人静脉注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ检测方法

摘要

本发明人静脉注射免疫球蛋白中制品中活化凝血因子XI检测方法，①将IVIG样品与一种经特殊预处理的人乏血小板血浆（PPP）混合；②向反应体系中添加含有磷脂剂的凝血酶特异荧光底物；③添加起始因子启动TGT,该起始因子组分包括一种钙离子源、一种磷脂剂；④优化的反应体系获得提供参数的凝血酶生成曲线；⑤受检样品凝血酶含量达到峰值时所需时间TTP与样品中所含FXIa水平呈负有关。将受检样品TTP与FXIa标准品TTP进行比较，可以间接获得受检样品中FXIa的水平。这种活化凝血因子FXIa的检测方法，适用于人静脉注射丙种球蛋白（IVIG）制品中残留的微量FXIa的检测，及用于体外评估相关制品的致栓性风险。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种人静脉注射免疫球蛋白（pH4,Human intravenous immunoglobulin，以下简称IVIG）中活化凝血因子Ⅺ（Activated coagulation factor XI，以下简称FXIa）的检测方法。该法可以精确的检测出IVIG中FXIa的具体含量，灵敏度可达0.12 nmol/L。 

背景技术

IVIG是由乙型肝炎疫苗免疫的健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法提取的免疫球蛋白组分，经深加工和病毒灭活等步骤精制而成。IVIG具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床使用广泛。近年来随着IVIG临床使用数量的增加，该制品输注人体后产生的不良反应事件也逐渐增加，危害严重。研究表明，此类血液制品中残存的微量凝血激活物—FXIa是导致患者发生血栓的主要诱因。目前国际尚未出台关于IVIG致栓性的强制检测规定。 

目前《中国药典》2010年版 三部附录IX O规定，非活化的部分凝血活酶时间（Non-activated partial thromboplastin time,以下简称NAPTT法）可用于定性检测血液制品（如凝血因子浓缩物）中有无活化凝血因子。其检测原理是将待检测样本加入到枸橼酸抗凝的正常人血浆中，再加入一定浓度的磷脂、Ca²⁺后测定样品凝块形成时间。目前该方法存在以下不足：①仅能定性，无法实时监测样品中凝血酶生成过程的变化；②仅能通过样品凝固时间判定结果，人为因素影响较大，无法准确测定样品中活化凝血因子的具体含量。 

传统NAPTT法的操作步骤为：（1）制备缺血小板人血浆（Platelet-poor plasma,以下简称PPP）：无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂（9：1）中，混匀，以1500转/分钟， 4℃离心30min。用塑料注射器取上层2/3血浆，以3500转/分钟，4℃离心30min，取上层2/3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保存-40℃备用；（2）将PPP与脑磷脂悬液混合，37℃放置1分钟，加经稀释的供试品溶液0.1ml，然后加入已预热至37℃的0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。同时做空白对照。结果判定：空白对照凝固时间不低于200s，实验成立。1：10和1：100供试品稀释液凝固时间应不低于150s。 

基于上述因素，本发明通过优化反应体系和反应条件，建立基于凝血酶生成试验（Thrombin generation test,以下简称TGT）法检测IVIG中FⅪa的新方法，该方法具有良好的重复性，可准确定量检测样品中FⅪa的含量，进一步减少了人为误差，有效确保了试验结果的真实性和可靠性。 

  

发明内容

本发明的目的是克服现有检测技术所存在的上述不足，建立一种准确度好、灵敏度高的基于TGT法检测IVIG中FXIa的方法，该方法适用于IVIG制品中微量FXIa的检测。 

本发明的操作步骤与NAPTT法不一致，其技术解决方案为： 

（1）枸橼酸钠抗凝血浆中加入玉米胰蛋白酶抑制物，可特异、有效地避免因在采血过程中凝血因子Ⅺ的预活化，从而得到不含FⅪa的血浆，从而分离制备出不含FⅪa的PPP；

(2）反应体系中加入凝血酶特异性荧光底物，特异的凝血酶荧光底物以及磷脂剂浓度的确定：凝血酶特异性荧光底物选择B-VA-AMC,对不同浓度底物进行筛选，其中底物工作浓度为1~7mmol/L；磷脂剂选则脑磷脂，选择工作浓度为1~3.5μmol/L；利用分光光度计连接计算机对凝血过程进行扫描，通过荧光信号强弱，可间接反映凝血酶生成含量变化，最后绘制动力学曲线；

（3）不同含量的FⅪa标准品或IVIG样本中加入含磷脂剂的凝血酶荧光底物以及钙离子源启动凝血酶生成反应，反应结果通过荧光分光光度计监测凝血酶生成过程中荧光值的变化，最后使用GraphPad软件处理数据得到凝血酶生成曲线，将受检样品的凝血酶生成浓度达到峰值所需的时间（Peak time of thrombin，以下简称TTP）与FⅪa标准品的TTP进行比较，可以间接获得受检样品中FⅪa的水平。

本发明的有益效果：①将IVIG样品与一种经特殊预处理的人PPP混合；②向反应体系中添加含有磷脂剂的凝血酶特异荧光底物；③添加起始因子启动TGT,该起始因子组分包括一种钙离子源、一种磷脂剂；④对优化的反应体系进行TGT,获得提供参数的凝血酶生成曲线；⑤受检样品TTP与样品中所含FXIa水平呈负有关。将受检样品TTP与FXIa标准品TTP进行比较，可以间接获得受检样品中FXIa的水平。本发明是以TGT为原理,建立一种稳定、特异、灵敏的FXIa的检测方法，该法适用于IVIG制品中残留的微量FXIa的检测，可用于体外评估相关制品的致栓性风险。 

  

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。 

1. 制备不含FXIa的PPP 

血浆使用静脉穿刺法采自健康献血者。1:9比例的枸橼酸钠抗凝血浆中加入浓度为40-150μg/ml玉米胰蛋白酶抑制物,混匀，然后4℃离心,1500转/分钟,30min。用塑料注射器取上层2/3血浆，以3500转/分钟，4℃离心30分钟，取上层2/3血浆，分装于塑料管中，每支2ml， -40℃保存备用； 

2.建立基于TGT的FXIa检测方法

（1）优化底物浓度

选择凝血酶特异性荧光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL，可以稳定、特异地反映TGT生成过程的变化。凝血酶特异性荧光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL难溶于Hepes缓冲液，所以操作过程中先用1/50体积的二甲基亚砜充分溶解，再用Hepes缓冲液稀释至所需要的体积。不同浓度的底物对TGT有直接影响，故对凝血酶特异性荧光底物Boc-Val-Arg-AMC.HCL浓度进行优化。底物浓度为1～7mmol/L时，凝血酶生成时间和荧光信号较合适。

（2）优化磷脂剂浓度 

   含有凝血酶特异性荧光底物的反应缓冲液中还应添加一定浓度的磷脂剂，才能使得凝血酶生成反应得以进行，磷脂剂选择常规凝血实验中使用的脑磷脂，考察不同浓度脑磷脂对凝血酶生成的影响，表明脑磷脂浓度对凝血酶生成影响不大，选择Veena C.等[Haematologica joural of hematology 2003 88(05)547-554]所使用的1～3.5μmol/L。

3.利用已建立的FⅪa检测方法，比较不同含量的FXIa标准品对TGT影响 

配制不同浓度的FⅪa标准品，利用2中已建立的基于TGT的FⅪa检测方法，比较不同含量的FXIa标准品对凝血酶生成影响，试验所得的数据经GrapgPad Prism作图软件中的enzymekinetics-Michaelis Menten数据模式处理后，以时间为X轴、荧光变化值（第n+1次荧光值-第n次荧光值）为Y轴得到平滑的凝血酶生成动力学曲线，从图可以进行计算。  

4. IVIG样本中FXIa含量的检测 

    利用2中已建立的基于TGT的FXIa检测方法，比较不同IVIG样本中FXIa对凝血酶生成的影响。受检样品的TTP与样品中所含FXIa水平有关。将受检样品的TTP与FXIa标准品的TTP进行比较，可以间接获得受检样品中FXIa的水平。 

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。 

缩略词对照表

缩写英文名称中文名称IVIGHuman intravenous immunoglobulin人静脉注射免疫球蛋白FXIaActivated coagulation factor XI活化凝血因子ⅪNAPTTNon-activated partial thromboplastin time非活化的部分凝血活酶时间PPPPlatelet-poor plasma缺乏血小板血浆TGTThrombin generation test凝血酶生成试验TTPPeak time of thrombin凝血酶生成浓度达到峰值所需的时间