一种miR-15a靶标位点序列及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用

摘要

本发明公开了一种miR-15a靶标位点序列及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用，miR-15a通过靶定在该序列中的作用位点上来抑制人乙肝病毒的复制。该靶标作用位点的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该靶标位点序列为医学领域中研发新的治疗因HBV病毒引发的一些相关疾病的抗病毒药物又提供了新的药物靶标和治疗方法。与此同时由于microRNA本身是由细胞自身表达产生的，所以相比较其他人工合成而非细胞自身合成的药物可能对细胞的毒害性小，效果好。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和抗病毒学的领域，具体涉及一种miR-15a靶标位点序列，本发明还涉及一种miR-15a靶标位点序列在制备抑制乙型肝炎病毒复制药物中的应用。本发明所述的分一种miR-15a靶标位点序列HBV基因组上，miR-15a可以通过直接靶定在该位点上来抑制的HBV复制。 

背景技术

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种DNA病毒，大约由3200核苷酸组成的环形的部分双股的DNA分子。它的复制能够引起人急慢性肝炎，同时可能导致肝硬化和肝癌等发生。目前在全世界已有约6%是该病毒的携带者，所以说乙型肝炎病毒的持续感染已经成为全球性的健康问题。 

目前还没有一种有效的办法来治疗因乙型肝炎病毒的感染而导致的疾病。只能通过预防和控制。现在最可靠也很普遍的方法就是乙肝疫苗的接种。还有就是使用一些药物，例如：拉米夫定，还有中药等等。已有很多文献报道利用siRNA通过靶定在HBV genome上，(Ren JL,Pan JS,Cheng T,Dong J,Lu YP,Huang SJ,Shi HX,Wang L,Lian YM.RNA interference inhibits hepatitis B virus gene expression and replication in HepG2-N10cells.Chin J Dig Dis.2006;7(4):230-6.)可以抑制细胞内HBV的复制，也有文献报道人体内自身编码的microRNA也可以抑制HBV的复制，例如miR-199a-3p和miR-210可以分别靶定在HBV的HbsAg的编码区域和Pre-S1区域来抑制HBV的复制等（Zhang GL,Li YX,Zheng SQ,Liu M,Li X,Tang H.Suppression of hepatitis B virus replication by microRNA-199a-3p and microRNA-210.Antiviral Res.2010Nov;88(2):169-75.2010Aug20.；Zhang GL,Li YX,Zheng SQ,Liu M,Li X,Tang H.miR-122-induced down-regulation of HO-1negatively affects miR-122-mediated suppression of HBV.Antiviral Res.2010Nov;88(2):169-75.2010Aug20.）。 

MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer加工后生成，不同于siRNA，但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。现在研究有许多的miRNAs参与到一些癌症和重要疾病当中，并起到很重要的作用。 

目前一些研究发现miR-15a在一些重要的癌症及疾病中有很重要的作用，例如它的表达 与慢性B淋巴细胞白血病（B-CLL）有关：B-CLL中常见的Bq14的缺失可导致miR15a和miR16a的去表达；（Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et a1．Human micreRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J]．Proc Nail Acad Sci USA，2004，101(9)：2999-30o4．）同时也发现它通过调节基因Cdc25a的表达，从而影响肝肿囊的发生等。（Seung-Ok Lee,Tatyana Masyuk,Patrick Splinter,Jesús M.Banales et a1．MicroRNA15a modulates expression of the cell-cycle regulator Cdc25A and affects hepatic cystogenesis in a rat model of polycystic kidney disease.Clinical Investigation Nov2008,118(11):3585）。因此本发明可能为治疗由HBV引发的肝炎等疾病提供新的治疗方法或药物靶标，这将会有很大重要的意义，同时也为研究生物学领域中研究microRNAs与HBV之间的相互作用的关系近一步的阐述。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种miR-15a靶标位点序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。该序列位于HBV基因组，可受miR15a直接靶定由此来抑制HBV的复制。 

本发明还有一个目的是在于提供了一种miR-15a靶标位点序列在制备抑制乙型肝炎病毒复制药物中的应用。miR-15a通过靶定在HBV基因组的X蛋白中的该序列上，从而抑制X蛋白的表达，达到抑制HBV复制的目的。同时，miR-15a对乙型肝炎病毒复制的抑制，具有浓度依赖性。 

为了达到以上的目的，本发明采用以下技术措施： 

1.采用反义RNA技术，沉默miRNA’s pathway中的蛋白组分Ago2和Dicer之后，检测相关HBV的复制的指标，通过酶联免疫法检测HBV分泌的抗原HBsAg和HBeAg。 

knock-down Ago2和Dicer的siRNA如下： 

si Ago2：5’-GCACGGAAGUCCAUCUGAATT-3’ 

si Dicer：5’-UGCUUGAAGCAGCUCUGGA-3’。 

荧光定量PCR结果显示Ago2和Dicer的敲除效果达到80%左右，同时通过酶联免疫法检测microRNA效应蛋白AGO2及其加工蛋白Dicer的敲低造成HBV病毒复制的增强，说明microRNA会抑制HBV的复制。 

2.将化学合成的miR-15a mimic（miR-15a mimic inhibitor）和质粒pCH9-3091，通过lipofectamine2000脂质体试剂转染进入到HepG2细胞中，经2-3天后，通过酶联免疫法检测HBV分泌的HBsAg和HBeAg。 

miR-15a mimic的序列为：5’-uagcagcacauaaugguuugug-3’； 

miR-15a inhibitor的序列为：5’-cacaaaccauuaugugcugcua-3。 

结果显示：高表达miR-15a，将会导致HBV的S抗原和E抗原的分泌降低，反之阻断miR-15a，将会导致HBV的S抗原和E抗原的分泌升高，说明miR-15a可以抑制HBV的复制，并具有浓度依赖性。 

3.预测miR-15a在HBV基因组上的靶标序列。 

采用生物学软件Target scan(Lewis et al.,2005)预测在HBV基因组上的miR5a的靶标序列，结果如图3所示：用上述所提到的软件在HBV基因组上预测到4个miR-15a潜在的靶标位点，其具体位置如下，在HBp的CDS区域有三个位点，具体在HBV基因组上的位置分别是：2645-2666bp，2677-2698bp和2686-2707bp。HBp和HBx的重叠区域，具体在HBV基因组上的位置为2900-2921bp。其中在HBx区域潜在靶标位点进行相应的碱基突变具体如图中箭头所示：T to G,T to C（图3）。 

4.证实HBV中编码HBp蛋白和HBx蛋白基因中一段共有序列是miR-15a的作用靶标。 

将含有miR-15a突变的位点序列的质粒PRL-HBX-mut和含有miR-15a潜在位点序列的质粒PRL-HBX和PGL3-pro（购于promega公司）通过lipofectamine2000脂质体试剂转染进入到HepG2细胞中，检测其相对荧光素酶活性=Renilla luciferase’s activity/firefly luciferase activity。 

检测结果显示：当转染了miR-15a mimic时，pRL-HBx的相对荧光素酶活性与对照组相比较来说下降，而当转染了miR-15a inhibitor时，pRL-HBx的荧光素酶活性与对照组相比较来说是上升；然而针对pRL-HBx-mut而言，转染了miR-15a mimic或miR-15a inhibitor时，其相对荧光素酶活性与对照组相比较并没有发生什么变化。由此可以看出突变位点确实为miR-15a真正的靶标位点，其序列为SEQ ID NO.1所示。 

一种miR-15a靶标位点序列在制备抑制乙型肝炎病毒复制药物中的应用，其步骤是： 

首先将miR-15a mimic/miR-15a inhibitor以及mimi-nc/inhibitor-nc用lipofectamine2000将它们转入HepG2细胞中，24h之后再将质粒pCMV-flag-HBx，pCMV-flag-HBx-mut通过lipofectamine2000脂质体试剂转染进入到细胞中，48小时后进行以下操作： 

所述的mimi-nc的序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’； 

inhibitor-nc的序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。 

(1)蛋白样品的制备： 

首先吸取培养板孔内的培养基（以24孔板为例），然后用预冷的PBS洗涤细胞（重复2-3次），接着每孔加入100ul1×细胞裂解buffer，冰上裂解5min，最后用移液枪将细胞裂解 液移入1.5ml离心管之后，沸水煮沸5-10min，短暂离心之后-20℃保存。 

(2)SDS-PAGE电泳： 

首先配制12%（v/v）的聚丙烯酰胺胶，取上述蛋白样品10ul上样，80V电泳20min,也就是样品进入分离胶之后，将电压调制100V，电泳约1h，等到电泳至溴酚蓝刚跑出即可停止电泳。 

(3)转膜： 

100V恒压转膜90min; 

(4)封闭： 

5%（m/v）脱脂奶粉封闭; 

(5)一抗室温孵育60-90min; 

(6)TBST buffer洗涤2-3次每次15min; 

(7)二抗室温孵育60min; 

(8)TBST buffer洗涤2-3次每次15min; 

(9)化学发光，显影，洗片。 

检测结果显示：当转染了miR-15a mimic时，用western blot检测HBx的蛋白水平与对照组相比较来说下降的，而当转染了miR-15a inhibitor时，HBx的蛋白水平与对照组相比较来说是上升；然而转染了miR-15a mimic或miR-15a inhibitor时，HBx-mut其蛋白水平与对照组相比较并没有发生什么变化。由此可以看出miR-15a确实可以下调HBx蛋白的水平。 

与现有技术相比，本发明具有以下优点： 

1.本发明提供一种miR-15a靶标位点序列，为医学领域中研发新的治疗因乙型肝炎病毒引发的一些相关疾病的抗病毒药物提供了一个新的药物靶点，同时也给研发抗其它病毒的药物，例如丙肝，艾滋病毒等一些相关的提示。 

2.本发明miR15a可以抑制人乙肝病毒的复制，由于microRNA本身是由细胞自身表达产生的，所以相比较其他人工合成而非细胞自身合成的药物可能对细胞的毒害性较小，效果要好。其次本发明发现了miR-15a的靶标，将可能为医学领域中研发新的治疗因HBV病毒引发的一些相关疾病的抗病毒药物又提供了新的药物靶标和治疗方法。 

附图说明

图1为一种microRNA效应蛋白AGO2及其加工蛋白Dicer的敲低后HBV的复制情况示意图。 

图1A敲除Ago2和Dicer之后，对HBV复制的影响； 

图1B荧光定量PCR检测Ago2和Dicer的敲除效果。 

图2为一种miR-15a对HBV病毒复制的影响示意图。 

图2A为过量表达或阻断miR15a的表达水平后，对HBV抗原分泌的影响； 

图2B为过量表达或阻断miR15a的表达水平的检测； 

图2C为过量表达或阻断miR15a的表达水平呈现浓度梯度后，对HBV抗原分泌的影响； 

图2D为过量表达或阻断miR15a的表达水平呈现浓度梯度的检测。 

图3为一种预测的在HBV基因组上miR-15a的靶标及其配对情况示意图。 

其中表示为miR-15a target从左至右每个位点对应的4个targets：2645-2666，2677-2698，2686-2707，2900-2921,其中前三位点位于HBp CDS区域，最后一个位点位于HBp和HBx相互重叠的区域； 

图3A HBV四个基因编码区结构示意图以及预测的四个miR15a靶定的作用位点的分布； 

图3B Target scan预测miR15a靶定的作用位点。 

图4为一种运用双荧光报告系统鉴定miR-15a的靶标的示意图。 

图4A miR15a影响含有SEQ ID No.1序列的PRL-HBx的荧光素酶的活性； 

图4B miR15a影响含有突变的SEQ ID No.1序列的PRL-HBx-mut的荧光素酶的活性。图5为一种western blot检测miR15a对外源表达的带有Flag标签的HBX蛋白和其突变体的影响示意图。 

图6为一种荧光报告系统鉴定所用到的质粒示意图。 

将含有miR-15a的潜在位点序列插入到Renilla的CDS区域，位于终止密码子之前。 

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。 

实施例1：knock-down miRNA’s pathway中的蛋白组分Ago2和Dicer对HBV的复制的影响。 

knock-down Ago2和Dicer的siRNA如下：（上海吉玛生物有限公司） 

si Ago2：5’-GCACGGAAGUCCAUCUGAATT-3’； 

si Dicer：5’-UGCUUGAAGCAGCUCUGGA-3’。 

本发明所用质粒pCH9-3091（NassalM.The arginine-rich domain of the hepatitis B virus core protein is required for pre-genome encapsidation and productive viral positive strand DNA synthesis but not for virus assembly[J].J Viro,l1992,66(7):4107-4116.）中包含有HBV的全基因组，将该质粒转染到HepG2细胞48h之后，就会产生HBV病毒颗粒。 

一、转染siRNA和质粒pCH9-3091： 

以下转染操作以24孔板为例，转染全过程必须严格无菌操作。 

1.首先将1ul siAgo2或siDicer(40nM)用50ul Opti-MEM培养基混合均匀，切记混合时要轻柔一些，此混合物称为mix-1。 

2.使用50ul Opti-MEM培养基稀释1.5ul lipofectamine2000（Invitrogen公司）试剂,室温放置5分钟，切记混合时要轻柔，此混合物称为mix-2。 

3.将混合物1(mix-1)和混合物2(mix-2)混合均匀，混合时轻柔一些，然后室温下放置20分钟，此混合物称为mix-3。 

注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。Lipofectamine2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间不应该太长，这样会降低活性，保温20分钟最好，范围20-35分钟之内。 

4.用胰酶消化HepG2细胞(上海细胞与生化研究所）并计数，然后将细胞接种于24孔板中，细胞密度大约为30%-40%,然后将步骤三中的混合物3(mix-3)慢慢地加入到每个细胞孔内。然后轻轻地摇匀。 

5.然后放在37℃培养箱中培养至第二天，使其转染质粒pCH9-3091前的细胞密度为85－90%，然后转染质粒pCH9-3091。 

6.将0.4ug pCH9-3091用50ul Opti-MEM培养基混合均匀，切记混合时要轻柔一些。 

7.将1ul lipofectamine2000用50ul Opti-MEM培养基混合均匀，切记混合时要轻柔一些，室温放置5分钟。 

8.步骤6和7中的两个混合物充分混匀，混合时要轻柔，然后室温放置20分钟。 

9.直接将步骤8中混合物加入到步骤5中已经转染过si-Ago2或si-Dicer的细胞中，轻轻地摇动培养板，然后放置在37℃，5%的CO2培养箱中培养48-96小时。 

10.收集细胞样品。 

二、通过Q-PCR检测Ago2和Dicer的敲除效果： 

1．Q-PCR检测Dicer和Ago2的敲除效果： 

（1）RNA的提取： 

在转染48h之后，收集培养基，用于下一步检测HBV抗原的分泌，然后加入TRIZOL（1ml TRIZOL/10cm²细胞），室温放置5min； 

按200ul氯仿/ml TRIZOL加入氯仿，振荡混匀4℃放置10min，4℃12000rpm离心 15min。 

吸取上层溶液于新的离心管中，按0.5ml异丙醇/ml TRIZOL加入异丙醇，振荡混匀，室温放置4℃放置10min，4℃12000rpm离心10min。 

倒掉上清，加入1ml75%（体积比）乙醇，温和振荡离心管，4℃8000g离心10min（重复二到三次）。 

弃掉上清，待酒精挥发，加入30ul含DEPC的ddH2O溶解RNA,并定量。 

（2）基因组RNA的消解： 

37℃温育30min，65℃失活10min。 

（3）逆转录反应（RT） 

70℃温育5min，冰上放置3-5min之后加入1ul M-MLV逆转录酶（promega公司），42℃反应1h，65℃失活10min。 

以合成的cDNA为模板进行PCR： 

总反应体积为20ul。 

然后设置普通PCR反应，检测cDNA的质量。反应体系：95℃5min，94℃30s，60℃30s， 72℃30s,32cycles。 

(4)荧光定量PCR（real-time PCR）： 

将上述所制备的cDNA进行定量扩增。 

反应体系为20ul：SYBR premix Ex Taq10ul，primer mix0.5ul，模板0.5ul，超纯水9ul。扩增条件：94℃2min，94℃15s，60℃20s，72℃25s40个循环。Dicer的RNA的定量引物为：DicerF：tgacttgctatgtcgccttg；DicerR：tagtcccaaaatgcgaggac；Ago2的RNA的定量引物为：Ago2F，CGCGTCCGAAGGCTGCTCTA；Ago2R：TGGCTGTGCCTTGTAAAACGCT；内参为actin，其定量的引物为actinF：cgtggacatccgcaaagac；actinR：tggaaggtggacagcgaggc。反应结束后，采用Rotors gene自带的软件进行数据分析。 

进行相对定量：分析的结果显示Ago2和Dicer的敲除效果达到80%左右。 

三、用酶联免疫法检测HBV分泌的HbsAg和HbeAg(KHB乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒购于上海华科生物有限公司)： 

首先在微孔反应板上的每个空中加入50ul细胞培养液（实施例1步骤二、1（1）中收集的培养液），然后在每个孔加入50ul酶结合物（KHB乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒中结合HBe和Hbs的底物），充分混匀，封板，37℃孵育30-60min。弃去孔内液体，用洗涤液注满各个孔，静止5-10s，甩干，重复5次后拍干。每孔加入显色剂A液和显色剂B液（KHB乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒中与酶结合物特异性地结合）各50ul，充分混匀，封板，37℃孵育15min每孔加入终止液50ul，充分混匀。 

用酶标仪读数（选用双波长的酶标仪比色检测波长为450nm，参考波长为630nm） 

结果如图1所示，microRNA效应蛋白AGO2及其加工蛋白Dicer的敲低造成HBV病毒复制的增强，说明microRNA会抑制HBV的复制。 

实施例2：将化学合成的miR-15a mimic和miR-15a inhibitor和质粒pCH9-3091分别混合，通过lipofectamine2000脂质体试剂转染进入到HepG2细胞中，经2-3天后，通过酶联免疫法检测HBV分泌的HbsAg和HbeAg。 

转染过程和条件与实施例1相同。miR-15a mimic的序列为：5’-uagcagcacauaaugguuugug-3’；miR-15a inhibitor的序列为：5’-cacaaaccauuaugugcugcua-3。 

RT-PCR的过程与条件与实施例1相同。miR-15a的逆转录引物： 

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCACAAACC； 

miR5a的定量引物为：miR-15aF，TAGCAGCACATAATGGTTTGTG；miR5aR： TGCGTGTCGTGGAGTC； 

内参为actin，其定量的引物为actinF：cgtggacatccgcaaagac；actinR：tggaaggtggacagcgaggc。反应结束后，采用Rotors gene自带的软件进行数据分析。 

HbsAg和HbeAg的检测方法与实施例1中相同(KHB乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒) 

结果如图2所示，高表达miR-15a，将会导致HBV的S抗原和E抗原的分泌降低，反之阻断miR-15a，将会导致HBV的S抗原和E抗原的分泌升高，说明miR-15a可以抑制HBV的复制，并具有浓度依赖性。 

实施例3：预测miR-15a在HBV的p区域有miR15a靶定的序列。 

采用生物学软件Target scan(Lewis et al.,2005)预测在HBV基因组上的miR5a的靶标序列，结果如图3所示：用上述所提到的软件在HBV基因组上预测到4个miR-15a潜在的靶标位点，其具体位置如下，在HBp的CDS区域有三个位点，具体在HBV基因组上的位置分别是：2645-2666bp，2677-2698bp和2686-2707bp。第四个位点位于HBp和HBx的重叠区域，具体在HBV基因组上的位置为2900-2921bp，本发明将对此靶标位点进行确定，并制备含有该靶标位点的突变载体PRL-HBX-mut，该载体在HBx区域潜在靶标位点进行相应的碱基突变，具体如图中箭头所示：T to G,T to C。 

实施例4：HBV中miR-15a靶标序列的确定。 

构建了4个克隆：pRL-HBX，PRL-HBX-mut，pCMV-flag-HBx，pCMV-flag-HBx-mut，引物分别如下： 

pRL-HBXR：GAGCTCTGGTGGTCTCCATGCGACGTG; 

pRL-HBXF：CATATGACTCTCTCGTCCCCTTCTCC; 

pCMV-flag-HBxF：gggaattcatggctgctaggctgtgct； 

pCMV-flag-HBxR：GGGTCGACTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTT； 

pCMV-flag-HBx-mutF：cgcggactccccgtgtctgccttctcatctgccggaccg； 

pCMV-flag-HBx-mutR：cggtccggcagatgagaaggcagacacggggagtccgcg； 

1.PRL-HBX，PRL-HBX-mut，pCMV-flag-HBx和pCMV-flag-HBx-mut质粒的构建。 

（1）pCMV-flag-HBx质粒的构建：首先以pCH9-3091为模板，加入引物pCMV-flag-HBxF，pCMV-flag-HBxR进行PCR扩增。 

PCR扩增体系： 

模板：pCH9-3091（300-450ng/ul，1:100体积比稀释）    0.5ul 

总反应体积为20ul。 

扩增条件：94℃5min， 

94℃15s， 

60℃30s， 

72℃45s 

32cycles 

72℃2min 

连接，转化，并鉴定阳性克隆，得到重组质粒pCMV-flag-HBx。 

（2）pCMV-flag-HBx-mut质粒的构建： 

将上述步骤（1）中获得的pCMV-flag-HBx为模板，加入引物pCMV-flag-HBx-mutF，pCMV-flag-HBx-mutR进行PCR扩增。 

PCR扩增体系： 

模板：pCMV-flag-HBx（300-450ng/ul，1:100体积比稀释）    0.5ul 

总反应体积为50ul。 

扩增条件：95℃30s 

95℃30s， 

55℃1min， 

68℃9min 

24cycles 

连接，转化，并鉴定阳性克隆，得到重组质粒pCMV-flag-HBx-mut。 

（3）PRL-HBX质粒的构建： 

首先以pCMV-flag-HBx为模板，加入引物pRL-HBXR,pCMV-flag-HBxR进行PCR扩增。 

PCR扩增体系: 

模板：以pCMV-flag-HBx为模板（300-450ng/ul，1:100体积比稀释）    0.5ul 

总反应体积为20ul。 

扩增条件：95℃3min， 

95℃30s， 

658℃30s， 

72℃30s 

29cycles 

72℃2min 

连接，转化，并鉴定阳性克隆，得到重组质粒PRL-HBX，该质粒含有HBp和HBx的重叠区域的miR-15a潜在位点序列。 

（4）PRL-HBX-mut质粒的构建： 

模板为pcMV-HBx-Flag-mut，其他与步骤（3）相同，制得的质粒PRL-HBX-mut含有HBp和HBx的重叠区域miR-15a潜在位点序列的突变序列（突变碱基如图3B所示）。 

2.双荧光报告系统检测： 

（1）首先将miR-15a mimic/miR-15a inhibitor以及mimi-nc/inhibitor-nc用lipofectamine2000将它们转入HepG2细胞中，24h之后再将质粒pRL-HBX/PRL-HBX-mut和PGL3-pro（购于promega公司）通过lipofectamine2000脂质体试剂转染进入到细胞中。 

所述mimi-nc的序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’； 

inhibitor-nc的序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。 

（2）细胞经转染48h之后，吸取空内的培养基，然后用预冷的PBS洗涤细胞2-3次，主要是洗掉一些未贴壁的细胞和残留的培养基。最后每孔加入100ul细胞裂解液(购买于promega公司)。 

（3）室温条件下放置在摇床上摇动混匀15min。 

（5）用荧光素酶检测试剂盒（购买于promega公司）在酶标仪测定荧光值（firefly luciferase activity和Renilla luciferase’s activity），其中相对荧光素酶活性=Renilla luciferase’s activity/firefly luciferase activity。 

检测结果显示：当转染了miR-15a mimic时，pRL-HBx的相对荧光素酶活性与对照组相比较来说下降，而当转染了miR-15a inhibitor时，pRL-HBx的荧光素酶活性与对照组相比较来说是上升；然而针对pRL-HBx-mut而言，转染了miR-15a mimic或miR-15a inhibitor时，其相对荧光素酶活性与对照组相比较并没有发生什么变化。由此可以看出突变位点确实为miR-15a真正的靶标位点。 

3.western blot检测miR15a对外源表达的带有Flag标签的HBX蛋白和其突变体的影响： 

首先将miR-15a mimic/inhibitor以及mimi-nc/inhibitor-nc用lipofectamine2000将它们转入HepG2细胞中，24h之后再将质粒pCMV-flag-HBx，pCMV-flag-HBx-mut通过lipofectamine2000脂质体试剂转染进入到细胞中，48小时后进行以下操作： 

(1)蛋白样品的制备： 

首先吸取培养板孔内的培养基（以24孔板为例），然后用预冷的PBS洗涤细胞（重复2-3次），接着每孔加入100ul1×细胞裂解buffer，冰上裂解5min，最后用移液枪将细胞裂解液移入1.5ml离心管之后，沸水煮沸5-10min，短暂离心之后-20℃保存。 

(2)SDS-PAGE电泳： 

首先配制12%的聚丙烯酰胺胶，取上述蛋白样品10ul上样，80V电泳20min,也就是样品进入分离胶之后，将电压调制100V，电泳约1h，等到电泳至溴酚蓝刚跑出即可停止电泳。 

(3)转膜： 

100V恒压转膜90min 

(4)封闭： 

5%脱脂奶粉封闭。 

(5)一抗室温孵育60-90min。 

(6)TBST buffer洗涤2-3次每次15min。 

(7)二抗室温孵育60min。 

(8)TBST buffer洗涤2-3次每次15min。 

(9)化学发光，显影，洗片。 

检测结果显示：当转染了miR-15a mimic时，用western blot检测HBx的蛋白水平与对照组（转染了mimic-nc）相比较来说下降的，而当转染了miR-15a inhibitor时，HBx的蛋白水平与对照组（转染了inhibitor-nc）相比较来说是上升；然而转染了miR-15a mimic或miR-15a inhibitor时，HBx-mut其蛋白水平与对照组相比较并没有发生什么变化。由此可以看出miR-15a确实可以下调HBx蛋白的水平。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  一种miR-15a靶标位点序列及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用

 

<130>  一种miR-15a靶标位点序列及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  hepatitis B virus

 

<400>  1

acgcggactc cccgtctgtg cc                                              22