特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应用

摘要

本发明公开了一种特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应用。本发明所提供的标准分子为环状载体，包括如序列1的第10-101位所示的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、如序列1的第256-336位所示的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、如序列1的第191-258位所示的水稻内源基因GOS片段，以及如序列1的第108-184位所示的Ti质粒T-DNA的边界序列片段。实验证明，本发明所提供的标准分子具有较高的灵敏度，其最低检测线可达2拷贝，线性范围广，均匀性好，稳定性强，对于转基因水稻品系科丰6号的定性和定量检测具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应用。

背景技术

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，是世界上食用人口最多、历史最 悠久的农作物。随着生物技术的发展，转基因技术正广泛地应用于农作物品质改良， 已有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。科丰6号是转双价抗虫 基因的转基因水稻品系，所导入外源基因是Bt/CpTI。

在转基因检测时，必须使用标准物质作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因 产品进行准确检测。标准质粒分子是近几年发展起来的一种可替代植物基因组的一种 重组质粒分子，一般包括物种特异性片段和转基因作物检测的外源基因或品系特异性 片段。优点是生产成本低，质粒DNA的纯度高，产量大，制作和应用更为灵活，可 以人为设计携带多个外源基因，使其应用更为广泛。目前，已经成功应用于转基因大 豆棉花和玉米等的定量检测，而且目前标准质粒分子已经获得了国际协同认证。

目前尚未有针对转基因水稻品系科丰6号进行特异性检测的质粒标准分子的相关 报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应 用。

本发明所提供的特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子具体为环状载 体。所述环状载体具体包括豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因（CpTI基因）片段、苏云金 芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因（Bt基因）片段、水稻内源基因GOS片段，以及Ti 质粒T-DNA的边界序列（如右边界序列RB）片段。

在本发明中，所述豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段的序列具体可如序列表中序 列1的第10-101位所示；

所述苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段的序列具体可如序列表中序列1 的第265-336位所示；

所述水稻内源基因GOS片段的序列具体可如序列表中序列1的第191-258位所 示；

所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段的序列具体可如序列表中序列1的第108-184 位所示。

进一步，所述环状载体为将所述豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、所述苏云金 芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、所述水稻内源基因GOS片段、所述Ti质粒 T-DNA的边界序列片段一同与pEASY-T3质粒相连后得到的重组载体。

更加具体的，所述环状载体为将如序列表中序列1所示的DNA片段与所述 pEASY-T3质粒连接所得的重组载体。

所述环状载体在作为标准分子检测转基因水稻品系科丰6号中的应用也属于本发 明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种定性或定量检测转基因水稻品系科丰6号的试剂 盒。

本发明所提供的试剂盒，具体由所述环状载体和如下（a1）-（a4）中的全部或部 分组成：

（a1）由序列表中序列2和序列3所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序 列如序列表中序列4所示的探针；（用于扩增CpTI基因片段）

（a2）由序列表中序列5和序列6所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序 列如序列表中序列7所示的探针；（用于扩增Bt基因片段）

（a3）由序列表中序列8和序列9所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序 列如序列表中序列10所示的探针；（用于扩增水稻内源标准基因GOS片段）

（a4）由序列表中序列11和序列12所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸 序列如序列表中序列13所示的探针。（用于扩增RB片段）

以上（a1）-（a4）中，所述探针可为TaqMan荧光探针。TaqMan荧光探针是一 种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭荧光基团连接在探针的3’ 末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将 探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧 光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。

所述报告荧光基团可为Fam（FAM）、Hex(HEX)、Tet(TET)、Joe(JOE)、Vic(VIC)、 Fite(FITE)、Cy3(CY3)或Cy5(CY5)。所述淬灭荧光基团可为Tamra（TAMRA）、 Rox(ROX)、Dabcy(DABCY)、Bhq1(BHQ1)或Bhq2(BHQ2)。在本发明中，所述探针5’ 端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端标记的淬灭荧光基团具体为 TAMRA荧光基团。

所述试剂盒在作为标准体系检测转基因水稻品系科丰6号中的应用也属于本发明 的保护范围。

制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。

该方法具体可包括如下步骤：将所述试剂盒中的所述环状载体、各引物对和各探 针分别单独包装。

本发明所提供的特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子包含外源基因 CpTI和Bt、内参基因GOS及边界序列部分区段。实验证明，本发明所提供的标准分 子具有较高的灵敏度，其最低检测线可达2拷贝，线性范围广，均匀性好，稳定性强， 对于转基因水稻品系科丰6号的定性和定量检测具有重要意义。

附图说明

图1为标准分子pEASY-KF6质粒阳性克隆的PCR筛选结果。其中，泳道M为 DL2000DNA分子量标准；泳道1为阳性对照；泳道2-24为23个标准分子pEASY-KF6 质粒克隆。

图2为标准分子pEASY-KF6的质粒构建图。实际上，对于插入片段，在“CpTI 基因”前还有GCG-Hind III；在“Bt基因”后还有XbaⅠ-GCG。

图3为各引物和探针特异性检测结果。其中，A为外源基因CpTI的特异性检测 结果：1表示转基因水稻品系科丰6号（GMO+）；B为外源基因Bt的特异性检测结果： 1表示转基因水稻品系科丰6号（GMO+），2表示转基因水稻品系Bt63，3表示转基 因棉花（转Bt抗虫基因）品系中棉41；C为内参基因GOS的特异性检测结果：1表 示转基因水稻品系科丰6号（GMO+），2表示非转基因水稻品系明恢86（GMO-），3 表示转基因水稻品系Bt63；D为边界序列（品系特异性）的特异性检测结果：1表示 转基因水稻品系科丰6号（GMO+）。

图4为标准体系的灵敏度及标准曲线测定。其中，a为外源基因CpTI的灵敏度及 标准曲线测定；b为外源基因Bt的灵敏度及标准曲线测定；c为内参基因GOS的灵敏 度及标准曲线测定；d为边界序列（品系特异性）的灵敏度及标准曲线测定。a-d中， A-H均表示所检测的模板（标准分子pEASY-KF6）的用量，A为1.5×10⁷拷贝，B为 1.5×10⁶拷贝，C为1.5×10⁵拷贝，D为1.5×10⁴拷贝，E为1.5×10³拷贝，F为1.5×10²拷贝，G为1.5×10¹拷贝，H为1.5×10⁰拷贝。a-d中，标准曲线的横坐标均表示起始 拷贝数的对数，纵坐标均表示Ct值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pEASY-T3载体：北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CT301。

转基因水稻品系科丰6号（GMO+）（转CpTI基因水稻）：中国检验检疫科学研究 院；戎俊，宋志平，苏军，夏辉，王锋，卢宝荣.Bt/CpTI转基因稻及其非转基因亲本 对照在间隔种植条件下的转基因漂移.生物多样性,2006,14(4):309–314。科丰6号由 中国水稻研究所王渭霞提供，是1994年由福建省农业科学院生物技术研究所王锋和中 国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯共同培育的。

转基因水稻品系Bt63：中国检验检疫科学研究院；赵卫东,郑文杰,贺艳.荧光 PCR方法定性和定量检测BT63转基因大米[J].食品研究与开发,2009,(03):133-135。

非转基因水稻品系明恢86（GMO-）：中国检验检疫科学研究院；张建新,郑家团, 谢华安,罗家密,黄显波,邓则勤,吴兰英.水稻新种质明恢86及其系列组合的选育研 究[J].植物遗传资源科学,2001,(01)：32-36。

转基因番茄品系华番1号：中国检验检疫科学研究院；黄文胜,陈红运,赵文军,等. 转基因延熟番茄“华番一号”的品系特异性检测方法[J].植物检疫,2005,19(6): 321-325。

转基因棉花（转Bt抗虫基因）品系中棉41：中国检验检疫科学研究院；刘生荣,夏 志明,刘党培.双价抗虫棉中棉所41丰产稳产性及其简化栽培技术研究[J].中国农学 通报,2005,(03)：166-168。

转植酸酶基因玉米品系BVLA430101：中国检验检疫科学研究院；Rumei Chen, Guangxing Xue,Yunliu Fan et al.,Transgenic maize plants expressing a fungal phytase  gene.Transgenic Res(2008)17:633-643。

实施例1、标准分子pEASY-KF6的构建及特异性引物和探针的合成

一、标准分子pEASY-KF6的构建

合成序列表中序列1所示的DNA片段，自5’端至3’端依次为：GCG-Hind III-豇 豆胰蛋白酶抑制剂编码基因（CpTI基因）片段（第10-101位）-BamH I-Ti质粒T-DNA 的右边界序列（右边界序列RB）片段（第108-184位）-BamH I-水稻内源基因GOS 片段（第191-258位）-Hind III-苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因（Bt基因）片 段（第265-336位）-XbaⅠ-GCG。

将上述合成的序列表中序列1所示的DNA片段以T-A克隆的方式与pEASY-T3 载体相连，以连接产物转化大肠杆菌，对重组菌悬液采用引物KF-F和KF-R进行PCR 检测。同时以合成的序列表中序列1所示的DNA片段为模板作为阳性对照。

KF-F：5'-GCGAAGCTTGATGACTCAAGCGATGAACC-3'（序列1的第1-29位）；

KF-R：5'-CGCTCTAGATTCTGGACTGCGAACAATGG-3'（序列1的第317-345 位的反向互补序列）。

结果如图1所示，PCR检测的23个克隆均为阳性。进一步对阳性克隆送样测序。 经测序表明正确连入序列表中序列1所示DNA片段的pEASY-T3载体为阳性，将其命 名为pEASY-KF6（图2）。所得重组载体pEASY-KF6即为标准分子。

二、特异性引物和探针的合成

根据上述步骤一中合成的序列表中序列1所示的DNA片段，针对各基因设计如 表1中所示的各特异性引物和探针。

表1科丰6号引物探针序列

步骤一中的标准分子pEASY-KF6和步骤二中的特异性引物和探针共同构成用于 定性或定量检测转基因水稻品系科丰6号（GMO+）的标准体系。

实施例2、特异性引物和探针的特异性检测

分别以转基因水稻品系科丰6号（GMO+）、非转基因水稻品系明恢86（GMO-）、 转基因番茄品系华番1号、转基因水稻品系Bt63、转基因棉花（转Bt抗虫基因）品 系中棉41及转植酸酶基因玉米品系BVLA430101的总DNA为模板，利用实施例1表 1中的各引物和探针对相应的基因进行实时荧光PCR反应，检测引物探针的特异性。 实验重复3次。

实时荧光PCR反应体系：将12.5μl AB TaqMan Gene Expression Master Mix、5μl DNA模板、5μl灭菌超纯水、1μl正向物、1μl反向引物和0.5μl特异性探针混合，得 到25μl的反应体系；反应体系中，反应初始时，正反向引物的浓度均为0.2μmol/L， 探针的浓度为0.1μmol/L。

实时荧光PCR反应参数：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min， 共40个循环。

反应结束后根据扩增曲线判定结果。

结果如图3所示，检测外源基因CpTI的引物探针只在转基因水稻品系科丰6号 （GMO+）有信号，在其他材料中均无信号；检测外源基因Bt的引物探针在转基因水 稻品系科丰6号（GMO+）、转基因水稻品系Bt63及转基因棉花（转Bt抗虫基因）品 系中棉41上有信号；检测内参基因GOS的引物探针只在转基因水稻品系科丰6号 （GMO+）、非转基因水稻品系明恢86（GMO-）和转基因水稻品系Bt63中有信号； 检测边界序列（品系特异性）的引物探针只在转基因水稻品系科丰6号（GMO+）中 有信号，在其他材料中均无信号。以上结果证明表1中的各引物和探针同其他作物及 转基因作物等无假阳性反应。

实施例3、标准体系的灵敏度检测及标准曲线线性范围检测

将实施例1构建的标准分子pEASY-KF6调整浓度至3×10⁹拷贝/μl，再按浓度梯度 10倍稀释，稀释为从3×10⁶拷贝/μl至3×10^-1拷贝/μl共8个梯度，利用实施例1表1 中的各引物和探针对相应的基因进行实时荧光PCR反应，从而测定由标准分子、特异 引物探针组成的标准体系的灵敏度和标准曲线的线性范围。实验重复3次，结果取平 均值。

实时荧光PCR反应体系：将12.5μl AB TaqMan Gene Expression Master Mix、5μl DNA模板、5μl灭菌超纯水、1μl正向物、1μl反向引物和0.5μl特异性探针混合，得 到25μl的反应体系；反应体系中，反应初始时，正反向引物的浓度均为0.2μmol/L， 探针的浓度为0.1μmol/L。

实时荧光PCR反应参数：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min， 共40个循环。

结果如图4所示，由标准分子、特异引物探针组成的标准体系的最低检测线可达 2拷贝（理论值为1.5拷贝）。利用引物CpTI-F和CpTI-R以及探针CpTI-P对外源基 因CpTI进行实时荧光PCR检测所得的标准曲线方程为y=-3.4961x+35.677，R²=0.9986； 利用引物Bt-F和Bt-R以及探针Bt-P对外源基因Bt进行实时荧光PCR检测所得的标 准曲线方程为y=-3.3786x+34.085，R²=0.997；利用引物GOS-F和GOS-R以及探针 GOS-P对内参基因GOS进行实时荧光PCR检测所得的标准曲线方程为 y=-3.5146x+35.576，R²=0.9962；利用引物RB-F和RB-R以及探针RB-P对边界序列（品 系特异性）进行实时荧光PCR检测所得的标准曲线方程为y=-3.6206x+36.025， R²=0.9974。上述各标准曲线中的x均表示样品起始拷贝数的对数，y均表示Ct值（即 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）。从以上结果，可以看出， 由标准分子、特异引物探针组成的标准体系具有较高的灵敏度，同时其标准曲线具有 较好的线性范围（R²>0.9962）。

实施例4、标准体系的灵敏度及标准曲线重复性检测

在实施例3的灵敏度检测试验中，每个标准分子pEASY-KF6的浓度梯度重复检测 3次，在三个平行反应中都能检测到信号，并且重复性较好（标准偏差范围为 0.001-0.44）。表2所示为外源基因CpTI及Bt、内参基因GOS以及RB边界序列（品 系特异性）灵敏度检测的重复性分析结果。

表2外源基因、内参基因以及边界序列（品系特异性）灵敏度检测的重复性

实施例5、标准分子pEASY-KF6的均匀性测试

从分装的500管标准分子pEASY-KF6中随机抽取16管进行检测，实时荧光PCR 反应体系和反应程序同实施例3中所述，每个样品重复检测3次，在三个平行反应中 基本都能检测到信号，并且重复性较好。表3为针对标准分子pEASY-KF6的外源基因 CpTI及Bt、内参基因GOS以及RB边界序列（品系特异性）的均匀性检测结果。

表3标准分子外源基因、内参基因以及边界序列（品系特异性）的均匀性检测

注：SD是指所有随机选取的样品，外源基因CpTI或Bt检测的CT值的标准差， 说明随机抽样的16个样品中的均匀性很好。

实施例6、标准分子pEASY-KF6的稳定性测试

一、短期稳定性测试

短期稳定性测试是把分装好的标准分子pEASY-KF6分别放置在-70℃、-20℃、4 ℃、20℃、37℃，在0、3、7、14、21、28天内各取1个样品进行测试。实时荧光PCR 反应体系和反应程序同实施例3中所述。实验设三次重复，结果去平均值。结果如表 4所示，可见标准分子pEASY-KF6具有较高的稳定性。

表4标准分子pEASY-KF6短期稳定性测试结果

注：SD是指所有随机选取的样品，外源基因CpTI或Bt检测的CT值的标准差， 说明在-70℃、-20℃、4℃、20℃和37℃对标准样品的短期稳定性无明显影响。

二、长期稳定性测试

长期稳定性测试是把分装好的标准分子pEASY-KF6放置在-20℃冰箱中，在1、3、 6个月内各取1个样品进行测试。实时荧光PCR反应体系和反应程序同实施例3中所 述。实验设三次重复，结果去平均值。结果如表5所示，可见标准分子pEASY-KF6具 有较高的稳定性，在半年内可保持稳定。

表5标准分子pEASY-KF6长期稳定性测试结果

注：SD是指所有随机选取的样品，外源基因CpTI或Bt检测的CT值的标准差， 说明在-20℃对标准样品的长期稳定性无明显影响。