拉帕醇在制备预防和/或治疗恶性胶质瘤的产品中的应用

摘要

本发明公开了萘醌类天然活性物质拉帕醇在预防治疗恶性胶质瘤中的应用。实验结果显示，与对照组相比，在给药浓度较高(100μM)时，拉帕醇可显著降低大鼠脑微血管内皮细胞的存活率；此外，拉帕醇和现有治疗胶质瘤的有效药物替莫唑胺均在较高给药浓度时(分别为500μM、200μM)，可显著降低恶性胶质瘤细胞存活率，而且在中、低给药浓度时，拉帕醇对胶质瘤C6细胞的增殖抑制作用要强于替莫唑胺。实验结果证明拉帕醇在临床上对脑胶质瘤有预防治疗价值。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及拉帕醇在预防治疗疾病中的应用。

背景技术

拉帕醇(lapachol)为萘醌类化合物(naphthoquinones)，在自然界中广泛存在， 最初是从重蚁木中分离得到。拉帕醇的化学名为2-羟基-3-(3-甲基-2-丁烯基)-1，4-萘醌， 是含有一个异戊烯基的羟基萘醌类化合物。其结构中的萘醌环决定了其独特的物理化 学特性和药理学效应，其具有抗血吸虫和抗锥虫作用，也曾作为抗疟药物使用。

脑肿瘤是神经系统中常见的疾病之一。近年来脑肿瘤发病率呈上升趋势，对人类 神经系统的功能有很大危害，直接危及病人生命。由于其膨胀的浸润生长，在颅内一 旦占据一定空间时，不论其性质是良性还是恶性，都势必使颅内压升高，压迫脑组织， 导致中枢神经损害，危及患者生命。因此，对胶质瘤细胞的增殖抑制作用对于此类疾 病的预防治疗具有直接的影响。替莫唑胺(Temozolmide)是一种口服安全有效的新型 烷化剂，是目前治疗恶性胶质瘤的新型有效的化疗药物，其能够显著提高肿瘤患者的 生存率，临床研究证实，替莫唑胺具有很强的抗血管活性及抗肿瘤生长的作用，已经 成为恶性胶质瘤的一线化疗药物。

发明内容

本发明的一个目的是提供拉帕醇在制备预防和/或治疗恶性胶质瘤的药物和/或保 健品中的应用。

具体的，所述恶性胶质瘤为脑恶性胶质瘤。

本发明的另一个目的是提供拉帕醇在制备预防和/或治疗脑肿瘤的药物和/或保健 品中的应用。

具体的，所述脑肿瘤是脑恶性胶质瘤。

本发明的还一个目的是提供拉帕醇在制备抑制恶性胶质瘤细胞增殖的药物和/或 保健品中的应用。

具体的，所述恶性胶质瘤细胞为脑恶性胶质瘤细胞。

本发明的再一个目的是提供拉帕醇在制备抑制胶质瘤细胞增殖的药物和/或保健 品中的应用。

具体的，所述恶性胶质瘤细胞为大鼠恶性胶质瘤细胞C6。

本发明实验证明，拉帕醇对恶性胶质瘤有增殖抑制作用，具有作用确切、毒副作 用有限、价格低廉等特点。

附图说明

图1为拉帕醇对脑微血管内皮细胞存活率的影响；实验结果以mean±S.D.表示 (n＝6)，其中*表示与对照组相比P＜0.05。

图2为替莫唑胺及拉帕醇分别对恶性胶质瘤C6细胞的增殖抑制率；实验结果以 mean±S.D.表示(n＝6)，其中*表示与对照组相比P＜0.05。

图3为高浓度替莫唑胺及拉帕醇对恶性胶质瘤C6细胞形态的影响，其中(A)为 对照组胶质瘤C6细胞形态；(B)为替莫唑胺500μM时C6细胞形态；(C)为拉帕醇 200μM时C6细胞形态。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

实施例1、拉帕醇对脑微血管内皮细胞的细胞毒性作用

1.材料和方法

1.1试剂配制

标准品拉帕醇由西格玛公司提供。拉帕醇为浅黄色针状结晶，精密称取拉帕醇 4.84mg置于1mL容量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液，再将母液用 DMEM培养基稀释成所需检测的给药浓度，所需检测的给药浓度为100μM、10μM及 1μM。

1.2方法

取液氮中保存的大鼠脑微血管内皮细胞(RBMEC)，用移液器转移入15mL离心 管中，加入4mL含有体积百分比为5％胎牛血清(FBS)、1％青链霉素混合液(P/S) 和1％内皮生长因子(ECGS)的ECM培养液混匀，以1000rpm/min离心3min，弃去 上清液，加入3mLECM培养液吹打混匀后接种于预先包被0.1％多聚左旋赖氨酸(PLL) 的25cm²flask培养瓶中，置于培养箱中在37℃、5％CO₂条件下全湿培养。细胞融合程 度达85％以上后弃去旧培养液，加入2mLPBS洗3次，再加入2mL0.25％胰酶-EDTA 在37℃下消化40s，随后加入4mLECM培养液终止消化，吹打混匀后转移入15mL离 心管中，1000rpm/min离心3min，弃去上清液，加入3mLECM培养液吹打混匀，吸取 10μL使用血细胞计数板计数后，调整细胞密度至7.5×10⁴个/mL，每孔100μL接种于 96孔板中。每个所需检测的给药浓度(拉帕醇浓度分别为100μM、10μM及1μM)设 置6个复孔，同时设置空白对照孔(含细胞和ECM培养基)和背景对照孔(不含细 胞，仅含ECM培养基)。置于培养箱中在37℃、5％CO₂条件下全湿培养。24h后小心 弃去旧培养液，用PBS洗2次，每孔加入已配置药液100μL。24h后每孔加入 20μL5mg/mL的无菌MTT后继续培养。4h后弃去药液，每孔加入150μLDMSO溶解 甲瓒，使用酶联免疫检测仪在570nm下检测吸光度OD值。

2.数据统计学处理

所有数据用mean±S.D.表示，统计学分析采用SPSS16.0分析软件。以空白对照组 吸光度OD值为100％，以给药组吸光度OD值与空白对照组吸光度OD值之间的比率 反映药物对细胞的增殖抑制率。所有数据均通过正态性检验，P＜0.05表示有显著性差 异。细胞增殖抑制率的计算公式为：

3.实验结果

与对照组相比，拉帕醇在100μM时RBMEC细胞存活率有一定程度的降低；在 10μM、1μM时对RBMEC细胞存活率无影响。结果见表1和图1。

表1拉帕醇在不同浓度下对RBMEC的细胞毒性作用

(*表示与对照组相比，P＜0.05)

4.结论：结果表明，拉帕醇在给药浓度较高(100μM)时对RBMEC细胞的存活 率降低，产生一定的细胞毒性作用；而在给药浓度为10μM和1μM时，对细胞所产 生的毒性都很小，表明拉帕醇在给定的浓度(10μM和1μM)实验时，对细胞产生的 毒性有限。

实施例2、拉帕醇对恶性胶质瘤C6细胞的增殖抑制作用

1.材料和方法

1.1试剂配制

标准品拉帕醇由西格玛公司提供；阳性对照抗肿瘤上市药替莫唑胺由北京莱瑞森 科技有限公司提供。拉帕醇为浅黄色针状结晶，精密称取拉帕醇4.84mg置于1mL容 量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液，给药浓度为用DMEM培养基将母 液稀释而成，所需浓度为200μM、20μM、2μM。替莫唑胺为白色粉末，精密称取替莫 唑胺9.7mg置于1mL容量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液，给药浓度 为用DMEM培养基将母液稀释而成，所需浓度为500μM、50μM、5μM。

1.2方法

取出于液氮中保存的大鼠恶性胶质瘤C6细胞(购自北京协和医学院细胞中心)， 用移液器转移入15mL离心管中，加入4mL含有体积百分比为10％胎牛血清(FBS)、 1％青链霉素混合液(P/S)的DMEM培养液混匀，以1000rpm/min离心3min，弃去 上清液，加入3mLDMEM培养液吹打混匀后接种于25cm²flask培养瓶中，置于培养箱 中在37℃、5％CO₂条件下全湿培养。3d后弃去旧培养液，加入2mLPBS洗3次，再 加入2mL0.25％胰酶-EDTA在37℃下消化40s，随后加入4mLDMEM培养液终止消化， 吹打混匀后转移入15mL离心管中，1000rpm/min离心3min，弃去上清液，加入 3mLDMEM培养液吹打混匀，吸取10μL使用血细胞计数板计数后，调整细胞密度至 3×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔板中。每个给药浓度设置6个复孔，同时设置 空白对照孔和背景对照孔。置于培养箱中在37℃、5％CO₂条件下全湿培养。24h后小 心弃去旧培养液，用PBS洗2次，每孔加入已配置药液100μL。48h后，每孔加入 20μL5mg/mL的无菌MTT后继续培养。4h后弃去药液，每孔加入150μLDMSO溶解 甲瓒，使用酶联免疫检测仪在570nm下检测吸光度OD值。

2.数据统计学处理

所有数据用mean±S.D.表示，统计学分析采用SPSS16.0分析软件。以空白对照组 吸光度OD值为100％，以给药组吸光度OD值与空白对照组吸光度OD值之间的比率 反映药物对细胞的增殖抑制率。所有数据均通过正态性检验，P＜0.05表示有显著性差 异。细胞增殖抑制率的计算公式为：

3.实验结果

与对照组相比，替莫唑胺及拉帕醇在给药浓度较高时(分别为500μM、200μM) 细胞存活率最低；中(分别为50μM、20μM)、低(分别为5μM、2μM)浓度时拉帕 醇组的细胞存活率略低于替莫唑胺组。结果见表2和图2。

表2替莫唑胺与拉帕醇对C6细胞的细胞毒性作用

*与对照组相比，P＜0.05；**与对照组相比，P＜0.01。

恶性胶质瘤C6分别在高浓度替莫唑胺及拉帕醇(分别为500μM、200μM)中培 养48h后，在电子显微镜下观察到高浓度的替莫唑胺及拉帕醇对恶性胶质瘤C6细胞 形态的影响，结果见图3。

4.结论

替莫唑胺及拉帕醇在给药浓度较高时，替莫唑胺组的细胞存活率低于拉帕醇组， 显示替莫唑胺对胶质瘤C6细胞的增殖抑制作用强于拉帕醇；中、低浓度时替莫唑胺 组细胞存活率高于拉帕醇组，显示替莫唑胺对胶质瘤C6细胞的增殖抑制作用要比拉 帕醇弱。拉帕醇在实验浓度范围内对胶质瘤C6细胞有显著的增殖抑制作用。在临床 对胶质瘤有预防治疗价值。