五溴联苯醚-121的半抗原、人工抗原及抗体

摘要

本发明公开了一种五溴联苯醚-121的半抗原和由该半抗原合成的人工抗原，及进一步由人工抗原通过动物免疫制得具有特异性识别五溴联苯醚-121的多克隆抗体，该多克隆抗体效价高，用于五溴联苯醚-121的分析检测中检测下限低，回收率高，可以广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及五溴联苯醚-121的半抗原、人工抗原及抗体，属于免疫化学分析技术领域。

背景技术

多溴联苯醚（polybrominated diphenyl ethers，简称PBDEs)是一类具有联苯醚结构的多卤 代芳香族化合物。作为一类重要的溴代阻燃剂，其被广泛应用于电子电气设备、塑料制品和 纺织品等，含量从5%到30%不等。其商业性生产开始于20世纪70年代，主要有4种工业 品：四溴联苯醚(Tetra-BDE)、五溴联苯醚、八溴联苯醚和十溴联苯醚，它们实际上都是多种 PBDE同类物的混合物。PBDEs作为添加型阻燃剂，是以物理方式结合在树脂基材上的，因 此在生产、使用和处置过程中易被释放到环境中。1979年在美国PBDEs生产厂周边环境中 采集的土壤和污泥样品中检测到了十溴联苯醚(BDE-209)的存在(Alaee M,et al.Chemosphere, 2002,46:579-582)。1987年Jansson等证明了波罗的海、北海、北冰洋的鸟(以鱼为食)和海洋 哺乳动物的组织样品中有PBDEs存在，首次提出PBDEs是全球性的污染物质(Jansson B,et al. Chemosphere,1987,16:2343-2349)。近年来PBDEs由于其在全球环境和生物体内的普遍存在 而备受关注。大量的环境监测数据表明当前环境中普遍存在着PBDEs，包括大气、水、沉积 物、土壤、污泥以及各种生物样品，分布范围几乎遍及全球，而且浓度迅速增长。

多溴联苯醚的化学结构与多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)、多溴联苯 (polybrominated biphenyls，PBBs)相似，因此被认为具有与它们类似的特性，如强亲脂性、半 挥发性和生物蓄积性等(Hardy M L.,Chemosphere,2002,46:717-728)。一些研究表明，PBDEs 具有潜在的致癌作用，并对神经、内分泌和免疫系统有毒害作用(Mcdonald T A.,Chemosphere, 2002,46:745-755)。另外，PBDEs在高温焚烧时可能会生成毒性更强的多溴代二苯并呋喃 (PBDFs)和多溴代二苯并二噁英(PBDDs)(Buser H R.,Environ.Sci.&Technol.,1986,20: 404-408)。因此，PBDEs对人类和生态环境的潜在风险成为人们关注的热点。

基于此，开展相应的多溴联苯醚分析检测具有非常重要的现实意义。而目前对多溴联苯 醚的检测大多依赖气相色谱法(GC)、液相色谱(HPLC)或者气相质谱连用(GC-MS)等常规手段。 众所周知，HPLC或GC的使用通常会受到待测物的蒸气压、热稳定性以及发色团等理化性 质的限制，不适用于难气化或难分离的有害物的分析。而且这些方法操作过于繁琐，同时需 要对样品进行复杂的预处理。和其他的传统检测方法相比，酶联免疫吸附测定法(Enzyme- Linked Immunosorbnent Assay，简称ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性 反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的检测分析技术。该法具有特 异性强、敏感性好、仪器化程度和分析成本低、样品前处理及操作简便、检测时间短、样品 容量大等优点，不仅适合高极性和离子型物质的分析，而且便于实现现场的监控和大规模样 本的快速筛选。

当今已有对四溴联苯醚PBDE-47的酶联免疫分析，而五溴联苯醚的免疫分析尚无报道。 PBDE-121是五溴联苯醚中一类，因此开展其分析检测很有必要。

发明内容

本发明针对现有技术中尚无五溴联苯醚的免疫化学分析技术，目的在于提供一种五溴联 苯醚半抗原，该半抗原能与载体蛋白结合得到五溴联苯醚人工抗原，并且能再进一步获得具 有特异性识别五溴联苯醚-121的多克隆抗体。

本发明的另一个目的在于提供了一种由上述半抗原制备而来的人工抗原。

本发明还有一个目的是在于提供一种能特异性识别五溴联苯醚-121的多克隆抗体，该多 克隆抗体效价高，用于五溴联苯醚-121的分析检测中检测下限低，回收率高，可以广泛应用。

本发明提供了一种五溴联苯醚-121半抗原，该半抗原具有式Ⅰ结构：

式Ⅰ

其中，n为0～8的整数。

优选的五溴联苯醚-121半抗原具有式Ia或式Ib结构：

式Ia

式Ib

本发明还提供了一种五溴联苯醚-121人工抗原，该人工抗原具有式Ⅱ结构：

式Ⅱ

其中，n为0～8的整数；Protein为载体蛋白。

优选的人工抗原具有式Ⅲ结构：

式Ⅲ

其中，Protein为载体蛋白。

所述的载体蛋白包括牛血清蛋白或卵清蛋白。

本发明还提供了一种五溴联苯醚-121的多克隆抗体，该多克隆抗体由上述的人工抗原经 动物免疫得到的免疫球蛋白。

所述的免疫球蛋白能与五溴联苯醚-121发生特异性免疫反应。

本发明的五溴联苯醚-121半抗原合成步骤如下：

(1)将对溴苯酚溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑，室温 下搅拌8～16h后；减压蒸除溶剂，残余物加水稀释，并用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥； 减压蒸除溶剂，得到化合物2；其中，对溴苯酚、叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑的摩尔比为1:1.3: 3；

(2)在-78°C和氮气保护条件下，将化合物2溶于四氢呋喃(THF)中，然后滴加正丁基锂 (n-BuLi)；反应1h后，将硼酸三异丙酯滴加到上述体系；滴加完后，在此温度下反应2h， 然后升至室温并继续反应8～16h；加入盐酸酸化，减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥；减压蒸除溶剂，残余物用石油醚与乙酸乙酯的混合液重结晶得到化合物3；其中，化 合物2、正丁基锂和硼酸三异丙的摩尔比为1:1.2:3；

(3)无水醋酸铜和二氯甲烷在室温下搅拌0.5h后，将化合物3、2,4,6-三溴苯酚、三乙胺 和吡啶加入到上述反应体系中；室温下反应约4h，反应混合物经柱层析分离得到化合物4； 其中，无水醋酸铜、化合物3、2,4,6-三溴苯酚、三乙胺和吡啶的摩尔比为1:2:1:5:5；

(4)将氢溴酸滴加入到化合物4和氟化钾(摩尔比为0.03:1:2)的DMF溶液中，室温下反 应2h；减压蒸除溶剂后，残余物加水稀释，用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥；过滤除去 固体后，减压蒸除溶剂，再经柱层析分离得到化合物5；

(5)将溴素滴加入到化合物5的醋酸溶液中(摩尔比为3:1)，并于室温下反应2h；向反 应液加入饱和NaHSO₃水溶液，用乙酸乙酯萃取，无水Na₂SO₄干燥；过滤除去固体后，减压 蒸除溶剂，经柱层析分离得到化合物6；

（6）五溴联苯醚-121半抗原的合成（以Ia和Ib的合成为例）

(a)将半抗原中间体6、碳酸钾和丙酮在65°C下反应1h后，加入4-溴丁酸乙酯，并继 续回流反应8～16h；过滤，减压蒸除溶剂，经柱层析分离得到化合物7；再经的水/四氢呋喃 溶液水解，得到五溴联苯醚的半抗原Ia；

(b)将半抗原中间体6、碳酸钾和丙酮在65°C下反应1h后，加入6-溴己醇，并继续回 流反应8～16h；过滤，减压蒸除溶剂，经柱层析分离得到化合物8；再经琼斯试剂氧化，得到 五溴联苯醚的半抗原Ib。

本发明五溴联苯醚-121半抗原合成路线如下：

（1）中间体化合物3的合成：

（2）半抗原前驱体化合物2,6,2',4',6'-五溴-4-羟基联苯醚的合成：

（3）五溴联苯醚-121半抗原的合成：

本发明的五溴联苯醚-121人工抗原的合成步骤如下：

将化合物Ia、NHS和DCC(摩尔比为1:1.2:1.2)溶于DMF中，室温反应4h后再放置 于4°C冰箱8～16h；次日离心取上清液缓慢滴加到载体蛋白的0.05mol/L磷酸氢二钠-磷酸二 氢钠缓冲液(PBS溶液)中，室温反应2h后再放置于4°C冰箱8～16h；然后将反应液用PBS溶 液(0.01mol/L、pH=7.4)透析；将透析后的半抗原和载体蛋白结合物溶液进行冷冻干燥，并在 -20°C下保存；以半抗原和牛血清蛋白(BSA)的结合物BSA-Ia作为动物实验的人工抗原，半 抗原和卵白蛋白(OVA)的结合物OVA-Ia作为免疫分析的包被原。

本发明的五溴联苯醚-121多克隆抗体制备步骤如下：

将制备的人工抗原BSA-Ia用生理盐水溶解，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，对新 西兰大白兔进行多点免疫接种；一周后的首次免疫用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂进行 乳化，之后每两周加强免疫一次；每次进行免疫加强后一周，采集兔耳缘的静脉血并检测抗 血清效价，直至抗血清效价符合要求后；进行颈动脉取血，分离出血清并用蛋白A亲和层析 柱纯化，获得五溴联苯醚-121的抗体。

本发明的有益效果：本发明经过反复试验成功的设计合成了一种五溴联苯醚半抗原，该 半抗原能与载体蛋白成功结合得到五溴联苯醚人工抗原，并且再进一步获得能特异性识别五 溴联苯醚-121的多克隆抗体；该多克隆抗体效价高，兔子免疫试验表明：待第5次免疫时， 兔子获得了高效价的抗体，抗血清I的效价为1:4000；经纯化后的效价为1:8000；用于五 溴联苯醚-121的分析检测中检测下限低，抗体对五溴联苯醚-121的50%抑制率浓度(IC₅₀)为 8.07ng/mL，最低检测下限(以抑制率为10%的浓度表示)为0.644ng/mL；回收率高，在90% 左右；可以广泛应用。

附图说明

【图1】为实施例6间接竞争ELISA方法来测定抗体的抑制率的PBDE-121浓度-吸光度关系 图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明。

实施例1：中间体化合物4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯硼酸的合成

(1)在氮气保护条件下，将DMF(35mL)加入到4-溴苯酚(3.46g,20mmol)、叔丁基二甲 基氯硅烷(4.16g,27.6mmol)、咪唑(4.08g,60mmol)的混合物中，并在室温下搅拌8～16h；减 压蒸除溶剂后，残余物倾倒入大量水中，用乙酸乙酯(AcOEt)萃取；有机相再经饱和食盐水洗 涤，无水Na₂SO₄干燥；减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离纯化[V(石油醚):V(AcOEt) =50:1]，得到3.92g无色油体状化合物2，收率为68%。

2:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ0.18(s,6H),0.97(s,9H),6.71(d,J=8.80Hz,2H),7.32(d, J=8.40Hz,2H)。

(2)在-78°C和氮气保护下，将n-BuLi(14.4mmol,2.5mol/L)缓慢滴加到化合物2(3.44 g,12mmol)的THF(12mL)溶液中，搅拌反应1h；再将硼酸三异丙酯(36mmol,7.4mL)滴加到 上述混合液中，在-78°C搅拌反应2h，移至室温下搅拌8～16h；加稀盐酸调至弱酸性后，减 压蒸除溶剂，残余物倒入含有大量水的分液漏斗中，用AcOEt萃取，有机相经饱和食盐水洗 涤，无水Na₂SO₄干燥；减压蒸除溶剂，残余物经石油醚/乙酸乙酯重结晶，得到1.97g白色 固体状4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯硼酸，收率为65%。

3:m.p.160-163°C;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ0.10(s,6H),0.86(s,9H),6.80(d,J=8.40 Hz,2H),7.96(d,J=8.40Hz,2H);¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:4.25(CH₃),18.36(CH),25.75 (CH₃),119.83(CH),137.52(CH),159.78(C)。

实施例2：2,6,2',4',6'-五溴-4-羟基联苯醚的合成

(1)将无水醋酸铜(364mg,2mmol)和二氯甲烷(20mL)在室温下搅拌0.5h后，依次加入粉 末型4分子筛、化合物3(1.01g,4mmol)、2,4,6-三溴苯酚(662mg,2mmol)、Et₃N(1.4mL,10 mmol)和吡啶(0.8mL,10mmol)，并继续在室温下搅拌反应约4h；TLC跟踪显示原料反应完全 后停止反应；抽滤除去分子筛，减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离纯化(石油醚)， 得到419mg无色油状2',4',6'-三溴-4-(叔丁基二甲基硅氧基)联苯醚，收率为39%。

4:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ0.17(s,6H),0.97(s,9H),6.67(d,J=8.80Hz,2H),6.75(d, J=8.80Hz,2H),7.74(s,2H)。

(2)在氮气保护条件下，将氢溴酸(0.01mL,48%,0.03mmol)加入到4(537mg,1mmol)和 KF(116mg,2mmol)的DMF(6mL)溶液中，并于室温下搅拌反应约2h；待原料反应完全后， 加入稀盐酸将反应液调至pH=5～6，并减压蒸除大部分DMF；残余物倾倒入水中，用AcOEt 萃取，有机相再经饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥；减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层 析分离纯化[V(石油醚):V(AcOEt)=4:1]，得到368mg白色固体状2',4',6'-三溴-4-羟基联苯醚， 收率为87%。

5:m.p.164-166°C;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.47(s,1H),6.69(d,J=9.2Hz,2H),6.69 (d,J=9.2Hz,2H),7.74(s,2H)。

(3)在室温下，将溴素(363mg,2.27mmol)滴加到化合物5(320mg,0.757mmol)的醋酸(5 mL)溶液中，并搅拌反应2h；TLC跟踪原料反应完全后，加入饱和NaHSO₃水溶液至红色褪去， 用NaOH水溶液调节反应液至中性；用AcOEt萃取，有机相经饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄ 干燥；减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离纯化[V(石油醚):V(AcOEt)=25:1]，得到 435mg白色固体状2,6,2',4',6'-五溴-4-羟基联苯醚，收率为99%。

6:m.p.170-171°C;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.63(s,1H),6.94(s,2H),7.77(s,2H)。

实施例3：五溴联苯醚半抗原化合物Ia的合成方法如下：

(1)将K₂CO₃(214mg,1.55mmol)加入到化合物6(180mg,0.31mmol)的丙酮(8mL)溶液 中，升温回流1h；然后向反应液中加入4-溴丁酸乙酯(64mg,0.33mmol)，并回流8～16h；过 滤不溶物后，减压蒸除丙酮，残余物用AcOEt溶解，有机相经饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥；减压蒸除溶剂，剩余物通过硅胶柱层析分离纯化[V(石油醚):V(AcOEt)=40:1]，得到 239mg无色油状化合物7，收率为82%。

7:m.p.99-100°C;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.28(t,J=7.20Hz,3H),2.15～2.19(m,2H), 2.66(t,J=7.60Hz,2H),4.01(t,J=6.00Hz,2H),4.16(q,J=7.20Hz,2H),6.95(s,2H),7.77(s, 2H)。

(2)将化合物7(125mg,0.18mmol)、LiOH·H₂O(23mg,0.54mmol)用水/四氢呋喃的混合 液(6mL,1:1)溶解后，在室温下搅拌约8h；TLC监测反应进程；待原料反应完全后，将反 应液中酸化，减压蒸除部分溶剂，残余物用AcOEt萃取；有机相经饱和食盐水洗涤，无水 Na2SO4干燥；减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离纯化[V(石油醚):V(AcOEt)=4:1]， 得到99mg白色固体状化合物Ia，收率为83%。

Ia:m.p.138-140°C;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.99(t,J=6.40Hz,3H),2.46～2.51(m, 2H),3.93(t,J=6.40Hz,2H),7.21(s,2H),8.11(s,2H),12.17(s,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃) δ25.32(CH₂),30.34(CH₂),72.76(CH₂),118.62(C),119.12(CH),119.30(C),120.32(C),136.01 (CH),147.33(C),148.56(C),152.69(C),174.36(C=O);MS(ESI)m/z(%)1327.8(2M^-+4,53%), 1329.8(2M^-+6,100%),1331.7(2M^-+8,82%),1333.7(2M^-+10,76%)。

实施例4：五溴联苯醚半抗原化合物Ib的合成方法如下：

(1)将K₂CO₃(190mg,1.38mmol)加入到化合物6(160mg,0.276mmol)的丙酮(8mL)溶液 中，升温回流1h；向混合物里滴加6-溴己醇(53mg,0.29mmol)，继续回流反应8～16h；过滤 不溶物，减压蒸除丙酮，加入AcOEt溶解，有机相经饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥； 减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离纯化[V(石油醚):V(AcOEt)=5:1]，得到160mg 无色油状化合物8，收率为84%。

8:m.p.114-115°C;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.44～1.55(m,2H),1.54～1.64(m,2H), 1.84～1.90(m,2H),3.68(t,J=6.80Hz,2H),3.97(t,J=6.40Hz,2H),6.95(s,2H),7.77(s,2H)。

(2)在室温下，将琼斯试剂(2.97mol/L,0.08mL,0.24mmol)缓慢滴加到8(100mg,0.147 mmol)的丙酮(4mL)溶液中，搅拌反应约1h，TLC监测反应进程；待原料反应结束后，滴加 1滴异丙醇淬灭反应；减压蒸除部分丙酮，加水稀释反应液后，用AcOEt萃取，有机相经饱 和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥；减压蒸除溶剂，残余物通过硅胶柱层析分离纯化[V(石油 醚):V(AcOEt)=3:1]，得到化合物Ib61mg，收率为60%。

Ib:m.p.171-173°C;¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.47～1.53(m,2H),1.55～1.60(m,2H), 1.74～1.78(m,2H),2.24(t,J=7.20Hz,2H),3.90(t,J=6.40Hz,2H),7.19(s,2H),7.19(s,2H), 8.10(s,2H),11.98(s,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ24.57(CH₂),25.25(CH₂),29.49(CH₂), 33.86(CH₂),73.41(CH₂),118.54(C),119.03(C),119.21(CH),120.19(C),135.91(CH),147.28 (C),148.69(C),152.52(C),174.71(C=O);MS(ESI)m/z(%)1383.7(2M^-+4,45%),1385.8 (2M^-+6,100%),1387.7(2M^-+8,93%),1389.7(2M^-+10,69%)。

实施例5：人工抗原的制备

将化合物Ia(9.0mg,13.5μmol)用DMF(0.5mL)溶解后，依次加入DCC(5mg,24.7μmol) 和NHS(3mg,24.5μmol)，于室温下反应4h后再放置于4°C冰箱8～16h后；离心取上层清 液，在4°C下将其缓慢滴加到BSA(55mg,0.8μmol)的PBS溶液(c0.05mol/L,10mL)中，升 至室温并继续反应2h，再放置于4°C冰箱8～16h；然后将反应液装入透析袋中，在4°C下 的PBS溶液(0.01mol/L、pH=7.4)中透析，每12小时换一次透析液，共透析6次；透析完毕 后将透析袋中偶联物BSA-1a进行冷冻干燥，并于-20°C下保存；

将化合物1a(11mg,16.5μmol)用DMF(0.7mL)溶解后，依次加入DCC(9mg,42.7μmol) 和NHS(5mg,42.7μmol)，室温下反应4h后再放置于4°C冰箱8～16h；离心取上层清液，在 4°C下将其缓慢滴加到OVA(65mg,1.4μmol)的PBS溶液(c0.05mol/L，10mL)中，升至室温 继续反应2h，再放置于4°C冰箱8～16h；然后将反应液装入透析袋中，在4°C下的PBS溶 液(0.01mol/L、pH=7.4)中透析，每12小时换一次透析液，共透析6次；透析完毕后将透析 袋中偶联物OVA-1a进行冷冻干燥，并于-20°C保存。

实施例6：多克隆抗体I的制备

8.1免疫动物制备血清I

实验选用半周岁左右、体重约为2公斤、健康的新西兰大白兔作为免疫动物对象。

用400μL生理盐水将0.4mg人工抗原BSA-1a溶解稀释后，加入等体积的弗氏完全佐剂 进行乳化；然后对新西兰大白兔的背部脊椎两侧进行多点皮下注射；首次免疫接种的一周后， 用400μL弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，进行注射以加强免疫，以后每两周进行免疫加 强一次；免疫前兔耳缘静脉采血作为阴性对照样品保留，每免疫加强后一周对兔耳缘静脉取 血l mL，室温下静置2h，血液充分凝固后，离心取血清用间接ELISA法检查抗体效价；

待免疫效价符合要求后，对大白兔进行颈动脉取血，并将所取血液瓶放置室温半小时； 凝固后用接种针沿瓶内壁将血块与玻璃脱离，再放到4°C冰箱中8～16h；待血块收缩后，用 毛细吸管将血清吸入试管中，3000r/min转速下离心分离出血清I。

8.2抗体纯化

经蛋白A亲和层析柱分离纯化，获得五溴联苯醚的抗体I。

实施例7：多克隆抗体I的鉴定及其应用

9.1抗体效价的检测

从免疫加强第一次开始，在每次免疫加强后的第7天，采集兔子耳缘静脉血并分离出血 清，将血清进行适当稀释后用间接ELISA方法测定效价；待第5次免疫时，兔子获得了高效 价的抗体，抗血清I的效价为1:4000；经纯化后的效价为1:8000。

本发明采用间接ELISA方法对多克隆抗体血清I进行效价测定，具体步骤如下：

1)采用间接ELISA方法得出抗原及待测血清的最佳工作浓度：包被物质OVA-1a浓度 是10μg/mL，抗体的稀释倍数为1:8000，二抗的稀释倍数为1:4000；

2)包被:用0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液(CBS,pH=9.6)梯度稀释包被原OVA-1a到10 μg/mL加到酶标板上，并在酶标板上每孔滴加100μL/孔；37°C放置1h后，4°C下8～16h； 次日用洗涤液(含0.05%TWeen-20的PBS溶液)反复洗涤3次，每次3分钟；

3)封闭:用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)稀释OVA至1%(质量分数)，并 在按酶标板上每孔滴加300μL；37°C温育1h；用洗涤液反复洗三次；

4)加样:在按酶标板上每孔内，依次加入用PBS梯度稀释和抗体50μL，每组浓度重复 2孔，并以PBS作空白对照；37°C温育2h；用洗涤液反复洗三次；

5)加酶标二抗:用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液将羊抗兔HRP-IgG稀释4000倍，按100μL/ 孔滴加到酶标板各孔中；37°C放置1h；用洗涤液反复洗三次，再用蒸馏水反复洗涤2次， 每次3分钟；

6)显色与终止:在酶标板各孔中加入100μL的加入底物显色剂(3,3',5,5'-四甲基联苯胺+ 双氧水)，室温避光5-10min后，再在酶标板各孔中50μL加入终止液(2mol/L硫酸溶液)；通 过酶标仪测定波长为450nm的光密度值(optical density,OD值)；选取加入抗体后，最大吸光 度为1左右时的稀释比例1:8000作为以后抗体的稀释倍数。

9.2抗体抑制率的测定

本发明采用间接竞争ELISA方法来测定抗体的抑制率，具体步骤如下：

1)包被:用碳酸盐缓冲溶液(CBS,0.05mol/L,pH=9.6)梯度稀释包被原OVA-Ia到10 μg/mL，并在酶标板上每孔滴加100μL/孔；37°C放置1h，之后4°C下8～16h；用洗涤液(含 0.05%TWeen-20的PBS溶液)反复洗涤三次，每次3分钟；

2)封闭:用磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液，0.01mol/L,pH=7.4)稀释OVA至1%(质量分数)， 按300μL/孔加到酶标板的各孔中；37°C温育1h后，用洗涤液洗涤三次；

3)加样:在酶标板的各孔中，加入100μL不同稀释浓度的五溴联苯醚-121的DMSO溶 液和50μL抗体(用PBS稀释8000倍)，每组浓度重复两次；以PBS作空白对照，37°C温育 2h后，用洗涤液洗涤三次；

4)加酶标二抗:用PBS溶液羊抗兔HRP-IgG稀释4000倍，按100μL/孔加到酶标板各孔 中；37°C放置1h后，用洗涤液洗涤三次，再用蒸馏水洗涤两次，每次3分钟；

5)显色与终止:在酶标板各孔中加入100μL的加入底物显色剂(3,3',5,5'-四甲基联苯胺+ 双氧水)，室温避光5-10min后，再在酶标板各孔中50μL加入终止液(2mol/L硫酸溶液)；通 过酶标仪测定波长为450nm的光密度值(optical density,OD值)。

抑制率是通过下式计算得到：

式中：OD_max为不加五溴联苯醚时的吸光度，OD_x为加入五溴联苯醚时的吸光度，OD_min为空白对照孔的吸光度。

本发明采用间接竞争ELISA方法来测定抗体的抑制率。

采用间接ELISA依次对不同浓度进行检测，得到了图1：

当五溴联苯醚-121的浓度为1.74～84.1ng/mL时，抗体对其有较好的线性关系；同时，抗 体对五溴联苯醚-121的50%抑制率浓度(IC₅₀)为8.07ng/mL，最低检测下限(以抑制率为10% 的浓度表示)为0.644ng/mL。

9.3抗体回收率的测定

通过对不同基质中加入不同浓度的PBDE-121，然后通过用乙酸乙酯进行反复洗涤和萃 取，再浓缩吹干后用DMSO复溶，最后，采用如上所述的酶联免疫分析法测定浓度；并且每 组重复3遍，每次重复5组；回收率的测定可以对本方法的实际应用进行准确度的判断，具 体数据如下所示：