、369、432、433、434、435、436、202、203、205、437、438、207、439、440、215、441、442、218、380、221、443、444、287、227、228、445、237、446、249、447、448、449、450、451、452、453、258、和261。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫启动子是在干旱胁迫下具有活性的启动子。根据本发明的一些实施方式可以使用的干旱胁迫相关启动子的非限制性实例包括通过以下各项给出的启动子序列：SEQ ID NO：55、454、56、58、59、60、61、62、63、65、68、69、405、70、73、74、75、77、455、78、456、457、458、459、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、95、96、97、98、99、322、410、460、461、462、463、413、102、103、104、110、112、117、118、120、121、122、125、131、133、134、135、140、142、143、144、147、464、148、149、465、150、466、151、467、155、156、160、161、163、166、168、428、170、172、175、178、179、181、184、186、189、191、200、201、202、203、468、469、205、437、206、470、208、30、209、211、471、212、213、214、215、441、218、380、219、472、220、473、474、475、476、443、223、477、224、478、225、227、228、229、479、230、231、232、233、480、234、237、238、239、240、244、245、246、481、248、249、448、482、483、449、450、250、253、254、255、451、452、484、485、257、258、259、260、486、261、263、264、487、265、和266。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫启动子是在光胁迫下具有活性的启动子。

如在本文中使用的短语“光胁迫”或“光抑制”（它们可在本文中互换使用）是指引起抑制光合作用以及可选地抑制生物量产量和植物生长的光强度（light intensity）。

各植物品种的正常光条件可以是彼此不同的，而这种条件在本领域是熟知的。例如，对于烟草，正常的光强度是约250μmol m^-2s^-1。对于拟南芥，正常的光强度是约100μmol m^-2s^-1。在拟南芥中的光胁迫可以通过使植物暴露于1,000μmol m^-2s^-1的光强度下1小时而达到。

根据本发明的一些实施方式可以使用的光胁迫相关启动子的非限制性实例包括通过以下各项给出的启动子序列：SEQ ID NO：584、585、586、587、588、589、395、590、233、591、592、593、594、595、596、597、598、599、314、600、601、602、603、604、605、606、607、442、608、609、610、611、612、613、614、和615。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫启动子是在渗透胁迫下具有活性的启动子。根据本发明的一些实施方式可以使用的渗透胁迫相关启动子的非限制性实例包括通过以下各项给出的启动子序列：SEQ ID NO：616、617、618、619、393、620、386、621、622、376、623、624、625、626、627、628、403、629、630、631、632、633、410、634、635、385、368、636、387、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、221、667、和668。

根据本发明的一些实施方式，胁迫相关启动子是由ABA诱导的启动子（ABA诱导的启动子）。根据本发明的一些实施方式可以使用的ABA相关的启动子的非限制性实例包括通过以下各项给出的启动子序列：SEQID NO：55、488、489、56、490、57、59、60、61、491、64、65、492、68、493、69、405、70、71、72、73、74、75、78、494、457、495、458、496、459、301、80、497、82、83、85、86、407、89、90、91、92、93、95、96、97、409、99、498、460、461、462、413、102、104、105、106、499、500、108、501、111、502、113、503、114、504、505、418、506、118、119、120、121、507、122、123、508、509、510、511、125、126、127、512、421、513、514、515、516、131、134、517、518、519、520、521、522、523、136、139、145、146、524、147、464、525、149、150、151、152、526、159、160、161、527、162、163、528、165、168、428、529、429、530、171、172、176、178、179、531、181、532、533、188、534、189、190、194、196、535、536、537、367、538、203、204、468、469、539、205、540、541、437、438、206、207、542、439、543、544、30、209、545、211、471、212、546、547、548、549、550、442、218、380、551、472、552、553、554、555、473、556、557、221、474、476、222、443、477、224、558、559、478、225、226、227、228、229、479、230、231、232、560、233、561、480、562、234、235、236、563、564、238、239、241、242、243、565、566、244、245、481、567、247、568、569、248、249、482、570、483、449、571、250、251、572、573、574、253、254、575、576、577、578、256、451、579、452、484、485、580、257、259、581、260、582、583、262、264、和265。

根据本发明的一些实施方式，胁迫相关启动子不是枯萎相关的受体激酶（Senescence-Associated Receptor Kinase，SARK）启动子。

根据本发明的一些实施方式，核酸构建体包括可操作地连接至金属硫蛋白（MT）启动子的编码磷酸腺苷-异戊烯基转移酶（IPT）的多核苷酸。

如在本文中使用的术语“金属硫蛋白”是指编码富半胱氨酸的低分子量蛋白的基因的家族，其通过它们的半胱氨酸（Cys）残基的硫醇基结合重金属。金属硫蛋白存在于包括细菌、真菌以及所有真核植物和动物物种的各种有机体中。

在一些植物中，金属硫蛋白的表达水平是在各种非生物胁迫[例如，干旱、低温、营养缺乏、金属胁迫（例如，镉（Cd）、铵、铜（Cu）或锌（Zn）），随后用ABA（Clement.等，2008，Supra）或乙烯处理，在枯萎期间（Gepstein等，2003，Supra）诱导的。

可以用于本发明的一些实施方式的核酸构建体的金属硫蛋白启动子的非限制性实例包括下列启动子序列：类金属硫蛋白家族15蛋白AT2G23240的启动子，其包括SEQ ID NO:686（chr2:9896326-9899325反向（REVERSE））；拟南芥植物EC类金属硫蛋白家族15（MT2A,金属硫蛋白（METALLOTHIONEIN）2A）AT3G09390蛋白的启动子，其包括SEQ ID NO:68(chr3:2890189-2893188反向）；MT2B（METALLOTHIONEIN2B）AT5G02380的启动子，其包括SEQ ID NO:688（chr5:507165-510164反向）；金属硫蛋白AT2G42000植物EC类金属硫蛋白家族15蛋白[拟南芥]NC_003071.7（17529243..17529828，互补）的启动子，其包括SEQ ID NO:689（chr2:17529829-17532828反向）；LOC100283577类金属硫蛋白类型2[玉米]；（金属硫蛋白1A）铜离子结合/金属离子结合[拟南芥]NC_003070.9（2338904..2339321，互补）的启动子，其包括SEQ ID NO:690（AT1G07600，chr1:2339322-2342321反向）；MT3（金属硫蛋白3）铜离子结合[拟南芥]NC_003074.8（5180667..5181400，互补）的启动子，其包括SEQ ID NO:691（AT3G15353，chr3:5181326-5184325反向）；mtl2金属硫蛋白2玉米（GenBank登记号S57628）的启动子，其包括SEQ ID NO:692。

根据本发明的一些实施方式，金属硫蛋白启动子由SEQ ID NO:1的核苷酸57-1208给出。

根据本发明的一些实施方式，IPT由SEQ ID NO:693给出。

根据本发明的一些实施方式，对本发明的一些实施方式的胁迫相关启动子序列进行修饰以在分子序列中产生变异，从而增强它们的启动活性，使用现有技术中已知的方法，如基于PCR的DNA修饰、或标准DNA诱变技术、或通过化学合成修饰的多核苷酸。

因此，可以将本发明的一些实施方式的胁迫相关启动子序列截短或删除（缺失），并且仍保持在宿主细胞中引导可操作的连接的DNA序列的转录的能力。可以通过从本领域已知的标准技术分离的多核苷酸的5′末端和3′末端系统地除去序列来测定启动子区的最小长度，包括但不限于去除限制性酶片段或用核酸酶消化。

根据本发明的一些实施方式，本发明的核酸构建体包括任何上面所描述的启动子序列的功能部分。

如在本文中使用的短语“功能部分”是指能够在胁迫状态下上调（即，增加）异源序列的转录的最小核酸序列。

根据本发明的一些实施方式，功能部分包括至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个胁迫相关启动子序列的连续核苷酸（consecutive nucleotide）。

用于确定候选功能部分序列或截短的、删除的或变异的启动子序列在胁迫相关的方式下调控异源序列的转录能力的试验（即，在胁迫状态下上调异源序列的转录），在本领域是已知的。（参见，例如Yasunari Fujita，Miki Fujita，Rie Satoh，等2005.AREB1Is a Transcription Activator of NovelABRE-Dependent ABA Signaling That Enhances Drought Stress Tolerance inArabidopsis.The plant cell17:3470-3488；通过引用将其全部结合于此）。例如，可以将候选序列定位于核酸构建体中报告基因的上游，将该核酸构建体转化至植物中，并使植物在胁迫或非胁迫（例如，最佳）状态下生长。在各种状态下监控报告基因的表达水平并在转基因和非转基因植物之间，和/或用包括报告基因的候选功能部分上游的核酸构建体转化的转基因植物和用包括已知的报告基因的胁迫相关启动子上游的核酸构建体转化的转基因植物之间比较报告基因的表达水平。可以用于这类试验的已知的报告基因的实例包括但不限于，GUS、萤光素酶、和GFP（绿色荧光蛋白）。

在另一个方法中，可以通过许多方法设计或改造（engineer）新的杂合启动子。许多启动子包含活化、增强或定义启动子的强度和/或特异性的上游序列，例如像由Atchison[Ann.Rev.Cell Biol.4:127(1988)]所描述的。例如，包含定义转录起始位点和位于转录起始位点上游的其他上游元件的“TATA”框的T-DNA基因调控转录水平[Gelvin In:Transgenic Plants（Kung,S.-D.和Us,R.,eds,San Diego：Academic Press，pp.49-87，(1988)]。另一个嵌合启动子将章鱼碱合酶（octopine synthase）（ocs）激活剂（活化因子，activator）的三聚物结合至甘露碱合酶（mannopine synthase）（mas）激活剂加上启动子并报告在报告基因的表达中的增加。[Min Ni等，The PlantJournal7:661(1995)]。本发明的一些实施方式的胁迫相关启动子可以用于构建这类嵌合或杂合启动子。用于构建变体启动子的方法包括，但不限于，结合不同启动子的控制元件或复制启动子的部分或区域（参见例如，U.S.Pat.No.5,110,732和5,097,025）。本领域技术人员熟悉用于以下各项的特定条件和方法：大分子的构建、处理和分离（例如，DNA分子、质粒等），重组有机体的产生以及基因的筛选和分离，[参见例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,(1989)；Mailga等，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor Press,(1995)；Birren等，Genome Analysis:volume1,Analyzing DNA,(1997)；卷2，Detecting Genes,(1998)；卷3，Cloning Systems,(1999)；和卷4，MappingGenomes,(1999)，Cold Spring Harbor,N.Y]。

根据本发明的一些实施方式的核酸构建体，还包括位于IPT编码序列下游的转录终止子。这些终止子的非限制性实例包括NOS终止子、来自根癌土壤杆菌的nopalin-合酶-基因（nopalin-synthase-gene）的调控序列（例如，SEQ ID NO:1的核苷酸2075-2328）、和ocs3终止子（章鱼碱合酶终止子；SEQ ID NO：695）、mas3终止子甘露碱合成终止子（SEQ ID NO:696）。

根据本发明的一些实施方式，核酸构建体包含由SEQ ID NO:1给出的核酸序列。

本发明的一些实施方式的核酸构建体还可以包括合适的选择性标记和/或复制起始点。根据本发明的一些实施方式，所利用的核酸构建体是穿梭载体（shuttle vector），其可以在大肠杆菌（其中，构建体包括合适的选择性标记和复制起始点）中增殖并适合在细胞中增殖。根据本发明的构建体可以是，例如质粒、杆粒、噬粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。

本发明的一些实施方式的核酸构建体可以用于转化宿主细胞。可以与本发明的一些实施方式一起使用的宿主细胞的非限制性实例包括植物细胞、细菌细胞（例如，农杆菌（土壤杆菌，agrobacteria））、和动物细胞

根据本发明的一些实施方式，宿主细胞是植物细胞。

根据本发明的一些实施方式，植物细胞形成植物的一部分。

根据本发明的一些实施方式的一方面，提供生产转基因植物的方法，包括在植物内表达本发明的一些实施方式的核酸构建体。

如在本文中使用的短语“在植物内表达”是指通过将核酸构建体导入植物细胞或植物中并通过重组方式表达，上调包含在核酸构建体中的外源多核苷酸在植物内的表达水平，如在下文中进一步描述的。

如在本文中使用的“表达”是指在mRNA（水平）上的表达，以及可选地在多肽水平的表达。

短语“外源多核苷酸”是指不是天然地在植物内表达和/或期望其在植物中过表达的任何核酸序列。外源多核苷酸可以是以RNA序列形式的分离的单链或双链核酸序列、互补多核苷酸序列（cDNA）、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列（例如，上述的组合）。

外源多核苷酸可以包括与植物的内源核酸序列同一或部分同源的核酸序列。

如在本文中使用的术语“内源”是指在植物或其细胞内存在和/或天然表达的任何多核苷酸或多肽。

如在本文中使用的术语“分离”是指从自然环境，例如，从植物细胞中至少部分地分离。

如在本文中使用的短语“互补多核苷酸序列”是指使用反转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶由信使RNA的反转录得到的序列。这种序列随后可以使用DNA依赖性DNA聚合酶在体内或体外进行扩增。

如在本文中使用的短语“基因组多核苷酸序列”是指来自（分离自）染色体的序列，从而它代表染色体的邻近部分。

如在本文中使用的短语“复合多核苷酸序列”是指其是至少部分互补的并至少部分基因组的序列。复合序列可以包括一些编码本发明的多肽需要的外显子序列（exonal sequence），以及在它们之间插入的一些内含子序列（intronic sequence）。内含子序列可以是任何来源，包括其他基因，典型地将包括保守剪接信号序列。这类内含子序列还可以包括顺式作用表达调控元件。

可以将本发明的一些实施方式的核酸序列（例如，编码IPT的多核苷酸和/或胁迫相关启动子序列）最优化用于植物表达。这类序列修饰的实例包括，但不限于，改变G/C含量以更密切地接近在感兴趣的植物品种中典型地发现的G/C含量，在植物品种中非典型地发现的密码子的去除通常称为密码子优化。

短语“密码子优化”是指选择合适的DNA核苷酸用于在结构基因或其片段内应用，其接近在感兴趣的植物内的密码子的使用。因此，优化的基因或核酸序列是指这样的基因，其中已经将天然的或天然存在的基因的核苷酸序列修饰以便在植物内利用统计学优选的或统计学偏爱的密码子。典型地在DNA水平检查核苷酸序列，使用任何合适的程序在已确定的植物品种中优化编码区用于表达，例如Sardana等（1996，Plant Cell Reports15：677-681）所描述的。在该方法中，首先可以通过找到相对于高度表达的植物基因，天然基因的每个密码子使用的比例方差（squaredproportional deviation），随后计算平均方差来计算密码子使用的标准差（密码子使用偏性的量度）。所使用的公式是：1SDCU=n=1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn是指在高度表达的植物基因中的密码子n的利用率，其中Yn是指在感兴趣的基因中的密码子n的利用率，N是指在感兴趣的基因中的密码子的总数。来自双子叶植物的高表达基因的密码子使用的表是利用Murray等（1989，Nuc Acids Res.17:477-498）的数据编译的。

根据用于特定植物细胞类型的优选的密码子使用使核酸序列最优化的一种方法，在没有进行任何额外的统计计算的情况下是基于密码子最优化表（如通过NIAS（National Institute of Agrobiological Sciences）密码子使用数据库、日本的DNA库[Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web(dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/]在线提供的那些）的直接使用。密码子使用数据库包括用于许多不同物种的密码子使用表（codon usage table），其中每个密码子使用表已经基于存在于GenBank中的数据进行统计学测定。

通过利用上述表测定对于在特定物种（例如，稻谷）中的每种氨基酸的最优选或最偏爱的密码子，编码感兴趣的蛋白的天然存在的核苷酸序列对于那些特定植物品种可以是优化的密码子。这通过用相应的密码子（就氨基酸而言，那些是统计学更偏爱的）取代那些可能在特定物种基因组中具有低统计学发生率的密码子来实现。然而，可以选择一种或多种欠偏爱的密码子以删除现有限制性位点，从而在潜在的有用连接（5'和3'末端增加信号肽或终止盒，可能用于切断和剪接片段一起产生正确的全长序列的内部位点）上创建新位点，或者除去可能对mRNA稳定性或表达产生负面影响的核苷酸序列。

在任何修饰之前，天然存在的编码核苷酸序列可能已经包含符合在特定的植物品种中统计学偏爱的密码子的许多密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子最优化可能包括测定对于特定的植物而言在天然核苷酸序列内哪些密码子不是统计学偏爱的，以及根据特定的植物的密码子使用表修饰这些密码子以产生密码子优化的衍生物。如果通过修饰的核苷酸序列编码的蛋白以高于通过相应的天然存在的或天然的基因编码的蛋白的水平生产，那么对于植物密码子使用而言修饰的核苷酸序列可以是完全或部分优化的。例如，在PCT专利申请93/07278中描述了通过改变密码子使用来构建合成基因。

从而，根据本发明的一些实施方式包括上文描述的核酸序列；其片段、与其同源（homologous）的序列、与其直系同源（orthologous）的序列、编码具有不同密码子使用的类似多肽的序列、以突变体为特征的改变的序列，如以随机地或以定向的方式，天然存在或人为诱导的，一种或多种核苷酸的删除（缺失）、插入或替代。

本发明的多核苷酸和多肽用于植物表达。

如在本文中使用的术语“植物”包括完整植物、植物的祖先和后代，以及植物部分，包括种子、芽、茎、根（包括块茎（tuber））、和植物细胞、组织和器官。因此术语“植物”还包括悬浮培养物、胚芽、分生组织区、愈伤组织、叶片、配子体、孢子体、花粉、和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括属于绿色植物总科（superfamily Viridiplantae）的所有植物，尤其是具有商业价值的单子叶植物和双子叶植物，包括豆科饲料（fodder）或草料（forage）、观赏植物（ornamental plant）、粮食作物、树、或选自以下非限制性列表的灌木（shrub），包括金合欢属（Acacia spp.）、槭属（Acer spp.）、猕猴桃属（Actinidia spp.）、七叶树属（Aesculus spp.）、南方贝壳杉（Agathis australis）、合欢属（Albizia amara）、桫椤属（Alsophilatricolor）、须芒草属（Andropogon spp.）、落花生属（Arachis spp）、槟榔（Arecacatechu）、Astelia fragrans、鹰咀黄芪属（鹰咀紫云英属，Astragalus cicer）、多小叶红苏木（Baikiaea plurijuga）、桦木属（Betula spp.）、芸苔属（Brassicaspp.）、木榄属（Bruguiera gymnorrhiza）、伯克苏木（Burkea africana）、豆科紫矿树（Butea frondosa）、Cadaba farinosa、朱缨花属（Calliandra spp）、山茶属（Camella sinensis）、美人蕉（Canna indica）、辣椒属（Capsicum spp.）、番泻属（Cassia spp.）、Cent roema pubescens、木瓜属（Chaenomeles spp.）、肉桂（Cinnamomum cassia）、小果咖啡（Coffea arabica）、可乐豆木（Colophospermum mopane）、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂属（Crataegus spp.）、香瓜属（Cucumis spp.）、柏属（Cupressus spp.）、银蕨（Cyathea dealbata）、榅桲属（Cydonia oblonga）、Ciyptomeria laponica、香水茅属（Cymbopogon spp.）、银白树蕨（银叶桫椤，Cynthea dealbata）、榅桲属（Cydonia oblonga）、黄檀属（Dalbergia monetaria）、大叶骨碎补（Davalila divaricata）、山蚂蝗属（Desmodium spp.）、粗糙蚌壳蕨（Dicksoniasquarosa）、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、扁豆属（Dolichos spp.）、Doiycnium rectum、稗属（Echinochloa pyramidalis）、Ehrartia spp.、龙爪稷（Eleusine coracana）、画眉草属（Era grestis spp.）、刺桐属（Erythrina spp.）、桉树属（Eucalyptus spp）、假乌木属（Euclea schimpen）、金茅属（Eulaliavillosa）、荞麦属、Felloa sellowiana、草莓属（Fragaria spp.）、千斤拔属（Flemingia spp）、Freycinetia banksii、老鹳草属（Geranium thunbergi）、育亨宾宁碱（Ginkgo biloba）、野大豆（Glycine javanica）、南洋樱属（Gliricidia spp）、棉属（Gossypium hirsutum）、银桦属（Gre villea spp.）、鞘籽古夷苏木（Guibourtia coleosperma）、岩黄芪属（Hedysarum spp.）、牛鞭草（Hemarthia altissima）、黄茅（Heteropogon con tortus）、大麦（Hordeumvulgare）、红苞茅（Hyparrhenia rufa）、金丝桃属（Hypericum erectum）、Hyperthelia dissoluta、槐蓝属（Indigo incarnata）、鸢尾属（Iris spp.）、麻风树属（Jatropha curcas）、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属（Lespediza spp.）、莴苣属（Lettuca spp.）、银合欢属（Leucaena leucocephala）、脉根属（Loudetiasimplex）、百脉根属（Lotonus bainesi）、莲属（Lotus spp.）、硬皮豆属（Macrotyloma axifiare）、苹果属（Malus spp.）、木薯（Manihot esculenta）、紫苜蓿（Medicago sativa）、水杉（Metasequoia glyptostroboides）、芭蕉属（Musa sapientum）、烟草属（Nicotianum spp.）、驴食草属（Onobtychis spp.）、料豆属（Ornithopus spp.）、稻属（Oryza spp.）、Peltophorum african urn、狼尾草属（Pennisetum spp.）、牛油果（Persea gratissima）、牵牛花属（Petuniaspp.）、菜豆属（Phaseolus spp.）、加拿利海枣（Phoenix canariensis）、新西兰麻（Phormium cookianum）、石楠属（Photinia spp.）、云杉属（Piceaglauca）、松属（Pinus spp.）、豌豆（Pisum sativum）、竹柏属（Podocarpustotara）、Pogonarthria flecki、Pogonarthria squarrosa、杨属（Populus spp.）、牡豆树属（Prosopis cineraria）、黄杉属（Pseudotsuga menziesi）、老虎刺属（Pterolobium stellatum）、犁属（Pyrus communis）、栎树属（Quercus spp.）、石斑木属（Rhaphiolepsis umbellata）、刷子椰子（Rhopalostylis sapida）、Rhu.s natalensis、鹅莓（Ribes grossularia）、茶藨子属（Ribes spp.）、刺槐（Robinia pseudoacacia）、蔷薇属（Rosa spp.）、Rub us spp.、柳属（Salixspp.）、Schyzachyrium sanguineurn、金松属（Sciadopitys verticillata）、红杉（Sequoia sempen'irens）、巨杉（Sequoiadendron giganteum）、蜀黍属（Sorghum bicolor）、菠菜属（Spinacia spp.）、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属（Tadehagi spp）、落羽松（Taxodium distichum）、菅草属（Themeda triandra）、车轴草属（Trifollumspp.）、小麦属（Triticum spp.）、铁杉属（Tsuga heterophylla）、越桔属（Vaccinium spp.）、蚕豆属（Vicia spp.）、葡萄（Vitis vinifera）、沃森花（Watsonia pyramidata）、马蹄莲（Zantedeschia aethiopica）、玉米（Zeamays）、苋菜红（amaranth）、朝鲜蓟（artichoke）、芦笋（asparagus）、绿花椰菜（broccoli）、包子甘蓝（Brussels sprouts）、甘蓝（cabbage）、芸苔（canola）、胡萝卜（carrot）、花椰菜（cauliflower）、芹菜（celery）、羽衣甘蓝（collard green）、亚麻（flax）、羽衣甘蓝（kale）、小扁豆（lentil）、ollseed rape、秋葵（okra）、洋葱（onion）、马铃薯（potato）、稻谷（rice）、大豆（soybean）、稻草（straw）、甜菜（sugar beet）、甘蔗（sugar cane）、向日葵（sunflower）、番茄（tomato）、南瓜茶（squash tea）、树类（trees）。可替换地，可是使用藻类和其他非绿色植物。

可以利用本发明的核酸构建体稳定或瞬时转化植物细胞。在稳定转化中，将本发明的外源多核苷酸整合至植物基因组中，从而它表现出稳定的遗传性状。在瞬时转化中，通过转化细胞表达外源多核苷酸但是并不将其整合至基因组中，因此它表现出短暂的性状。

将外源基因导入单子叶植物和双子叶植物两者中存在各种方法。（Potrykus,I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225;Shimamoto et al.,Nature(1989)338:274-276）。

引起外源DNA稳定整合至植物基因组DNA中的原理方法包括两个主要途径：

（i）土壤杆菌介导的基因转移：Klee等(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38:467-486；Klee和Rogers在Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants,Vol.6,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes编辑Schell,J.，和Vasil,L.K.，Academic Publishers,San Diego,Calif.(1989)p.2-25；Gatenby，在Plant Biotechnology，编辑Kung,S，和Arntzen,C.J.，ButterworthPublishers,Boston,Mass.(1989)p.93-112。

（ii）DNA直接摄取（Direct DNA uptake）：Paszkowski等，在CellCulture and Somatic Cell Genetics of Plants,Vol.6,Molecular Biology ofPlant Nuclear Genes编辑Schell,J.，和Vasil,L.K.，Academic Publishers,SanDiego,Calif.(1989)p.52-68；包括用于直接摄取DNA至原生质体中的方法，Toriyama,K.等(1988)Bio/Technology6:1072-1074。DNA uptake inducedby brief electric shock of plant cells:Zhang等Plant Cell Rep.(1988)7:379-384。Fromm等Nature(1986)319:791-793。DNA injection into plantcells or tissues by particle bombardment,Klein等Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe等Bio/Technology(1988)6:923-926;Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过使用微量滴管系统（micropipette systems）：Neuhaus等Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79:213-217；glass fibers or silicon carbide whiskertransformation of cell cultures,embryos or callus tissue,U.S.Pat.No.5,464,765或用萌芽花粉直接温育DNA，DeWet等在ExperimentalManipulation of Ovule Tissue，编辑Chapman,G.P.和Mantell,S.H.和Daniels，W.Longman,London,(1985)p.197-209；以及Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。

土壤杆菌系统包括质粒载体的应用，质粒载体包含整合至植物基因组DNA中的定义的DNA片断。植物组织的接种方法取决于植物品种和土壤杆菌输送系统而改变。一种广泛使用的方法是可以用为完整植物分化的开始提供良好来源的任何组织外植体（tissue explant）来完成的叶盘（叶碟，leaf disc）过程。Horsch等，在Plant Molecular Biology Manual A5,KluwerAcademic Publishers,Dordrecht(1988)p.1-9。补充的方法是采用土壤杆菌输送系统与真空侵入（vacuum infiltration）结合。土壤杆菌系统在产生转基因双子叶植物中是特别可行的。

存在DNA直接转移至植物细胞中的各种方法。在电穿孔中，将原生质体短暂地暴露于强电场中。在显微注射中，利用非常小的微量吸液管将DNA机械地直接注入至细胞中。在微粒轰击中，将DNA吸附在微粒（microprojectile）（如硫酸镁晶体或钨粒）上，并将微粒物理加速进入细胞或植物组织中。

在稳定转化之后进行植物繁殖。最普通的植物繁殖方法是通过种子。然而，由于杂合性通过种子繁殖的再生具有缺陷，在作物中缺少一致性，这是因为根据取决于孟德尔规则的遗传方差种子是由植物生产的。基本上，每个种子遗传学上是不同的，并且每个将伴随其自身特异的性状而生长。因此，优选生产转化植物以便再生的植物具有与亲本转基因植物一样的性状和特征。因此，优选通过提供快速一致的转化植物繁殖的微繁殖来再生转化植物。

微繁殖是从已经由所选择的亲本植物或栽培种上切除的单组织片生长新一代植物的方法。该方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的大量繁殖（mass reproduction）。所生产的新一代植物与原植物是遗传同一的，并具有原植物的所有特征。微繁殖使得优质植物材料能够在短时期大规模生产并在保存原转基因植物或转化植物的特征的条件下提供所选择的栽培种的快速增殖。克隆植物的优点是植物增殖的速度以及所生产的植物的品质和一致性。

微繁殖是多阶段过程，在各阶段之间需要改变培养基或生长条件。从而，微繁殖方法包括四个基本阶段：阶段一、最初的组织培养；阶段二、组织培养增殖；阶段三、分化和植株形成；阶段四、温室栽培和炼苗（hardening）。在阶段一期间，最初的组织培养，建立组织培养并且经过检验是无污染物的。在阶段二期间，最初的组织培养增殖直至产生足够的组织样品数量以符合生产目标。在阶段三期间，将在阶段二中生长的组织样品分开，生长成单独的小植株。在阶段四，将转化的小植株转移至温室用于炼苗，其中逐渐提高植物对光的耐受性以便它可以在自然环境中生长。

根据本发明的一些实施方式，为了感兴趣的性状（例如，改进的FUE、胁迫耐受性等），进一步选择如上文描述的所产生的成熟的转化植物。在下文以及在随后部分的实施例中提供了这类筛选试验的实例。从而，例如，可以筛选转基因植物，来提高在正常或胁迫状态下的营养价值（例如，自身提高的油、氨基酸和/或蛋白含量，以及N含量），下文中将进一步描述。可替换地或另外，将转化的和非转化的（野生型）植物暴露于非生物胁迫状态下，如水恶化、亚适温、营养缺乏、或优选盐胁迫状态。例如，盐胁迫可以通过许多途径实现，如通过用高渗溶液灌溉植物，通过在高渗的生长溶液（例如，霍格兰溶液）中溶液培养地来培养植物，或通过在高渗的培养基（例如，MS培养基）中培养植物。因为不同植物在其对盐度的耐受性中显著地变化，优选根据特异的植物栽培品种或变种的特异性特征来调节灌溉水、生长溶液、或培养基中的盐浓度，以便对植物的生理学和/或形态学施加温和的或适度的作用（对于关于适当浓度的指南，请参见，Bernstein和Kafkafi,Root Growth Under Salinity Stress In:Plant Roots,TheHidden Half3rd ed.Waisel Y,Eshel A和Kafkafi U.(editors)Marcel DekkerInc.,New York,2002，及其参考文献）。在暴露于胁迫状态之后，频繁监测植物直至在野生型植物上出现显著的生理学和/或形态学效应。其后，没有表现出显著的生理学和/或形态学效应，或者表现出比野生型植物更高的生物量的转化植物被鉴定为非生物胁迫耐受植物。

根据本发明的一些实施方式，转化是稳定转化。

根据本发明的一些实施方式，转化是瞬时转化。这种转化可以是针对叶片细胞、分生细胞或完整植物。

瞬时转化可以通过任何如上所述DNA直接转移法或利用改进植物病毒的病毒感染来实现。

已经显示出对于植物宿主的转化有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。利用植物病毒进行植物的转化在以下各项中描述：U.S.Pat.No.4,855,237（BGV）、EP-A67,553（TMV）、日本公开申请号63-14693（TMV）、EPA194,809（BV）、EPA278,667（BV）；以及Gluzman,Y.等，Communicationsin Molecular Biology:Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork,pp.172-189（1988）。在WO87/06261中描述了在许多宿主（包括植物）中用于表达外源DNA的假病毒微粒。

优选地，本发明的病毒是无毒性的，从而不能引起严重的症状，如降低的生长速率、花叶症、环斑病、卷叶、黄化、斑纹（streaking）、痘病形成、肿瘤形成和凹陷性病斑。合适的无毒病毒可以是天然存在的无毒病毒或人工弱化（减毒）病毒。可以通过利用本领域熟知的方法实现病毒的弱化，包括但不限于不致死加热（sub-lethal heating）、化学处理或，例如，如通过Kurihara和Watanabe（Molecular Plant Pathology4:259-269,2003），Gal-on等(1992)，Atreya等(1992)和Huet等(1994)所描述的直接诱变技术。

合适的病毒株可以从可利用的资源像是例如，从American Typeculture Collection（ATCC）得到或通过由被感染的植物中分离而获得。从被感染的植物组织中分离病毒可以通过本领域熟知的技术实现，像是例如Foster和Tatlor，编辑的“Plant Virology Protocols From Virus Isolation toTransgenic Resistance（Methods in Molecular Biology(Humana Pr),Vol81），Humana Press,1998所描述的。简而言之，将认为包含高浓度适当病毒的被感染植物的组织（优选嫩叶和花瓣）置于缓冲溶液（例如，磷酸盐缓冲液）中以产生可以用于随后接种的病毒感染的浆液（sap）。

用于植物中非病毒性外源多核苷酸序列的导入和表达的植物RNA病毒的构建通过上述参考文献以及通过Dawson，W.O.等Virology(1989)172:285-292；Takamatsu等EMBO J.(1987)6:307-311；French等Science(1986)231:1294-1297；以及Takamatsu等FEBS Letters(1990)269:73-76进行说明。

当病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行适当的修饰。可替换地，首先可以将病毒克隆至细菌质粒中以便于构建所期望的具有外源DNA的病毒载体。然后可以将病毒从质粒中切除。如果病毒是DNA病毒，可以将细菌的复制起点附着于病毒DNA上，然后通过细菌复制病毒DNA。该DNA的转录和翻译将产生将使病毒DNA包封的外壳蛋白。如果病毒是RNA病毒，通常将病毒克隆为cDNA，并将其插入质粒中。然后将质粒用于构造所有的构建体。然后通过转录质粒的病毒序列和翻译病毒基因来生产RNA病毒，从而生产包封病毒RNA的一种或多种外壳蛋白。

用于植物中非病毒性外源多核苷酸序列的导入和表达的植物RNA病毒的构建体（如包括在本发明的构建体中的那些）通过上述参考文献以及通过U.S.Pat.No.5,316,931进行说明。

在一个实施方式中，提供植物病毒多核苷酸，其中，已经将天然的外壳蛋白编码序列从病毒多核苷酸、非天然的植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子中删除（缺失），优选地，已经将能够在植物宿主中表达、包装重组植物病毒多核苷酸、并通过重组植物病毒多核苷酸确保宿主的系统性感染的非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子插入。可替换地，通过在外壳蛋白基因内插入非天然多核苷酸序列可以使外壳蛋白基因失活，从而生产蛋白。重组植物病毒多核苷酸可以包含一种或多种另外的非天然亚基因组（subgenomic）启动子。每个非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻的基因或多核苷酸序列并且不能彼此以及与天然的亚基因组启动子进行重组。如果包括超过一个多核苷酸序列，那么非天然（外来）多核苷酸序列可以邻近天然植物病毒亚基因组的启动子或天然和非天然植物病毒亚基因组的启动子插入。在亚基因组启动子的控制下，在宿主植物中转录或表达非天然多核苷酸序列以生产所期望的产品。

在第二实施方式中，如在第一实施方式中提供重组植物病毒多核苷酸，除了将天然外壳蛋白编码序列定位于靠近非天然外壳蛋白亚基因组启动子（而不是非天然外壳蛋白编码序列）中的一个。

在第三实施方式中，提供重组植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白基因靠近其亚基因组启动子，并且已经将一种或多种非天然亚基因组启动子插入病毒多核苷酸中。被插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达相邻的基因并且不能彼此以及与天然的亚基因组启动子进行重组。可以相邻于非天然亚基因组植物病毒启动子将非天然多核苷酸序列插入，以便在亚基因组启动子的控制下在宿主植物中转录或表达序列以生产所期望的产品。

在第四实施方式中，如在第三实施方式中提供重组植物病毒多核苷酸，除了用非天然外壳蛋白编码序列替代天然外壳蛋白编码序列。

用由重组植物病毒多核苷酸编码的外壳蛋白将病毒载体包封（壳封）以产生重组植物病毒。重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒用于感染适当的宿主植物。重组植物病毒多核苷酸能够在宿主中复制、在宿主中系统性传播、并在宿主中转录或表达一种或多种外源基因（外源多核苷酸）以产生所期望的蛋白。

用于向植物接种病毒的技术可以在以下各项中找到：Foster和Taylor，编辑“Plant Virology Protocols:From Virus Isolation to Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(Humana Pr),Vol81)”，Humana Press,1998；Maramorosh和Koprowski，编辑“Methods in Virology”7vols,AcademicPress,New York1967-1984；Hill,S.A.“Methods in Plant Virology”，Blackwell,Oxford,1984；Walkey,D.G.A“Applied Plant Virology”，Wiley,New York,1985；以及Kado和Agrawa，编辑“Principles and Techniques inPlant Virology”，Van Nostrand-Reinhold,New York。

除上述之外，也可以将本发明的多核苷酸导入至叶绿体基因组中，从而使叶绿体能够表达。

用于向叶绿体的基因组中导入外源多核苷酸序列的技术是已知的。该技术包括以下步骤。首先，对植物细胞进行化学处理以便将每个细胞的叶绿体数目降低为约一个。然后，为了将至少一个外源多核苷酸分子导入叶绿体的目的，经由粒子轰击将外源多核苷酸导入细胞中。选择外源多核苷酸以便其经由同源重组能够整合至叶绿体的基因组中，同源重组容易受到叶绿体固有酶类的影响。为这个目的，除感兴趣的基因之外，外源多核苷酸还包括来源于叶绿体基因组的至少一个多核苷酸链段（polynucleotidestretch）。此外，外源多核苷酸包括选择性标记，选择性标记通过顺序选择过程起作用以确定按照这种选择的所有或基本所有的叶绿体基因组的拷贝将包括外源多核苷酸。在U.S.Pat.No.4,945,050；和5,693,507中找到关于该技术的更多的细节，通过引用将其结合于此。从而通过叶绿体的蛋白表达系统可以产生多肽并将多肽整合至叶绿体的内膜中。

因为在植物中本发明的特征（例如，非生物胁迫耐受性）可以涉及多基因加和地或协同地起作用（参见，例如，Quesda等，Plant Physiol.130:951-063,2002），本发明还设想了在单独的宿主植物中表达多个外源多核苷酸，从而获得优良的非生物胁迫耐受性、生物量和/或产率。

在单独的宿主植物中表达多个外源多核苷酸可以通过向单独的植物细胞中共导入（co-introducing）多个核酸构建体（每一个包括不同的外源多核苷酸）而实现。然后，可以利用上文描述的方法，使转化细胞在成熟的植物中再生。

可替换地，在单独的宿主植物中表达多个外源多核苷酸可以通过将包括多个不同的外源多核苷酸的单独的核酸构造共导入至单独的植物细胞中而实现。可以用能够转录包括所有不同外源多核苷酸序列的多顺反子信息的单独的启动子序列来设计这种构建体。为了使由多顺反子信息编码的不同的多肽能够共翻译，可以经由内部核糖体进入位点（IRES）序列互相连接多核苷酸序列，该内部核糖体进入位点序列促进位于IRES序列下游的多核苷酸序列的翻译。在这种情况下，编码如上所述的不同多肽的转录的多顺反子RNA分子将从多顺反子RNA分子的加帽5'末端和两个内部IRES序列被翻译，从而在细胞中产生所有的不同的多肽。可替换地，构建体可以包含一些启动子序列，每一个都连接至不同的外源多核苷酸序列。

利用上文描述的方法，用包括多个不同的外源多核苷酸的构建体转化的植物细胞可以再生为成熟的植物。

可替换地，在单独的宿主植物中表达多个外源多核苷酸可以通过将不同的核酸构建体（包括不同的外源多核苷酸）导入至多个植物中而实现。然后再生的转化的植物可以进行杂交，并利用常规的植物育种技术，为了优良的性状（如NUE、非生物胁迫耐受性和/或生物量）而选择所得到的后代。

从而，根据本发明的一些实施方式的一方面，提供包含本发明的一些实施方式的核酸构建体或本发明的一些实施方式的宿主细胞的转基因植物。

根据本发明的一些实施方式，转基因植物外源性地表达本发明的一些实施方式的核酸构建体。

如上面所述的和在随后的实施例部分的实施例1-2中所描述的，过表达根据本发明的一些实施方式的核酸构建体的转基因植物对各种非生物胁迫表现出提高的耐受性和/或抗性。

从而，根据本发明的一些实施方式的一方面，提供一种提高植物的非生物胁迫耐受性（ABST）的方法。该方法通过在植物内表达本发明的一些实施方式的核酸构建体而实现，从而提高植物的非生物胁迫耐受性。

如在本文中使用的，术语“提高”是指改善或提高本发明的一些实施方式的转基因植物的性状，比非转基因植物（例如，一种或多种对照转染（模拟品转染，mock transfected）植物、天然植物、野生型植物）改善或提高至少约2%、约3%、约4%、约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约99%。

如在本文中使用的，术语“性状”是指可以整体（直接地或间接地）改进植物商业价值的植物的特征或性质。

如在本文中使用的，短语“胁迫耐受性”是指在新陈代谢、生长、产率和/或生活力方面没有遭受显著改变的情况下，植物忍受胁迫（非生物的）的能力。

根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的基因工程植物表现出超过非转基因植物至少约2%、约3%、约4%、约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%或甚至更高的对非生物胁迫的耐受性。

如在本文中使用的，短语“非生物胁迫”是指对植物的新陈代谢、生长、繁殖和/或生存能力的任何不良影响。因此，非生物胁迫可以通过不是最适宜的环境生长条件诱导，像是例如，盐度、缺水、洪水、冷冻、低温或高温、重金属毒性、乏氧生活、养分缺乏、大气污染或UV照射。非生物胁迫的含义在背景技术部分中论述。

根据本发明的一些实施方式，非生物胁迫可以是干旱、冷胁迫、骤冷胁迫、热胁迫、盐胁迫、渗透胁迫、冷冻胁迫、营养缺乏、重金属胁迫和/或它们的任意组合。

如在本文中使用的，短语“水利用效率（WUE）”是指通过植物消耗的每单位水所产生的有机物质的水平，即，与植物用水相关的植物干重，例如，每单位蒸腾所产生的生物量。

如在本文中使用的，短语“肥料利用效率”是指施加每单位肥料导致增加植物的产率、生物量、活力、和生长速率的一个或多个代谢过程。代谢过程可以是摄取、传播、吸收、累积、再分配（在植物内）以及由植物所吸收的的一种或多种矿物质和有机物部分的应用，如氮、磷酸盐和/或钾。

如在本文中使用的，短语“肥料限制状态”是指包括低于用于正常的植物代谢、生长、繁殖和/或生存能力所需水平的肥料施加水平（例如，浓度）的生长状态。

如在本文中使用的，短语“氮利用效率（NUE）”是指施加每单位氮导致增加植物的产率、生物量、活力、和生长速率的一个或多个代谢过程。代谢过程可以是摄取、传播、吸收、累积、再分配（在植物内）和由植物所吸收的氮的利用。

如在本文中使用的，短语“氮限制状态”是指包括低于用于正常的植物代谢、生长、繁殖和/或生存能力所需水平的氮（例如，铵或硝酸盐）施加水平（例如，浓度）的生长条件。在本领域中改进的植物NUE和FUE是指，收获类似数量的产量然而实现较少的肥料，或者通过施加相同水平的肥料而获得提高的产率。从而，在本领域中改进的NUE或FUE对植物产量具有直接效应。从而，本发明的一些实施方式的多核苷酸和多肽积极影响植物产量、种子产量、和植物生物量。此外，改进的植物NUE的优点必将改进农作物品质和种子的生物化学组分如蛋白产量和油产量。

如在本文中使用的，术语“增加”是指相比于相同种类的天然植物，即，不使用本发明的生物分子（多核苷酸或多肽）修饰的植物，例如在相同生长条件下生长的非转化植物，在植物的产量、生长速率、生物量、活力、含油量、非生物胁迫耐受性和/或氮利用效率方面增加至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%。

根据本发明的一些实施方式，该方法进一步包括在非生物胁迫下培育植物。

使植物经受一系列环境挑战。这些中的一部分（包括盐胁迫、一般的（总的，general）渗透胁迫、干旱胁迫和冷冻胁迫）具有影响完整植物和细胞的水可用性的能力。然后，不出意料地，植物对这种胁迫的集合做出的响应是相关的。Zhu(2002)Ann.Rev.Plant Biol.53:247-273等。指出“对于水胁迫信号的大多数研究已经主要集中在盐胁迫，因为对于盐和干旱的植物应答密切相关并且机理重叠”。已经记录了对这类胁迫的相似响应和途径的许多实例。例如，CBF转录因子已经显示出对盐、冷冻和干旱的条件抗性（condition resistance）（Kasuga等(1999)Nature Biotech.17:287-291）。在对盐胁迫和脱水胁迫两者的响应中诱导拟南芥rd29B基因，通过ABA信号转导过程大大地介导该过程（Uno等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:11632-11637），导致结合至rd29B启动子内的上游元件的转录因子改变活性。在松叶菊属（日中华属，Mesembryanthemum crystallinum）（冰叶草（ice plant））中，Patharker和Cushman已经表明通过暴露于干旱胁迫和盐胁迫两者中来诱导钙依赖性蛋白激酶（McCDPK1）（Patharker和Cushman(2000)Plant J.24:679-691）。尽管在对盐或干旱胁迫的响应中目标转录因子的转录水平没有改变，但是胁迫诱导激酶也显示了使转录因子磷酸化，可能改变它的活性。类似地，Saijo等证明当过表达时稻谷中盐/干旱诱导的钙依赖性蛋白激酶（OsCDPK7）提供给稻谷提高的盐和干旱耐受性（Saijo等(2000)Plant J.23:319-327）。

暴露于脱水引起植物中与冷冻胁迫类似的生存策略（参见，例如，Yelenosky(1989)Plant Physiol89:444-451）而干旱胁迫诱导冷冻耐受性（参见，例如，Siminovitch等(1982)Plant Physiol69:250-255；以及Guy等(1992)Planta188:265-270）。除了冷适应蛋白的诱导之外，在较低的水分状态下能够使植物存活的策略可以包括，例如，降低的表面积、或表面油或蜡的产量。在另一个实施例中，提高的植物溶解物含量防止由于加热、干旱、盐度、渗压剂等而造成的蒸发和水分流失，因此提供对上述胁迫更好的植物耐受性。

应当领会涉及对一种胁迫（如上文所描述的）的抗性的一些途径，还会涉及对通过相同或同源基因调控的其他胁迫的抗性。当然，全部的抗性途径是相关的，不是相同的，因此，不是控制对一种胁迫的抗性的所有基因都会控制对其他胁迫的抗性。虽然如此，如果基因控制对这些胁迫之一的抗性，对于本领域技术人员而言显而易见的是测试对于这些相关胁迫的抗性。在下文以及在随后部分的实施例中提供了评价胁迫抗性的方法。

期望本发明的一些实施方式的转基因植物对于忍受胁迫的能力影响植物生物量、活力和产量。相应的还预期出现良好的结果，基本上，改进的生物量、活力和/或产量是期望的，以提高本发明的转基因植物对胁迫状态的耐性。

从而，如在随后的实施例部分的实施例1-3中所进一步描述的，根据本发明的一些实施方式的转基因植物，在非生物胁迫状态下和/或非胁迫（例如，最佳）状态下，表现出提高的生物量（图4A-4C、图9和图16）、生长速率（图5A-图5C、图6A-图6C）、产量（图7）和叶绿素含量（图16）。应当注意的是，每株植物的叶片和/或每株植物的种子的数量增加可以预测每株植物含油量的增加。

从而，根据本发明的一些实施方式的一方面，提供一种提高植物的产量、生物量、活力、生长速率的方法，包括在植物内表达本发明的一些实施方式的核酸构建体，从而提高植物的产量、生物量、含油量、活力、生长速率。

如在本文中使用的，短语“植物生物量”是指在生长季节由植物产生的组织的量（例如，以克计量的空气干燥的组织），它也可以决定或影响植物产量或每生长区（growing area）的产量。植物生物量的增加可以是完整植物或其部分，如在地上的（可收获的）部分、营养生物量、根和种子。

如在本文中使用的，短语“生长速率”是指每段时间植物器官/组织尺寸的增加（可以以cm²/天计量）。

如在本文中使用的，短语“植物活力”是指在给定时间内，由植物产生的组织的量（按重量计测定）。因此，提高的活力可以决定或影响植物产量或每个生长期或每个种植区的产量。此外，早期活力（种子和/或籽苗）导致提高的田间站立（field stand）。应当注意的是可以在胁迫（例如，非生物胁迫、氮限制状态）和/或非胁迫（正常）状态下测定植物产量。

在温带的和热带的稻谷栽培品种中，改进早期活力是现代稻谷育种计划的重要目的。在水中播种的稻谷中，为了适当的土壤固定（anchorage），长根是重要的。其中直接将水稻播种至被水淹没的耕地中，其中植物必须快速地出水，较长的芽与活力相关。进行条播（drill-seeding）的地方，较长的中胚轴和胚芽鞘对于壮苗的出现是重要的。在农业中将早期活力注入（engineer）植物中的能力将是极为重要的。例如，不良的早期活力已限制了基于欧洲大西洋的玉米带（Corn Belt）种质的玉米（Zea mays L.）杂种的引入。

如在本文中使用的，短语“植物产量”是指每株植物或每个生长季节所产生的组织或器官的量（按重量或尺寸计而测定的）或数量（个数）。因此提高的产量可以影响在某一种植区和/或生长期可以从植物中获得的经济效益。应当注意的是植物产量可以受各种参数的影响，包括但不限于，植物生物量；植物活力；生长速率；种子产量；种子或谷粒数量；种子或谷粒品质；油产量；油含量；所收获的器官中的淀粉和/或蛋白（例如，植物的种子或营养部分）；每个花序中花（小花）的数量（表示为饱满种子数量与原始花序数量的比率）；收获指数；每面积所生长的植株数量；每株植物和每片面积所收获的器官的数量和尺寸；每片种植区的植株数量（密度）；在田地收获的器官的数量；总的叶片面积；碳同化和碳分配（在植物内的分配/配制）；对阴暗的抗性；可收获器官（例如种子）的数量，每角粒数（seeds per pod），每粒种子的重量；以及修饰的结构如增加茎的直径、厚度或改进物理性质（例如弹性）。

为了分析转基因在植物生理学上的作用，可以评价总产量和生物量、植物对肥料缺乏和对非生物胁迫（如干旱、盐度、冷胁迫和热胁迫、冷冻等）的耐受性。评价是否植物在其任意部分包含提高含量的蛋白、游离氨基酸、油和任何感兴趣的其他代谢的化合物也是极为重要的。如在本文中使用的短语“种子产量”是指每株植物的种子的数量或重量、每角或每片种植区的粒数、或指单独的种子的重量，或指每粒种子萃取的油。因此种子产量可以受到种子尺寸（例如，长度、宽度、周长、面积和/或体积）、（饱满的）种子的数量、种子灌浆速率（filling rate）以及受到种子油含量的影响。因此增加每株植物的种子产量可以影响在某一种植区和/或生长期内可以从植物中获得的经济效益；增加每个种植区的种子产量可以通过增加每株植物的种子产量，和/或通过增加在相同的特定面积上生长的植株数量而实现。

如在本文中使用的，术语“种子”（也称为“谷类”或“籽粒（kernel）”）是指包在称之为种皮的遮盖物中的小的胚体（通常具有一些贮藏的养分），裸子植物和被子植物植株的成熟胚珠的产物，其发生在受精后，一些在母本植物内生长。

种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言非常重要。农作物如玉米、稻谷、小麦、油菜（canola）和大豆占到超过人类热量摄取总数的一半，无论是通过种子本身的直接消耗或通过基于加工种子而产生的肉类食品的消耗。它们也是糖类、油类以及用于工艺过程的许多种代谢物的来源。种子包含胚芽（新芽和根的来源）和胚乳（用于在萌芽期间和在籽苗的早期生长期间的胚胎生长的营养物来源）。种子的发育涉及许多基因，并且需要将代谢物从根、叶片和茎转移至生长的种子中。特别地，胚乳吸收糖类、油类和蛋白质类的代谢前体，并将它们合成为存储大分子以填满谷类。

如在本文中使用的，短语“含油量”是指在特定的植物器官中的油脂的量，种子（种子油含量）或植物的营养部分（营养含油量），典型地表示为干重（10%的种子湿度）或湿重（用于营养部分）的百分比。应当注意的是含油量受到组织（例如，种子、营养部分）内在的油产量，以及每株植物或每个生长阶段的产油组织的质量或尺寸的影响。在一个实施方式中，植物含油量的增加可以通过增加一种或多种植物组织的尺寸/质量来实现，该组织包含每个生长阶段的油。从而，提高的植物含油量可以通过增加植物的产量、生长速率、生物量和活力来实现。

如在本文中使用的，短语“非胁迫状态”是指没有显著超出植物可能遇到的每日气候条件和其他非生物条件的生长条件（例如，水、温度、光暗循环、湿度、盐浓度、土壤中肥料浓度、养分供给如氮、磷和/或钾），并且其在植物的生存周期（例如，农作物从种子变成成熟的植物以及再次回到种子）的任何阶段允许植物的最佳的生长、新陈代谢、繁殖和/或生存能力。本领域技术人员知道对于在特定地理位置的特定植物而言的正常土壤条件和气候条件。应当注意的是虽然非胁迫状态可以包括来自最佳条件（一种类型/种类植物的最佳条件与另一种不同）的一些温和变化，这类变化不会引起植物停止生长，没有重新开始生长的能力。

一旦在植物细胞或整个植物内表达，那么由外源多核苷酸编码的多肽水平可以通过本领域熟知的方法测定，如活性测定、利用能够特异结合多肽的抗体的蛋白质印迹（Western blot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光等等。

在由外源多核苷酸转录的RNA的植物中测定该水平的方法是本领域熟知的，包括，例如，Northern印迹分析、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析（包括定量的、半定量的或实时RT-PCR）和RNA-m原位杂交。

筛选外源表达本发明的多核苷酸的株系（Plant line）以识别对所期望的植物性状表现出最大增加的那些。转基因（例如，在胁迫相关启动子下编码IPT的核酸构建体）对非生物胁迫耐受性的作用可以利用已知方法（如在下面的和在随后的实施例部分中的细节）来测定。

非生物胁迫耐受性-将转化（即，表达转基因）和非转化（野生型）植物暴露于非生物胁迫状态下，如缺水、亚适温（低温、高温）、营养缺乏、营养过多、盐胁迫状态、渗透胁迫、重金属毒性、乏氧生活、大气污染和UV照射。

耐盐性试验-预期，对高于野生型的最佳盐浓度的水平具有耐受性的转基因植物，与在相同盐浓度下的野生型植物相比，在高盐下将表现出更好的萌芽、籽苗活力或生长。例如，盐胁迫可以通过许多途径实现，像是例如，通过用高渗溶液灌溉植物，通过在高渗生长溶液（例如，霍格兰溶液）中溶液培养地来培养植物，或通过在高渗培养基，例如50%的Murashige-Skoog培养基（MS培养基）中培养植物。因为不同植物在其对盐度的耐受性中显著地变化，可以根据特异性植物栽培品种或变种的特异性特征来调节灌溉水、生长溶液、或培养基中的盐浓度，以便对植物的生理学和/或形态学施加温和的或适度的作用（对于关于适当浓度的指南，请参见，Bernstein和Kafkafi,Root Growth Under Salinity Stress In:Plant Roots,The Hidden Half3rd ed.Waisel Y,Eshel A and Kafkafi U.(editors)MarcelDekker Inc.,New York,2002，及其参考文献）。例如，耐盐性测试可以通过在植物不同的发育阶段用渐增浓度的氯化钠（例如50mM、100mM、200mM、400mM的NaCl）灌溉植物来进行，要从底部以及从上面施加氯化钠以确保盐的均匀分散。在暴露于胁迫状态之后，频繁监测植物直至在野生型植物上出现显著的生理学和/或形态学效应。从而，在对照和转基因植物之间比较外部表型外观、萎蔫以及全部成功达到成熟和产生后代的程度。测定的耐受性的定量参数包括，但不限于，平均的湿重和干重、生长速率、叶片尺寸、叶片覆盖度（总叶片面积）、所产生的种子的重量、平均种子尺寸以及每株植物产生的种子数量。没有表现出显著的生理学和/或形态学效应，或者表现出比野生型植物更高的生物量的转化植物，被鉴定为非生物胁迫耐受的植物。

渗透耐受性测试-进行渗透胁迫分析（包括氯化钠和甘露醇试验）以在普通渗透胁迫表型和氯化钠特异性表型之间进行鉴别。对渗透胁迫是耐受的植物对干旱和/或冷冻可以更具有耐受性。对于盐胁迫和渗透胁迫萌芽实验，例如，用50mM、100mM、200mM的NaCl或100mM、200mM的NaCl、400mM的甘露醇补充培养基。

干旱耐受性试验/渗压剂试验（osmoticum assay）-进行对干旱的耐受性，以识别在剧烈脱水之后更好地使植物存活的基因。为了分析转基因植物是否更加耐受干旱，可以通过在培养基中的非离子渗透物山梨醇产生的渗透胁迫来进行。对照组和转基因植物在植物琼指平板中萌芽和生长4天，之后，将它们转移至包含500mM山梨醇的平板中。该处理引起生长停滞，然后通过测量植物重量（湿的和干的），并通过由开花时间测定的生长速率产量来比较对照组和转基因植物两者。相反，利用过表达上文详述的多核苷酸的植物进行基于土壤的干旱筛选。来自对照组拟南芥植物的种子、或过表达本发明多肽的其他转基因植物的种子萌芽并将其转移至盆中。停止灌溉，并伴随将盆置于吸水纸以增强土壤干燥速率，之后，得到干旱胁迫。当大部分对照植物发育严重萎蔫时，将转基因植物和对照植物彼此比较。在获得显示出严重萎蔫的大部分对照植物之后，对植物进行再浇灌。按照下列两个标准中的每一个，与对照组比较将植物分等级：对干旱条件的耐受性以及再浇灌之后的恢复（存活）。

冷胁迫耐受性-为了分析冷胁迫，将成熟的（25天大）植物转移至4°C的具有组成型光（constitutive light）的小室1周或2周。之后，将植物移回温室。骤冷期损害两周后，在对照组和转基因植物之间，通过测量植物重量（湿的和干的）比较所导致的生长停滞和其他表型，并通过比较按照开花时间所测定的生长速率、植物大小、产量等等。热胁迫耐受性-通过将植物暴露至高于34°C的温度下一定时间段来实现热胁迫耐受性。将植物转移回到22°C以恢复，之后检测植物耐受性，在5天后，相对于内部对照组（非转基因植物）或既没有暴露于冷胁迫也没有暴露于热胁迫的植物进行评价。

水利用效率-可以按照每单位蒸腾所产生的生物量进行测定。为了分析WUE，可以测定对照组和转基因植物的叶片相对含水量。立即记录鲜重（FW）；然后在室温下在黑暗中将叶片在蒸馏水中浸泡8小时，并记录溶胀的重量（TW）。在60°C下干燥叶片至恒重后记录总干重（DW）。根据下式计算相对含水量（RWC）：RWC=(FW-DW)/(TW-DW)x100。

肥料利用效率-为了分析转基因植物是否对肥料更响应，使植物在具有限量肥料的琼指平板或盆中生长，如，例如，在Yanagisawa等（ProcNatl Acad Sci U S A.2004.101:7833-8）中所描述的。对于植物的总体尺寸、开花时间、产量、芽和/或谷粒的蛋白含量，对植物进行分析。所检查的参数是成熟植物的总体尺寸、它的湿重和干重、所产生的种子的重量、平均种子大小和每株植物产生的种子数量。可以测试的其他参数是：叶片的叶绿素含量（因为氮植物状态与叶片新鲜程度是高度相关的）、种子或其他植物部分（如叶片或芽）的氨基酸和总蛋白含量、含油量等等。类似地，代替提供限量的氮，可以以渐增的浓度加入磷酸盐或钾。此外，所测定的相同的参数与上面列出的相同。以这种方式评价氮利用效率（NUE）、磷酸盐利用效率（PUE）和钾利用效率（KUE），检查了转基因植物在营养抑制状态下发育健壮的能力。

氮利用效率-为了分析转基因拟南芥植物是否对氮更响应，使植物在0.75-1.5mM（氮缺乏条件）或6-10mM（最佳氮浓度）下生长。使植物生长另外的20天或直至产生种子。然后对于植物的总体尺寸、开花时间、产量、芽和/或谷粒/种子产量的蛋白含量，对植物进行分析。所检查的参数可以是植物的总体尺寸、湿重和干重、所产生的种子的重量、平均种子大小和每株植物产生的种子数量。可以测试的其他参数是：叶片的叶绿素含量（因为氮植物状态与叶片绿色程度是高度相关的）、种子或其他植物部分（如叶片或芽）的氨基酸和总蛋白含量、含油量。没有表现出显著的生理学和/或形态学效应，或者表现出比野生型植物更高的所测定的参数水平的转化植物，被鉴定为有氮利用效率的植物。

利用小植株（苗，plantlet）的氮利用效率试验–根据Yanagisawa-S.等，利用较小的改良（“Metabolic engineering with Dofl transcription factor inplants:Improved nitrogen assimilation and growth under low-nitrogenconditions”Proc.Natl.Acad.ScL USA101,7833-7838）完成试验。简而言之，将在补充有选择试剂的0.5x MS（Murashige-Skoog）中生长7-10天的转基因植物转移至两个氮限制状态下：MS培养基，其中结合的氮浓度（NH₄NO和KNO₃）是0.2mM或0.05mM。使植物生长另外的30-40天，然后照相，逐一地从琼脂中移除（芽没有根），并立即称重（鲜重）用于稍后的统计分析。将只对于Tl种子可利用的构建体播种在选择性培养基中，将至少25棵籽苗（每一棵代表一个独立的转化事件）小心地转移至限制氮的培养基中。对于T2种子可利用的构建体，分析不同的转化事件。通常，将从每个事件中随机选择的25个植物转移至限制氮的培养基中，使其生长另外的3-4周，并在周期结束时逐个称重。对比转基因植物与在相同条件下平行生长的对照植物。在相同启动子下表达uidA报告基因（GUS）的模拟转基因植物用作对照。

氮测定-在植物的结构部分中N（氮）浓度测定的方法包括过硫酸钾消解法以将有机N转化为NO（Purcell和King1996Argon.J.88.111-113,the modified Cd mediated reduction of NO₃to NO₂（Vodovotz1996Biotechniques20:390-394）以及通过萘基乙二胶（Griess）试验的亚硝酸盐测量法（Vodovotz1996，如上）。吸光率值是在550nm处按照NaNO₂的标准曲线测定的。在Samonte等2006Agron.J.98:168-176中详细地描述了该方法。

萌芽试验-萌芽试验将可以完成萌芽过程的来自转基因植物的种子的百分比与用同样方式处理的来自对照植物的种子的百分比相比较。例如考虑的正常状态是在22°C下、在22小时光2小时暗的日循环下温育。在播种后4至14天之间进行萌芽和籽苗活力的评价。基本的培养基是50%的MS培养基（Murashige和Skoog，1962Plant Physiology15,473-497）。也在不利条件下测试萌芽，如冷（在低于10°C的温度下培育，而不是22°C）或使用包含如山梨醇的高浓度渗透物（以50mM、100mM、200mM、300mM、500mM、甚至高达（up to）1000mM的浓度）的种子抑制溶液或应用渐增浓度的盐（50mM、100mM、200mM、300mM、500mM的NaCl）。转基因对植物的活力、生长速率、生物量、产量和/或含油量的作用可以利用已知方法测定。植物活力-植物活力可以通过每段时间在生长参数（如叶片面积、纤维长度、莲座丛（rosette）直径、植物鲜重等）上的增加来计算。

生长速率-可以利用生长中的植物的数字分析测定生长速率。例如，每3天可以捕捉在温室中生长的植物基于小区（plot）的图像，通过数字分析可以计算莲座丛（rosette）面积。利用在取样的天数之间莲座丛面积差除以样品之间的天数差来计算莲座丛面积生长。可以通过测量每段时间所产生的植物生物量、莲座丛面积、叶片尺寸或根长来进行生长速率的评价（可以以cm²/天的叶片面积量度）。

可以利用在一定时间过程中面积的回归系数（regression coefficient）来计算相对生长率面积（以1/天的单位）。

种子产量-每株植物种子产量的评价可以通过测量所产生的以及从8-16株植物中收获的干燥种子的量（重量或尺寸）或数量（即，数目）以及除以植物的数目来完成。例如，可以收集来自8-16株植物的全部种子，利用例如分析天平来称重，并且用总重量除以植物数目。每个种植区的种子产量可以用相同的方式计算，同时考虑对于单独植株所给定的种植区（种植面积）。增加每个种植区的种子产量可以通过增加每株植物的种子产量而实现，和/或通过增加能够在特定的面积中生长的植株数量来实现。此外，可以经由1000粒种子的重量来测定种子产量。1000粒种子的重量可以按以下来测定：将种子分散在玻璃盘子中并拍摄照片。对每个样品进行称重，然后利用数字分析，计算每个样品中种子的数目。1000粒种子的重量计算为样品中种子的数目/样品重量X1000。

收获指数可以计算为每株植物的平均种子产量/平均干重。

谷粒蛋白浓度-谷粒蛋白含量（g谷粒蛋白m^-2）估计为谷粒N的质量（g谷粒蛋白m^-2）乘以N/蛋白转换比k-5.13的乘积（Mosse1990，上文）。谷粒蛋白浓度估计为每单位谷粒质量的谷粒蛋白含量的比率（g谷粒蛋白kg^-1谷粒）。

纤维长度-纤维长度可以利用纤维照影机测量。纤维照影机系统用于按照“上半部平均”（“Upper Half Mean”）长度来计算长度。上半部平均（UHM）是纤维分布的较长半部的平均长度。纤维照影机以特定的百分点测量跨距（span length）的长度。（Hypertext Transfer Protocol://World WideWeb(dot)cottoninc(dot)com/ClassificationofCotton/？Pg=4#Length）。

根据本发明的一些实施方式，提高的谷物（corn）产量可以由以下各项中的一个或多个来表明：每个种植区植株数的增加，单株穗数的增加、单穗行数、每行穗的谷粒数、籽粒重、千粒重（1000粒的重量）、穗长/直径的增加，每粒含油量的增加以及每粒淀粉含量的增加。

如所提及的，植物产量的增加可以通过各种参数来测定。例如，水稻产量的提高可以通过以下各项中的一个或多个来表明：每个种植区的植株数、单株的花序数、每个花序的小穗数、每个花序的花数、种子灌浆速率的增加、千粒重（1000粒的重量）的增加、每粒种子含油量的增加、每粒种子淀粉含量的增加及其他。产量的增加还可以导致修饰结构（modifiedarchitecture），或者可以因为修饰结构而发生。

类似地，大豆产量的提高可以通过以下各项中的一个或多个来表明：每个种植区的植株数、单株角果数、每角粒数、种子灌浆速率的增加、千粒重（1000粒的重量）的增加、降低裂角、单粒含油量的增加、单粒蛋白含量的增加及其他。产量的增加还可以导致修饰结构，或者可以因为修饰结构而发生。

油菜产量的提高可以通过以下各项中的一个或多个的增加来表明：每个种植区的植株数、单株角果数、每角粒数、种子灌浆速率的增加、千粒重（1000粒的重量）的增加、降低裂角、单粒含油量的增加及其他。产量的增加还可以导致修饰结构，或者可以因为修饰结构而发生。

棉花产量的提高可以通过以下各项中的一个或多个的增加来表明：每个种植区的植株数、单株铃数、每铃籽粒数、种子灌浆速率的增加、千粒重（1000粒的重量）的增加、单粒含油量的增加改善的纤维长度、纤维强度及其他。产量的增加还可以导致修饰结构，或者可以因为修饰结构而发生。

含油量-植物的含油量可以通过从植物的种子或营养部分提取油而测定。简而言之，可以通过在特殊溶剂（例如，己烷或石油醚）存在下研磨植物组织并在连续萃取器中萃取油而从植物（例如，种子）中除去脂（油）。可以利用各种已知方法进行间接的含油量分析，如核磁共振（NMR）光谱学，它测量在液态样品中被氢原子所吸收的共振能[参见例如，ConwayTF.和Earle FR.,1963,Journal of the American Oil Chemists'Society;Springer Berlin/Heidelberg,ISSN:0003-021X(Print)1558-9331(Online)]；近红外（NI）光谱学，它利用通过样品对近红外能（1100-2500nm）的吸收；以及在WO/2001/023884中所描述的方法，它是基于用溶剂萃取油，在气流中蒸发溶剂，形成油微粒，并将光引入气流和油微粒中形成可检测的反射光。

从而，本发明具有高农业价值，用于提高商业上期望的农作物的产量（例如，营养器官（如白杨木材）的生物量、或生殖器官如种子数或种子生物量）。

可以将上文中描述的任何转基因植物或其部分加工以生产饲料、膳食、蛋白或油制剂，如用于反刍动物。

在上文中描述的表现出提高的含油量的转基因植物可以用于生产植物油（通过从植物中萃取油）。

根据本发明的方法生产的植物油（包括种子油和/或营养部分的油）可以与各种其他成份结合。包含在产物中的特定成份是更加预期应用而决定的。示例性产品包括动物饲料、用于化学修饰的原材料、可生物降解的塑料、混和食品、食用油、生物燃料、烹饪用油、滑润剂、生物柴油、快餐食品、化妆品、以及发酵工艺原材料。

混合至植物油中的示例性产品包括动物饲料、人类食品如挤压的快餐食品、面包、作为食物粘合剂、水产业饲料、可发酵的混合物、食品增补剂、运动饮料、营养食物棒、多种维生素补充剂、低热量饮料（diet drink）、以及谷物食品。

根据本发明的一些实施方式，油包括种子油。

根据本发明的一些实施方式，油包括营养部分的油（vegetative portionoil）。

如在本文中使用的术语“约”是指±10%.

术语“包含”、“含有”、“包括”、“包括了”、“具有”以及它们的变型的意思是“包括但不限于”。

术语“由...组成”的意思是“包括且限于”。

术语“基本由...组成”的意思是组合物、方法或结构可以包括另外的成份、步骤和/或部分，但是只有在该另外的成份、步骤和/或部分不会实质上改变所请求保护的组合物、方法或结构的基本的和新颖的特征时。

如在本文中使用的，单数形式的“一个（a）”、“一种（an）”和“该（the）”包括其复数形式（reference），除非上下文清楚地指示了其他情况。例如，术语“一个（种）化合物”或“至少一个（种）化合物”可以包括多个（种）化合物（包括其混合物）。

贯穿本申请，本发明的各种实施方式可以在范围形式（range format）内给出。应当理解的是在范围形式中的描述只是为了方便和简要，不应当解释为对本发明范围的固定的限制。因此，范围的描述应当被认为已经特别地公开了所有可能的子范围以及在该范围之内单独的数值。例如，一个范围的描述，如从1至6应当认为是已经具体公开了子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等，以及在该范围内单独的数字，例如，1、2、3、4、5、和6。这都适用，与范围的宽度无关。

无论何时在本文中指出了数值范围，这意味着该数值范围包括在所指出的范围内的任何所引用的数值（小数或整数）。短语“范围（ranging）/范围（ranges）在”第一指示数值和第二指示数值“之间（between）”，以及“范围（ranging）/范围（ranges）从”第一指示数值“至（to）”第二指示数值在本文中可互换使用，是指包括第一和第二指示数值以及在其之间的所有小数和整数数值。

如在本文中使用的术语“方法”是指用于完成特定任务的方式、方法（装置，means）、技术和过程，包括但不限于，已知的或者化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者容易从已知的方式、方法（装置，means）、技术和过程开发的方式、方法（装置，means）、技术和过程。

如在本文中使用的术语“处理（治疗）”包括消除、基本抑制、减缓或逆转一种病症的进展、基本改善一种病症的临床或美学症状或基本防止一种病症的临床或美学症状出现。

应当领会，在个别的实施方式的内容中描述的本发明的某些特征，是为了清楚，它们还可以在一个单独的实施方式中以组合的方式提供。相反，在一个单独的实施方式的内容中描述的本发明的各种特征，是为了简要，它们也可以分开提供或以任何适当的子组合提供或适当地提供至本发明所描述的任何其他实施方式中。不认为在各个实施方式的内容中描述的某些特征是那些实施方式的基本（必需）特征，除非在没有那些元素的情况下，该实施方式不起作用。

如在上文描述的以及在下面权利要求部分中所请求的本发明的各实施方式和各方面，在以下实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考下列实施例，连同上述说明一起以非限制性的方式说明本发明的一些实施方式。

通常，本文中使用的命名法和在本发明中利用的实验方法包括分子技术、生物化学技术、微生物学技术和重组DNA技术。这类技术已在文献中充分阐释。参见，例如，“Molecular Cloning:A laboratoryManual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”Volumes I-III Ausubel，R.M.,ed.(1994)；Ausubel等，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，ScientificAmerican Books，New York；Birren等(eds)“Genome Analysis:ALaboratory Manual Series”，Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如在U.S.Pat.No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中给出的方法学；“Cell Biology:A LaboratoryHandbook”，卷I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Current Protocols inImmunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等(eds)，“Basicand Clinical Immunology”（第8版），Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),“Selected Methods in CellularImmunology”，W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可利用的免疫测定在专利和科学文献中广泛地描述，参见，例如，U.S.Pat.No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.，和Higgins S.J.,eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames,B.D.，和Higgins S.J.，Eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney,R.I.，ed.(1986)；“ImmobilizedCells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to MolecularCloning”Perbal,B.，(1984)和“Methods in Enzymology”Vol.1-317,AcademicPress；“PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”，AcademicPress，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for ProteinPurification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；其中的所有通过引用结合，就像完全在本文中给出一样。其他一般参考贯穿该文献提供。认为在其中的方法是本领域熟知的，为了方便阅读而提供。在其中包含的全部信息通过引用结合于此。

一般材料和实验方法

构建体的制备–利用PCR使用特异性引物从拟南芥基因组DNA中获取金属硫蛋白启动子，该特异性引物用于在先前基因的3'UTR和金属硫蛋白基因的5’UTR之间的序列，产生1169bp长的片段：5'-GACGATGTTTCTGTGATTGTGATTTTC-3'（SEQ ID NO:669）和5'-ATTTTTCTCGAGAAAATTCAAATTGAAG-3'（SEQ ID NO:670）。利用正常条件将启动子克隆至pGEM质粒（promega）中。然后切除启动子并使用SmaI+PstI将其插入pBluescript质粒（Stratagene）中，然后利用BamHI+Acc65插入包含NOS3'终止子的pJHA212K中[Yoo,S.Y.，Bomblies,K.，Yoo,S.K.，Yang,J.W.，Choi,M.S.，Lee,J.S.，Weigel,D.，Ahn,J,H.(2005)。“The35S promoter used in a selectable marker gene of aplant transformation vector affects the expression of the transgene.”Planta221:523-530]。利用PCR，使用高保真酶-SAWADY Pow DNA聚合酶完成了从pCambia SARK-IPT（Rivero等，2007）分离IPT基因以及增加BglII位点，使用特异性引物将限制性位点加入到5'-gaagatctttctctaatataaaaatcag-3'（SEQID NO:671）和5'-TCTGATCTGAACATGTTATCCAG-3'（SEQ ID NO:672）上。将产物用BglII切下，在将其切割之后利用BglII+SmaI插入到pJHA212K-MT启动子-NOS3'质粒的启动子和终止子之间。利用电穿孔将双元质粒转化进入根癌土壤杆菌中。

转化至拟南芥植物中-根癌土壤杆菌的单菌落在包含适合质粒抗性的抗生素的5ml LB中在30°C下生长过两夜。向包含相同抗生素的0.5升的LB中加入1ml起子（starter），在30°C下生长过夜直至O.D.测量显示O.D₆₀₀>2。将培养基分成两个250ml管，在6000rpm的速度下在Sorvall离心机中将这两个管离心20分钟。用500ml转化培养基将细菌颗粒再悬浮。向500ml转化缓冲液中加入200μl silwet（喜威）（产品目录号L-77，Setre化学公司，孟菲斯，TN，美国）和44μl苄氨基嘌呤（来自0.5mM贮液）。

使用在最初发育阶段的带花的4-6周龄的拟南芥植物用于转化。将土壤杆菌再悬浮液放置在玻璃罐中，将拟南芥植物的花放置在培养基中。将每个植物转化5分钟，然后水平放置在盘子中。用塑料袋覆盖盘子以保持湿度，并将盘子置于生长室中。第二天，除去塑料袋并将植物垂直放置。在成熟后收集种子。

转化入烟草植株-根癌土壤杆菌的单菌落在30°C下在包含适用于质粒抗性的抗生素的5ml LB中生长过两夜。在没有抗生素的情况下将来自根癌土壤杆菌的10ml、20ml和50ml培养物转移至50ml YEB（酵母提取物肉汤；由1.5g酵母提取物、4g细菌蛋白胨、20g蔗糖、0.5gMgSO₄在水中形成1000ml溶液而组成）中并在30°C下在250ml锥形瓶（Erlenmeyer）中生长过夜。将来自在1/2MS（Murashige和skoog）上生长的4-8周大的烟草植株的叶片切割成1平方厘米的片；用解剖刀在它们的底部开槽，并在25°C下将它们上部朝下放置在PET培养基[由以下各项组成：MSO（4.3g MS盐30g蔗糖、0.5MES盐、10g琼脂）、0.5mg/l2-4-二氯苯氧基乙酸、0.25mg/l的分激动素]中。第二天，将最终浓度375μM的乙酰丁香酮加入到达到O.D.600=0.4-0.8的根癌土壤杆菌培养物中，并倾倒至皮氏培养皿中。将叶片小片在根癌土壤杆菌培养物中浸渍1分钟，在滤纸上吸干，送回到PET培养基中48小时。

再将叶片小片在25°C下转移至包含适当的抗生素的RS培养基（由以下各项组成：MSO、2mg/l玉米素、0.1mg/l IAA、100mg/l Kan、200mg/l carb）中。每两周将小片转移至新的RS培养基中直至形成愈伤组织。将具有小芽的大的愈伤组织转移至LZ培养基（由以下各项组成：MSO、0.2mg/l玉米素、0.1mg/l IAA、100mg/l Kan、200mg/l carb）中。每两周对幼苗进行继代培养。将具有3-5个叶片的较大的幼苗转移至包含抗生素的选择性根培养基（培养基由MSO培养基+0.02mg/l IBA100mg/l KAN200mg/l Carb)组成）中。在根系形成之后，将植物转移至水渍的泥煤颗粒（peat pellet）中（Jiffy7，Kappa Forenade Well）。

转化入番茄植株-种子萌芽之后的10-14天，将番茄籽苗的尖端切除，将子叶切下放置在D1培养基[D1培养基组成，用于1升配制，pH5.8：4.3g MS盐、30g蔗糖、5ml B5维生素、6g琼脂、1ml玉米素（1mg/ml）、100μl IAA（1mg/ml）、500mg羧苄青霉素]中（没有抗生素），在26°C下在黑暗中温育24-48小时。为了转化，将包含构建体的土壤杆菌培养物倾倒在子叶上并在26°C下在16小时光照/8小时黑暗下温育两天，随后，将子叶转移至D1培养基[D1培养基组成，用于1升配制，pH5.8：4.3g MS盐、30g蔗糖、5ml B5维生素、6g琼脂、1ml玉米素（1mg/ml）、100μl IAA（1mg/ml）、500mg羧苄青霉素]中温育3周。然后将子叶转移至包含D2培养基的培养皿中用于芽器官形成，在另外3周之后，将形成的愈伤组织转移至新的含D2的皮氏培养皿中。当出现具有真的分生组织的芽时，将它们转移至RO-D[生根培养基；pH5.8，1升的RO-D培养基组成：4.3g MS盐、15g蔗糖、5ml B5维生素、6g琼脂、20μl IBA(1mg/ml)、500mg羧苄青霉素和100mg卡那霉素]中，在根系形成之后，将植物转移至水渍的泥煤颗粒（Jiffy7，Kappa ForenadeWell）中。

转基因植物和野生型植物的生长条件-野生型（WT）和M-IPT转基因的烟草植株（转化的转基因植物以表达包括融合至IPT编码序列的金属硫蛋白启动子的核酸构建体）在有限的水量下生长：400ml、200ml和100ml。在这个实验中，400ml水处理是对于植物生长而言最佳的水量。从而，200ml和100ml的浇灌处理是最佳浇灌条件和模拟干旱的50%和25%（分别）。每两周从植物中取出样品并提取RNA。

实施例1

在金属硫蛋白启动子下表达IPT的转基因植物表现出对干旱胁迫增加的耐受性和增加的生物量

在大规模基因识别研究中，发现在拟南芥植物枯萎期间金属硫蛋白（涉及植物对金属的抗性的蛋白）的表达水平增加。（Gepstein,S.，Sabehi,G.，Carp，M.J.，Hajouj,T.，Falah,M.，Nesher,O.，Yariv,I.，Dor,C.和Bassani,M.(2003)。“Large scale identification of leaf senescence associatedgenes.”The plant journal36:629-642）。

为了形成在胁迫期间具有自动调控的细胞分裂素水平的植物，将MT2a型（At3g09390）的金属硫蛋白启动子融合至IPT基因并转化至烟草植株。

包含融合至IPT编码序列上游的金属硫蛋白启动子以及随后的NOS终止子的嵌合构建体，如在“General Materials and Experimental Methods”和在图1和图2中所描述的来制备。

实验结果

在干旱状态下在转基因植物中M-IPT表达水平的上调-在不同水分状况下在转基因植物中检测IPT的表达，发现在有限量水（100ml和200ml）下生长的植物中较高（图3）。随着植物变老，表达似乎增加，但在经受严重干旱胁迫的植物中仍然是最高的。这些结果表明在干旱胁迫下IPT表达水平上调。此外，如在图5A-图5C中显示的，胁迫诱导的植物的叶绿素含量高于在最佳灌溉下生长的植物，这表明细胞分裂素（CK）在这些植物延迟枯萎中的作用。

与野生型植物相比，M-IPT转基因植物表现出由于干旱胁迫而使每株植物叶片数目的减少显著降低-在生长两个月之后，对新鲜叶片的生物量进行分析、称重并测量形态学参数，包括例如植株高和叶片数。干旱对于高度的影响在WT和M-IPT转基因植物中是相同的。50%浇灌处理导致高度减少20-25%，而25%浇灌处理导致植物高度减少约55%（图4A）。尽管植物高度相似，在50%和25%处理的WT植物中叶片数目分别降低了7%和20%，与转基因植物相反，它们没有受到50%处理的影响，而在25%浇灌处理中只是轻微减少6-12%（图4B）。

与野生型植物相比，M-IPT转基因植物表现出由于干旱胁迫而使生物量减少显著降低-与叶片数目减少一致，在干旱条件下WT植物的生物量（通过鲜重表示）显著降低。在50%供水的处理中，生物量降低20%，在25%供水中，生物量降低51%。出乎意料地，甚至是在减少50%的水的情况下，转基因植物的生物量没有降低（图4C）。此外，在该处理中鲜重稍微提高2-8%（图4C）。另一方面，25%浇灌处理的鲜重受到严重影响，在这些植物中观察到45-49%的下降（分别是行pMIPT7、8）（图4C）。这些结果进一步表明了当在相同条件下生长时，与没有通过本发明的一些实施方式的生物分子转化的对照植物（野生型植物）相比，转基因植物中增强的IPT水平赋予了对干旱的高抗性。

与野生型植物相比，在干旱条件下M-IPT转基因植物维持较高的叶绿素水平-如在图5A-图5C中显示的，在4个月后在所有三种水分状况下，如通过叶绿素含量减少所表现的，野生型植物开始枯萎（衰老），转基因植物保持较高的叶绿素水平，特别是在用有限量水浇灌的植物中。

M-IPT转基因植物的根尺寸不受水分状况的影响-将植物的根从土壤中取出，尽可能完全清除残留的土壤。因为重量仍然受到剩余土壤的影响所以没有检测重量，但是根尺寸的差别是可以清楚看到的。然而在WT织物中，在根尺寸中存在清晰的梯度，随着浇灌量的增加，根尺寸分别增加，在转基因植物中根尺寸与浇灌量无关，而在200ml处理中是最大的，其中还发现总生物量是最高的（图6A-6C）。

与在100%水分状况下种子产量为最高的WT植物相比，M-IPT转基因植物的种子产量在50%水分状况下是最高的–留下茎和花再生长另外一个月（在收集生物量之后）以使种子成熟并干透。将干燥的种子称重并在不同的水分状况下比较（图7）。WT植物的最高产量在400ml处理下观察到，而在限制供水条件下（分别为200ml和100ml处理）分别减少15%和60%。转基因植物的最高产量在200ml处理中发现，相对于400ml处理增加20%。尽管事实是在转基因植物和WT植物两者中100ml处理的生物量都减少了50%，100ml处理的产量也仅降低了30-40%（相对于WT植物中的60%）。

与野生型植物相比，M-IPT转基因植物从长期干旱中恢复良好-进一步检测在长期干旱下pM-IPT烟草的干旱耐受性。对成熟的WT和pM-IPT植物的浇灌停止两周。这一周期之后，对植物再浇灌1周。与仅恢复30%的WT植物相反，pM-IPT植物从该胁迫中恢复良好（图8A-图8D）。再浇灌一周后采集植物的叶片生物量，称重并与在最佳浇灌条件下生长的植物相比。处于干旱胁迫下的WT植物的生物量（通过鲜重表示）低于在最佳水分状况下生长的植物的生物量～60%（图9）。另一方面在pM-IPT植物中，在干旱胁迫下的植物中生物量只降低10%-30%（分别为行8和7）（图9）。

实施例2

在金属硫蛋白启动子下表达IPT的转基因植物表现出对热胁迫、冷胁迫、高盐度和渗透胁迫提高的耐受性

实验结果

为了测试M-IPT转基因对另外的非生物胁迫的影响，使三周大的烟草植株经受下列胁迫处理：高盐度、渗透胁迫、热和低温。

与野生型植物相比，M-IPT转基因植物表现出对热胁迫提高的耐受性和抗性-通过使植物在37°C的温度下生长1周对植物进行热胁迫处理，随后将植物转移至室温条件（24°C）下来恢复。植物生长严重地受到该胁迫的影响，在一周热处理之后只有40%的植物幸存。在剩余植物的恢复期间，植物之间存在显著的差别：尽管WT植物没有死亡但仍然较小，它们的生长被大大地减弱。然而，转基因植物的恢复较快，并且比WT植物生长的更好（图10A-图10D）。

与野生型植物相比，M-IPT转基因植物表现出对冷胁迫提高的耐受性和抗性-通过使植物在4°C下生长1周使植物经受低温，然后转移至室温条件（24°C）下来恢复。在4°C阶段期间植物的生长延迟，但是当转移回到24°C时，所有植物完全恢复，并且与在正常条件下生长的植物相比它们的尺寸只是稍微延缓。尽管在一周和两周的恢复之后，M-IPT和WT植物的尺寸类似，但是在三周的恢复之后M-IPT植物以更快的速率生长，尤其是在从冷处理恢复4周之后可以看到显著差异（图11A-图11D）。

与野生型植物相比，M-IPT转基因植物表现出对盐胁迫提高的耐受性和抗性-通过用300mM的NaCl溶液浇灌植物3周使植物经受高盐度，随后用自来水浇灌植物来恢复。在盐处理下，尽管转基因植物比WT植物生长得更好，但是所有植物的生长都降低了。M-IPT植物从盐胁迫中恢复的极快，并且提高了转基因植物的发育和生物量。相反，WT生长非常慢，并似乎没有恢复好（图12A-图12D）。

与野生型植物相比，M-IPT转基因植物表现出对渗透胁迫提高的耐受性和抗性-用20%的PEG6000溶液浇灌植物3周，然后用自来水浇灌来恢复。PEG处理对所有植物都极剧烈。WT植物在这3周期间根本不生长，而转基因植物只是稍微生长并表现出极度的胁迫病状。在恢复之后WT植物中没有能够存活的。另一方面，M-IPT植物存活下来，但是在正常浇灌两周之后并未显示出完全恢复（图13A-图13C）。

在整个胁迫和恢复中，在四个非生物胁迫检测中植物的行为不同。尽管有这些差别，在恢复之后，所有四个胁迫的植物在转基因的M-IPT植物和WT植物的植物生长之间显示出显著的差异（图14A-图14C），这暗示M-IPT植物表现出对不同胁迫状态增强的耐受性。

分析和讨论

如通常在自然界中发现的，非生物胁迫的组合影响植物，并且多种胁迫同时作用（Mittler,2006）。在沙漠地区，植物经常遭遇伴随盐胁迫、日间高温和夜间低温的干旱胁迫。因此，对多种非生物胁迫表现出抗性的植物是有益的。

本文中描述的M-IPT转基因植物对许多不同胁迫状态表现出增强的耐受性和抗性，因此对多样的农业利用是有用的。

实施例3

在胁迫相关启动子下过表达IPT的转基因植物表现出提高的产量和叶绿素含量

如在图16中显示的，当在最佳条件下生长时，M-IPT7和M-IPT8转基因植物具有比WT植物高20%的产量，而在干旱时具有高50%的产量。当在最佳条件下生长时转基因植物还延缓了枯萎，因此在成熟的植物中叶绿素含量较高。

实施例4

在各种胁迫下上调的基因启动子区域中观察到的核心序列

本发明人已经识别了在各种胁迫（如干旱、寒冷和高盐胁迫）下上调的存在于基因的启动子中的胁迫相关调控序列的核心序列。

ABRE（ABA应答元件）-PyACGTG(T/G)C（SEQ ID NO:2）。实例包括，但不限于TACGTGTC（SEQ ID NO:3）、CACGTGGC（SEQ ID NO:4）。

DRE（脱水应答元件）–TACCGACAT（SEQ ID NO:5）。

CCGAC核心基序（Core Moti）f–CCGAC（SEQ ID NO:6）。

以下表1提供保守顺式元件的非限制性实例，其存在于胁迫相关启动子中，在以下表1中提供。

表1

在渗透胁迫和冷胁迫应答基因表达中的顺式作用调控元件

表1.

实施例5

胁迫相关启动子

利用已知的生物信息学工具进行胁迫相关启动子序列的识别。利用下列参考文献找到已知在各种胁迫下表达的基因：Sottosanto等(2004),DNA array analyses of Arabidopsis thaliana lacking a vacuolar Na+/H+antiporter:impact of AtNHX1on gene expression,Plant Journal40,752-771)；Kreps等(2002),Transcriptome Changes for Arabidopsis in Response to Salt,Osmotic,and Cold Stress.Plant Physiol,December2002,Vol.130,pp.2129-2141；Rossel等(2002)，Global Changes in Gene Expression inResponse to High Light in Arabidopsis,Plant Physiol,November2002,Vol.130,pp.1109-1120；Vogel等(2005),Roles of the CBF2and ZAT12transcription factors in configuring the low temperature transcriptome ofArabidopsis,Plant J.2005Jan;41(2):195-211；Matsui等(2008),ArabidopsisTranscriptome Analysis under Drought,Cold,High-Salinity and ABATreatment Conditions using a Tiling Array,Plant and Cell Physiology200849(8):1135-1149；Seki等(2001),Monitoring the Expression Pattern of1300Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-LengthcDNA Microarray,Plant Cell.2001Jan;13(1):61-72；Seki等(2002),Monitoring the expression profiles of7000Arabidopsis genes under drought,cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray,Plant J.2002Aug;31(3):279-92；以及Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki(2005),Organization of cis-acting regulatory elements in osmotic-andcold-stress-responsive promoters,Trends in Plant Science10,88-94。

如所描述的利用包括两个数据库的AGRIS（拟南芥基因调控信息服务器（Arabidopsis Gene Regulatory Information Server））、AtTFDB（拟南芥转录因子数据库）和AtcisDB（拟南芥顺式调控数据库）识别这些基因的调控序列并在Davuluri RV.,Sun H.等，2003[AGRIS:拟南芥基因调控信息服务器,拟南芥顺式调控元件和转录因子的信息资源]中描述，其全部内容通过引用结合于此。AGRIS数据库包括位于注释编码序列的翻译起始位点（ATG）的上游的序列。上游序列包括3000或更少的核苷酸。简单地，fasta文件'TAIR9_upstream_3000_translation_start_20090619'从Arabidopsis Information Resource（TAIR）数据库[Hypertext TransferProtocol://World Wide Web(dot)arabidopsis(dot)org]下载，并根据上面所产生的基因列表利用R环境（R environment）（“R Development Core Team(2010).R：用于统计计算的语言和环境。R Foundation for StatisticalComputing,Vienna,Austria.ISBN3-900051-07-0,Hypertext TransferProtocol://World Wide Web(dot)R-project(dot)org”）提取相关的序列。

以下表2提供拟南芥基因的非限制性列表，其在各种胁迫（盐胁迫、冷胁迫和干旱胁迫）期间与指示胁迫相关基因的启动子序列一起是上调的。

表2

盐、冷和干旱相关的启动子

表2.在指示胁迫状态下是上调的基因的启动子序列的拟南芥登记号。“At”-拟南芥，随后是染色体数，“g”用于基因在指示染色体上的定位。启动子的序列包括指示基因的5'-UTR的上游的基因组序列3000bp。

以下表3提供拟南芥的胁迫相关基因的非限制性列表，其在各种胁迫（光胁迫和渗透胁迫）期间与指示胁迫相关基因的启动子序列一起是上调的。

表3

光胁迫和渗透胁迫相关启动子

表3.在指示胁迫状态下是上调的基因的启动子序列的拟南芥登记号。“At”-拟南芥，随后是染色体数，“g”用于基因在指示染色体上的定位。启动子的序列包括指示基因的5'-UTR的上游的基因组序列3000bp。

以下表4提供拟南芥的胁迫相关基因的非限制性列表，其与ABA激素（其在胁迫下是上调的）的表达相关，与指示胁迫相关基因的启动子序列一起。

表4

ABA相关启动子

表4.与ABA表达相关的基因的启动子序列的拟南芥登记号（即，当ABA水平增加时上调）；“AT”-拟南芥，后面是染色体数，“g”用于基因在指示染色体上的定位。启动子的序列包括指示基因的5'-UTR的上游的基因组序列3000bp。

实施例6

在金属硫蛋白启动子下表达IPT的转基因植物对盐胁迫表现出提高的耐受性

实验方法：

盐胁迫的诱导-在生长室中，在168（光暗）下，在包含150mMNaCl的培养皿中使两行M-IPT、一行SARK-IPT和野生型的一周大的籽苗生长三周。

实验结果

M-IPT植物对盐胁迫表现出提高的耐受性-为了测试M-IPT转基因对盐胁迫的影响，使一周大的烟草植株在存在MSO生长培养基（有或没有盐胁迫（150mM的NaCl））的培养皿中生长3周。

如在图17A-图17D、图18A-图18D和图19A-图19D中显示的，虽然大多数野生型植物在盐胁迫下没有存活（即，没有生长）并且那些表现出相对较小的叶片（与在正常情况下生长的相同的WT植物相比），M-IPT转基因植物对盐胁迫表现出提高的耐受性，如通过较高的植物存活率（与在相同的盐胁迫生长条件下的WT植物相比）显示的，具有相当的叶片尺寸（例如，如在图18C-图18D中显示的）。这些结果最终表明M-IPT构建体赋予了对盐胁迫提高的耐受性。

与野生型植物相比，SARK-IPT植物没有对盐胁迫表现出耐受性-作为对照实验，使用SARK-IPT构建体转化烟草植株（如在WO2006/102559中描述的）以及野生型和转基因植物经受盐胁迫（150mM的NaCl）。如在图20A-图20D中显示的，在盐胁迫状态下大多数野生型植物（图20B）和SARK-IPT转基因植物（图20D）不能生长，而在盐胁迫下存活的那些表现出严重的生长停滞，例如，与在正常条件下生长的相同植物的叶片相比具有显著变小的叶片[图20A（WT）和图20C（SARK-IPT）]。这些结果最终表明SARK启动子不是胁迫启动子，因为它不能在胁迫状态（如盐胁迫）下调控IPT的表达。

虽然本发明已经结合其具体实施方式进行描述，但是许多的替代、修改和变体对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，目的在于包括属于所附权利要求的精神和宽范围内的所有这类替代、修改和变体。

在该说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用至说明书将其全部结合于此，其程度就像是特别地并且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合于此。此外，本申请中任何参考文献的引用或鉴别将不会解释为承认该参考文献作为本发明的现有技术是可行的。在使用部分标题的程度上，不应当将它们解释为必要的限制。