蔓茎堇菜在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用

摘要

本发明涉及蔓茎堇菜在制药中的新用途，具体涉及蔓茎堇菜在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用。本发明所述的蔓茎堇菜提取物对HepG2.2.15细胞株分泌HBeAg和HBsAg具有明显的抑制作用，可用于制备预防及治疗病毒性肝炎的药物。本发明所述的抗乙型肝炎病毒的药物是由蔓茎堇菜提取物与常规用量的医学上可接受的辅料制成的临床上可接受的固体或液体口服制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及含来自植物的未确定结构的药物制剂，具体涉及堇菜科堇菜属植物在制药中的新用途。 

背景技术

蔓茎堇菜（Viola diffusa Ging）为堇菜科（Violaceae）堇菜属(Viola)一年生或多年生草本植物，又名七星莲、匍伏堇等，分布于长江以南各省、区及陕西、甘肃，福建各地常见。蔓茎堇菜多生于田野路边，旷地或山坡路旁，也见于疏林地湿润处。全草入药，有清热解毒，散瘀消肿，去腐生肌，清肺止咳之效，鲜品捣烂外敷或干品研粉调湿外敷（《福建植物志》（第四卷，福建科学技术出版社，1990年出版）。蔓茎堇菜微苦，凉；具有清热解毒之功效；主治肝炎、胸膜炎、结合膜炎、毒蛇咬伤、疔、痈（《福建药物志》修订本第二卷，福建科学技术出版社，1994年出版）。 

现代药理研究表明，蔓茎堇菜具有抗菌[朱天倬,盛忠梅,鲁清桃,等.黄瓜香体外抗菌试验.中国兽医杂志,1986(10):39-41.79]、抗炎[李春艳,钟飞,李先辉,等.黄瓜香在急性炎症动物模型中抗炎效应的研究.时珍国医国药,2010(04):844-845]、抗氧化[李先辉,李春艳,吕江明,等.黄瓜香水提物体外抗氧化活性实验.吉首大学学报（自然科学版）,2006,27(5):95-97]、调控免疫[李春艳,李先辉,吕江明,等.黄瓜香对小鼠免疫功能调节的实验研究.时珍国医国药,2008(01):40-41]、利胆保肝[李先辉,李春艳.黄瓜香提取物对大鼠肝纤维化拮抗作用.中国公共卫生,2010(05):546-547；翁榕安,李先辉,李春艳.黄瓜香提取物对实验性肝纤维化大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及生长转化因子β-1表达的影响.食品科技,2010(08):271-273；张军,李先辉.黄瓜香提取物对大鼠酒精性肝损伤氧化应激的实验研究.中国中西医结合消化杂志,2010(04):247-250；李春艳,李先辉,朱菲莹,等.黄瓜香水提物对大鼠亚急性肝损伤的保护作用.湖南师范大学学报(医学版),2011(02):89-91]、抑制家兔离体小肠运动[吕江明,李春艳,伍昭龙,等.黄瓜香水提物对兔离体小肠运动的影响.中国民族民间医药杂志,2007(05):250-252]、抑制肿瘤细胞增殖以及升高白细胞[李先辉,胡昔奇,龙颖,等.黄瓜香含药血清对K562白血病细胞增殖及凋亡的影响.中国民族民间医药,2009(15):27-29111；彭源贵,赵振平,王小树.蔓茎堇菜（地百草）升高白细胞的有效成分.中草药,1990,9:426.]、改善荷瘤小鼠生存质量[任继秋,刘振平,张涛,等.黄瓜香等对调整腹水瘤小鼠肠道菌群并延长荷瘤生存时间的影响.中国微生态学杂志,2009(09):796-797；任继秋,吴庆田,王跃生,等.黄瓜香等中药调整腹水瘤小鼠肠道菌群减轻化疗副作用的研究.中国微生态 学杂志,2010(03):214-216；梁立春,王跃新,崔国利,等.黄瓜香水、醇提取液对肠道菌群的调整作用的比较.中国微生态学杂志,2010(11):998-1000]等作用。 

还有报道，堇菜根泡酒可治疗骨质增生（CN200910015207.5），含有蔓茎堇菜的组方可以治疗宫颈糜烂（CN200810143687.9）、毛囊炎（CN200710159965.5）、阑尾炎（CN200710159980.X）、口疮（CN200710301046.7）等，并且蔓茎堇菜对皮肤具有保湿（JP2000208284）和美白（JP2000208284）等作用。 

乙型肝炎病毒HBV（Hepatitis B Virus,HBV）是引起急、慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病的主要病因。慢性HBV感染最终可发展为肝硬化、肝细胞癌。我国约有近2亿的HBV携带者，每年约有25万人死于与乙型肝炎有关的慢性肝病（肝癌与肝硬化），且发病率呈现持续上升的趋势。目前HBV感染的治疗多以干扰素及核苷类药物为主，干扰素能够抑制病毒复制，但难以清除病毒，对于重症肝炎等肝细胞很少的患者不推荐使用；核苷类药物可抑制HBV-DNA逆转录酶活性，但易对药物产生耐药性，停药后易产生“反跳”现象，治疗效果均很有限。因此，提供蔓茎堇菜抗乙型肝炎病毒的用途具有重要意义。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供蔓茎堇菜在制药中的新用途。 

上述新用途具体是，蔓茎堇菜在制备治疗病毒性肝炎药物的中的应用。 

上述应用中，所述的药物是蔓茎堇菜提取物与常规用量的医学上可接受的辅料制成的临床上可接受的固体或液体口服制剂。 

上述应用中，所述的固体口服制剂具体是临床上可接受的颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、片剂。 

上述应用中，所述的液体口服制剂具体是临床上可接受的口服液。 

上述应用中，所述的蔓茎堇菜提取物是以蔓茎堇菜为原料的水提物或醇提物，所述的水提物和醇提物可采用本领域常用的方法提取得到。本发明人推荐的方法如下所述： 

本发明所述提取物是用水或乙醇为溶剂采用常规的回流提取得到，其中，本发明人推荐的提取方法分别如下所述。 

1.取蔓茎堇菜，加12～5倍水煎煮两次，每一次煎煮1～2小时；合并提取液，浓缩至比重为1.05～1.1的稠浸膏，干燥，得蔓茎堇菜提取物。 

2、取蔓茎堇菜，加12～5倍体积浓度为10％～95%的乙醇加热至80～95℃回流提取两次，每一次提取1～2小时；合并提取液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，得蔓茎堇菜提取物。 

本发明所述的固体口服制剂的制备方法为药典上所规定的常规制备方法，即将蔓茎堇菜提取物与固体口服制剂常用的辅料按临床上可接受配比混合制得。 

本发明所述的液体口服制剂的制备方法为药典上所规定的常规制备方法，即将蔓茎堇菜提取物加水稀释后与液体口服制剂常用的辅料按临床上可接受配比混合，搅匀，滤过，灌装，灭菌，即得。 

本发明所述的固体口服制剂或液体口服制剂具有抗乙型肝炎病毒的作用，可用于制备治疗病毒性肝炎的药物。 

以下通过实验来进一步说明本发明的药物的安全性和有益效果： 

采用乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌细胞HepG2.2.15，研究化合物对HepG2.2.15细胞培养液上清中HBV表面抗原(HBsAg)、HBV核心抗原(HBeAg)分泌量的影响，考察本发明所述提取物的抗HBV作用，具体实验方法如下所述。 

1.实验方法 

用0.25%胰蛋白酶和2‰EDTA1:1混合消化单层培养细胞，停止消化后，加入PBS液，用弯头吸管反复吹打分散细胞，于1000rpm离心3min。弃去上清，加入5mL DMEM高糖培养液重悬，吹打分散细胞后配成单个细胞悬液，以3×10⁵个/mL接种于96孔培养板中，每孔体积100μL。将培养板放入37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的含药培养液，共做3个浓度，设正常细胞培养液做空白对照，每组设4个复孔，药物对照组（无细胞，仅加入不同浓度的含药培养液）设1个复孔。在细胞生长高峰期停止培养，取细胞用MTT法测细胞存活率，取上清液用ELISA法测定HBeAg、HBsAg两抗的分泌情况。 

MTT：吸去上清液，每孔加5g/L MTT20μL，37℃孵育4h，吸弃上清液，每孔加DMSO150μL，将培养板置于震荡器上震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上测各孔OD值，测定波长570nm，记录结果，根据统计学方法计算各提取物的半数毒性浓度（TC₅₀）。 

半数毒性浓度（TC₅₀）=Anti log[logB+(50－B)的抑制百分率/(A－B)的抑制百分率×C](A≧抑制50%药物浓度，B≦抑制50%药物浓度，C=log稀释倍数)，参照Reed-Muench法。 

ELISA（固相放射免疫法）：取细胞上清液，采用酶联免疫法，用乙肝表面抗原及e抗原检测试剂盒按说明书操作，在酶标仪上以630nm作为参考波长、490nm为检测波长测定各孔OD值。根据统计学方法计算各提取物对抗原的半数抑制浓度（IC₅₀）。 

药物对抗原的半数抑制浓度(IC₅₀)=Anti log[logB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率×C](A≧抑制50％药物浓度，B≦抑制50％药物浓度，C=log稀释倍数)，参照Reed-Muench 法。 

对HBeAg或HBsAg的分泌有明显抑制作用，且抑制率与药物浓度呈典型量效关系的提取物，其体外抗HBV作用治疗指数（TI）评价。 

治疗指数(TI)=TC₅₀/IC₅₀，其中TI≧2为有效低毒；1＜TI＜2为低效有毒；TI≦1为毒性大。TI数值越大化合物越安全有效。 

2.统计学分析 

实验数据以（均数±标准差）表示，统计分析采用SPSS13.0统计软件。同一化合物在不同浓度组间的OD值，经方差齐性检验后进行单因素方差分析（One-way ANOVA）：方差齐时采用LSD法检验；方差不齐时采用Dunnett’s T3法。显著性水准取α=0.05，以P<0.05时，判断组间差异具有统计学意义。 

3.实验结果 

将实验数据经上述统计学处理后结果如下表所示。 

各提取物抗HBV作用 

上述实验结果表明本发明所述各提取物对HBsAg和HBeAg分泌均有明显的抑制作用，且对HBeAg的抑制作用更为明显。各提取物中水提取物的抑制活性低于乙醇提取物，而95%乙醇提取物抑制HBsAg和HBeAg分泌更为突出。各提取物的治疗指数TI均大于2，可用于制备乙型肝炎的治疗和预防药物。 

具体实施方式

下述实验用蔓茎堇菜（Viola diffusa Ging）全草采自福建省永春县。 

例1： 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加10L水浸泡30分钟，煎煮2小时，趁热过滤，残渣再加6L水煎煮1小时，趁热过滤，合并煎液。煎液浓缩至1.05～1.1比重的稠浸膏，干燥，得本发明提取物。 

例2： 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加12L水浸泡30分钟，煎煮1.5小时，趁热过滤，残渣再加5L水煎煮1小时，趁热过滤，合并煎液。煎液浓缩至1.05～1.1比重的稠浸膏，干燥，得本发明提取物。 

例3 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加8L水浸泡30分钟，煎煮2小时，趁热过滤，残渣再加7L水煎煮2小时，趁热过滤，合并煎液。煎液浓缩至1.05～1.1比重的稠浸膏，干燥，得本发明提取物。 

例4： 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加体积浓度为10%的乙醇12L浸泡30分钟，加热至95℃回流提取2小时，趁热过滤，残渣再加体积浓度为10%的乙醇5L加热提取1小时，趁热过滤；合并滤液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥即得本发明提取物。 

例5： 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加体积浓度为30%的乙醇10L浸泡30分钟，加热至90℃回流提取2小时，趁热过滤，残渣再加体积浓度为30%的乙醇7L加热提取1小时，趁热过滤；合并滤液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，即得本发明提取物。 

例6： 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加体积浓度为50%的乙醇12L浸泡30分钟，加热至90℃回流提取1.5小时，趁热过滤，残渣再加体积浓度为50%的乙醇6L加热提取1.5小时，趁热过滤；合并滤液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，即得本发明提取物。 

例7： 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加体积浓度为70%的乙醇10L浸泡30分钟，加热至85℃回流提取2小时，趁热过滤，残渣再加体积浓度为70%的乙醇6L加热提取1小时，趁热过滤；合并滤液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，即得本发明提取物。 

例8： 

取干燥的蔓茎堇菜全草1kg，加体积浓度为95%的乙醇8L浸泡30分钟，加热至80℃回流提取2小时，趁热过滤，残渣再加体积浓度为95%的乙醇7L加热提取2小时，趁热过滤； 合并滤液，回收乙醇并减压浓缩至无醇味，干燥，即得本发明提取物。 

例9：（颗粒剂） 

取实施例4中发明提取物300g，加入蔗糖、糊精等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥，分装，每袋9g。本品为棕绿色颗粒，味微甜、苦。开水冲服，一次9g，一日2～3次。其它项目应符合中华人民共和国药典2010年版颗粒剂项下的有关规定。 

例10：（胶囊剂） 

取实施例5中发明提取物300g，加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥。将所得颗粒装入1号硬明胶胶囊中，每粒0.3g，分装100粒。本品为胶囊剂，内容物为棕绿色的颗粒或粉末，味微苦。口服，一次3粒，一日2～3次。其它项目应符合中华人民共和国药典2010年版胶囊剂项下的有关规定。 

例11：（软胶囊） 

取实施例8中发明提取物100g，粉碎成粉未，加入植物油等辅料，混合、压成软胶囊，每粒0.5g，分装500粒。本品为棕绿色的软胶囊，内容物为含有少量悬浮固体浸膏的黄色油状液体。口服，一次2粒，一天2～3次。其它项目应符合中华人民共和国药典2010年软胶囊项下的有关规定。 

例12：（片剂） 

取实施例6中发明提取物100g，加入淀粉等辅料，置于沸腾制粒机中混合、制粒，干燥后加入适量硬脂酸镁压片，每片0.2g，分装500片。本品为棕绿色片剂，味微苦。口服，一次4片，一日2～3次。其它项目应符合中华人民共和国药典2010年片剂项下的有关规定。 

例13：（口服液） 

取实施例1中发明提取物50g，加水适量溶解，滤过，加入单糖浆及苯甲酸钠适量，加水至1000ml，搅匀，静置，滤过，灌封，灭菌，每支10ml。本品为棕色澄清液体，味甜、微苦。口服，一次10～20ml，一日2～3次。其它项目应符合中华人民共和国药典2010年口服液项下的有关规定。