一种冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群及其制备方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，涉及一种冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群及其制备方法。该冷浸田活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法为：将两种以上的嗜冷性微生物菌种培养液混合接种于营养肉汁培养基，12～15℃下恒温培养至菌种数量达到有效活菌数为1.0×1010CFU/mL以上，得到嗜冷微生物菌群，按重量百分比将3～8%的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，10～15℃下恒温培养使菌种数量达到有效活菌数为1.0×109CFU/mL以上，即得冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。本发明制备的嗜冷性微生物菌群有效防止冷浸田水稻的坐蔸、僵苗现象，促使作物早生快发，减少化肥使用量，有利于节约成本。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群及其制备方法。

背景技术

冷浸田是因长期浸水、土层糊烂与还原作用强烈而造成的一种低产田。全国约有346万hm²，占全国稻田面积的15.07%，占低产稻田面积的44.2%。主要分布在我国南方各省山区谷地、丘陵低洼地段，是南方稻区主要的低产稻田类型之一，稻谷产量每公顷一般不及稻田平均每公顷产量的二分之一。广东省第二次土壤普查的统计表明，当时全省有低产田62.3万hm²，冷浸田占全省低产田面积的14.6%，约9.1万hm²。造成冷浸田低产的主要原因是因水热条件不良，造成土壤微生物活性降低，有机物质矿化率慢，养分有效性低（磷、钾、锌等缺乏造成僵苗），还原性物质多等因素引起。为保证粮食供应的安全和社会的稳定，我国一直将提高水稻单位面积产量作为水稻生产的主要任务。如何针对现有冷浸田土著土壤微生物活性低、有机物质矿化率慢，养分有效性低等特征研发出具有快速矿化土壤有机质，显著活化土壤有效养分的嗜冷性微生物菌群产品是大力发挥中低产田产量潜力的重要途径。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种适用于冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群，此类菌群可以加快低温条件下土壤有机质的快速矿化，增强有效养分的释放与转化，促进水稻对养分的吸收与利用，提高稻谷的产量、改善稻米的品质，有效减少施肥数量、节约生产成本，实现水稻生产的节能增效。

本发明的另一个目的在于提供一种冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种冷浸田活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法，包括以下步骤：将两种以上的嗜冷性微生物菌种培养液混合接种于营养肉汁培养基，12～15℃下恒温培养5～7天至菌种数量达到有效活菌数为1.0×10¹⁰CFU/mL以上，得到嗜冷性微生物菌群，按重量百分比将3～8%的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，10～15℃下恒温搅拌培养8～10天使菌种数量达到有效活菌数为1.0×10⁹CFU/mL以上，即得到冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

所述的嗜冷性微生物菌种培养液的制备方法为：将嗜冷性微生物分别接种于各自相应的富集培养基，在各自最适温度下恒温培养3～5天至菌种数量达到有效活菌数为1.0×10¹⁰CFU/mL以上，得到嗜冷性微生物菌种培养液；

所述的嗜冷性微生物包括嗜冷弧菌（Psychrophicvibrto，布鲁塞尔自由大学微生物研究所2693）、假单胞菌（Pseudomonas，CGMCCNO1.39）、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas，CCTCCM2010239）、嗜冷杆菌（Psychrobacter，ACCC11832）、不动杆菌（Acinetobacter，ATCC15309）、棒状杆菌（Corynebacterium，CICC10053）、色杆菌（Chromobacteriura，ATCC12473）、梭状芽孢杆菌（Clostridium，ATCC19398）、纤维单胞菌（Cellulomonas，ATCC27403）、纤维粘菌（Cytophage，ATCC23178）和酵母菌（Candida santamariae，CGMCCNo2959和Trichosporon akiyoshidainum，CGMCC No3150）。

所述的嗜冷性微生物菌群的附着载体的制备方法为：按重量百分比将40～55%稻壳、18～25%米糠、19～26%蝇蛆粪、5～10%虾壳粉、2～8%豆渣饼混合，添加铵盐调节混合物C/N比为25～30，调节混合物含水量为50～60%，添加重量百分比0.5～3%的菌剂，好氧发酵，添加0.1～2%的无机盐和0.001～0.05%的中微量元素，即得到嗜冷性微生物菌群的附着载体。

所述的铵盐为硫酸铵、硝酸铵、尿素或磷酸氢二铵中的一种以上；

所述的菌剂为Rw酵素剂、VT-400除臭菌剂、VT-1000堆肥接种剂或高温快速堆肥菌剂中的两种以上；

所述的好氧发酵的时间为15～45天；

所述的无机盐为硫酸铵、硫酸镁、尿素或磷酸氢二铵中的一种以上；

所述的中微量元素组成配方为：

一种冷浸田活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法，包括以下步骤：将假交替单胞菌菌种培养液：嗜冷杆菌菌种培养液：酵母菌菌种培养液按照体积比为1:1:0.5混合接种于营养肉汁培养基，15℃下恒温培养5天至菌种数量达到有效活菌数为1.0×10¹⁰CFU/mL以上，得到嗜冷微生物菌群，按重量百分比将3%的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，10℃下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数为1.0×10⁹CFU/mL，即得到冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

一种冷浸田活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法，包括以下步骤：将嗜冷弧菌菌种培养液：假交替单胞菌菌种培养液按体积比为1:1.6混合接种于营养肉汁培养基，12℃下恒温培养6天至菌种数量达到有效活菌数为1.0×10¹⁰CFU/mL以上，得到嗜冷微生物菌群，按重量百分比将5%的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，12℃下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数为1.0×10⁹CFU/mL，即得到冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

一种冷浸田活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法，包括以下步骤：将嗜冷弧菌培养液、嗜冷杆菌培养液、假单胞菌培养液、假交替单胞菌培养液、酵母菌培养液和不动杆菌培养液以任意体积比混合接种于营养肉汁培养基，15℃下恒温培养7天至菌种数量达到有效活菌数为1.0×10¹⁰CFU/mL以上，得到嗜冷微生物菌群，按重量百分比将8%的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，15℃下恒温搅拌培养10天使菌种数量达到有效活菌数为1.0×10⁹CFU/mL，即得到冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

一种冷浸田活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法，包括以下步骤：将棒状杆菌菌种培养液：色杆菌菌种培养液：梭状芽孢杆菌菌种培养液的体积比为1:1.5:2.0接种于富集的营养肉汁培养基，13℃下恒温培养6天至菌种数量达到有效活菌数为1.0×10¹⁰CFU/mL以上，得到嗜冷性微生物菌群，按重量百分比将6%的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，13℃下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数为1.0×10⁹CFU/mL，即得到冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

一种冷浸田活化的嗜冷性微生物菌群的制备方法，包括以下步骤：棒状杆菌菌种培养液：纤维单胞菌菌种培养液：纤维粘菌菌种培养液：酵母菌菌种培养液的体积比为1:1.5:1.0:1.5接种于富集的营养肉汁培养基，13℃下恒温培养6天至菌种数量达到有效活菌数为1.0×10¹⁰CFU/mL以上，得到嗜冷性微生物菌群，按重量百分比将6%的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，13℃下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数为1.0×10⁹CFU/mL，即得到冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

由上述所述的制备方法制备而成的冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

相对于现有技术，本发明的优点在于：

（1）本发明所述的嗜冷性微生物菌群中的菌种间具有较好的共存性，能有效协同发挥各种菌的功能。

（2）本发明的附着载体与嗜冷性微生物菌群的耦合性好，充分利用稻壳的多孔性与机械稳定性为嗜冷性微生物菌群的附着与繁殖提供了良好的微环境。

（3）本发明的嗜冷性微生物菌群能较好适应冷浸田的早春低温环境快速繁殖，加快有机质分解，有效活化土壤库养分，提高土壤供肥水平，促进作物生长，增加作物产量。

（4）使用本发明的产品有效防止冷浸田水稻的坐蔸、僵苗现象，促使作物早生快发，减少化肥使用量，有利于节约成本。

具体实施实例

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例一：

（1）菌种种子液的富集培养：将假交替单胞菌（Pseudoalteromonas CCTCC M2010239）、嗜冷杆菌（Psychrobacter spACCC11832）、酵母菌（Candida santamariae CGMCC No2959）分别接种于相应的富集培养基，在各自最适培养温度下恒温振荡培养4天使菌种数量达到有效活菌数≥2.0×10⁹CFU/mL。

其中，假交替单胞菌富集培养为Zobell2216E培养基（1000mL）：胰蛋白胨5g，酵母粉1g，用过滤陈海水与自来水配制至1000mL，过滤陈海水:自来水=2:1（体积比）。假交替单胞菌的最适培养温度6℃。

嗜冷杆菌富集培养为YPD培养基（1000mL）：胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，脱脂奶粉1.0g，用无菌水配制至1000mL，pH值7.0±0.1。嗜冷杆菌的最适培养温度25℃。

酵母菌富集培养为YPD培养基（1000mL）：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，用无菌水配制至1000mL，pH自然。酵母菌最适培养温度12℃。

（2）嗜冷性微生物菌群的富集培养

将三种增殖培养的嗜冷性菌种培养液混合（假交替单胞菌菌种培养液：嗜冷杆菌菌种培养液：酵母菌菌种培养液的体积比为1:1:0.5）接种于富集的营养肉汁培养基（蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl5g、酵母浸膏0.5g、20％马铃薯提取液20mL、CaCO₃ 0.5g、ZnCl₂ 20mg、FeCl₂·6H₂O100mg，添加蒸馏水至1000mL，并调节pH7.0），在15℃条件下恒温培养5天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/mL，得到嗜冷性微生物菌群。

其中，配制20％马铃薯浸汁方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加蒸馏水1000mL。80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至前体积。100Pa灭菌20min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。

（3）嗜冷性微生物菌群的附着载体制备：按重量百分比将40%稻壳、20%米糠、26%用猪粪饲养蝇蛆产生的蝇蛆粪、6%虾壳粉、8%豆饼渣充分混合均匀，添加硫酸铵和硝酸铵调节混合物C/N至25，用蒸馏水调节混合物含水量为50%，添加重量百分比为0.5%的Rw酵素剂、VT-400除臭菌剂和VT-1000堆肥接种剂混合物（Rw酵素剂：VT-400除臭菌剂：VT-1000堆肥接种剂的重量百分比为1:1:0.8）混匀进行好氧发酵40天至堆肥后熟阶段，得到发酵产物。然后将重量百分比为0.1%硫酸铵、重量百分比为0.001%的硫酸镁均匀添加到发酵产物即得到嗜冷性微生物菌群的附着载体。

（4）冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群的制备：将重量百分比为3%富集培养的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，之后转移至固体发酵箱进行嗜冷性微生物菌群与嗜冷性微生物菌群的附着载体的耦合富集培养，在10℃条件下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10⁹CFU/mL即可。

实施例二：

（1）菌种种子液的富集培养：将嗜冷弧菌（Psychrophicvibrto2693，购自布鲁塞尔自由大学微生物研究所）和假交替单胞菌（Pseudoalteromonas CCTCC M2010239）分别接种于相应的富集培养基，在各自最适培养温度下恒温振荡培养3天使菌种数量达到有效活菌数≥2.0×10⁹CFU/mL。

嗜冷弧菌的富集培养为海洋无机培养基中（此培养基购自ixfcoLabolatories）。嗜冷弧菌的最适培养温度6℃。

假交替单胞菌富集培养为Zobell2216E培养基（1000mL）：胰蛋白胨5g，酵母粉1g，用过滤陈海水与自来水配制至1000mL，过滤陈海水:自来水=2:1。假交替单胞菌的最适培养温度6℃。

（2）嗜冷性微生物菌群的富集培养：将增殖培养的嗜冷性菌种培养液混合（嗜冷弧菌菌种培养液：假交替单胞菌菌种培养液的体积比为1:1.6）接种于富集的营养肉汁培养基（蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl5g、酵母浸膏0.5g、20％马铃薯提取液20ml、CaCO₃ 0.5g、FeCl₂·6H₂O100mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O5mg，添加蒸馏水至1000mL，并调节pH7.1），在12℃条件下恒温培养6天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/mL，得到嗜冷性微生物菌群。

（3）嗜冷性微生物菌群的附着载体的制备：按重量百分比将50%稻壳、18%米糠、21%用猪粪饲养蝇蛆产生的蝇蛆粪、9%虾壳粉、2%豆饼渣充分混合均匀，添加尿素调节混合物C/N至28，用蒸馏水调节混合物含水量为55%，添加重量百分比为1.5%的高温快速堆肥菌剂（购买自北京沃土生物科技有限公司）和VT-400除臭菌剂（购买自北京沃土生物科技有限公司）混合物（高温快速堆肥菌剂：VT-400除臭菌剂的重量百分比为1:1）混匀进行好氧发酵45天至堆肥后熟阶段，得到发酵产物。然后将重量百分比为1%尿素、重量百分比为0.02%中微量元素（铁、镁）均匀添加到发酵产物后，即得到嗜冷性微生物菌群的附着载体。

（4）冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群的制备：将重量百分比为5%富集培养的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，之后转移至固体发酵箱，进行嗜冷性微生物菌群与嗜冷性微生物菌群的附着载体的耦合富集培养，在12℃条件下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10⁹CFU/mL即可。

实施例三：

（1）菌种种子液的富集培养：将嗜冷弧菌（Psychrophicvibrto2693，购自布鲁塞尔自由大学微生物研究所）、嗜冷杆菌（Psychrobacter sp ACCC11832）、假单胞菌（Pseudomonas CGMCCNO1.39）、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas CCTCC M2010239）、酵母菌（Candida santamariae CGMCC No2959）、不动杆菌（Acinetobacter ATCC15309）分别接种于相应的富集培养基，在各自最适培养温度下恒温振荡培养5天使菌种数量达到有效活菌数≥2.0×10⁹CFU/mL。

嗜冷弧菌富集培养为海洋无机培养基中（此培养基购自ixfcoLabolatories）。嗜冷弧菌的最适培养温度6℃。

嗜冷杆菌富集培养为YPD培养基（1000mL）：胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，脱脂奶粉1.0g，蒸馏水配制至1000mL，pH值7.0±0.1。嗜冷杆菌的最适培养温度25℃。

假单胞菌富集培养为NA培养基（1000mL）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，蒸馏水配制至1000mL，pH值6.8±0.2。假单胞菌的最适培养温度20℃。

假交替单胞菌富集培养为Zobell2216E培养基（1000mL）：胰蛋白胨5g，酵母粉1g，用过滤陈海水与自来水配制至1000mL，过滤陈海水:自来水=2:1。假交替单胞菌的最适培养温度6℃。

酵母菌富集培养为YPD培养基（1000mL）：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，用蒸馏水配制至1000mL，pH自然。酵母菌的最适培养温度12℃。

不动杆菌富集培养为脑心浸液培养基（BHI）（1000mL）：蛋白胨10g，脱水小牛脑浸粉12.5g，脱水牛心浸粉5g，NaCl5g，葡萄糖2g，磷酸氢二钠2.5g，用蒸馏水配制至1000mL，pH值7.4±0.2。不动杆菌的最适培养温度25℃。

（2）嗜冷性微生物菌群的富集培养

将增殖培养的嗜冷性菌种培养液按照任意比混合接种于富集的营养肉汁培养基（蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl5g、酵母浸膏0.5g、马铃薯提取液20mL、FeCl₂·6H₂O100mg、MnCl₂·4H₂O10mg、Na₂B₄O₇·10H₂O5mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O5mg，添加蒸馏水至1000mL，并调节pH7.2），在15℃条件下恒温培养7天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/mL，得到嗜冷性微生物菌群。

（3）嗜冷性微生物菌群的附着载体的制备：按重量百分比将55%稻壳、18%米糠、19%用猪粪饲养蝇蛆产生的蝇蛆粪、5%虾壳粉、3%豆饼渣等充分混合均匀，添加磷酸氢二铵调节混合物C/N至30，用蒸馏水调节混合物含水量为60%，添加重量百分比为3%的EM菌剂、VT-400除臭菌剂和VT-1000堆肥接种剂的混合物（EM菌剂：VT-400除臭菌剂：VT-1000堆肥接种剂的重量百分1：1：0.8）混匀进行好氧发酵30天至堆肥后熟阶段，然后将重量百分比为2%含磷酸氢二铵、重量百分比为0.05%中微量元素（硫酸亚铁，硫酸镁）均匀添加到发酵产物制备形成嗜冷性微生物菌群的附着载体。

（4）冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群的制备：将重量百分比为8%富集培养的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，之后转移至固体发酵箱进行嗜冷性微生物菌群与嗜冷性微生物菌群的附着载体的耦合富集培养，在15℃条件下恒温搅拌培养10天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10⁹CFU/mL即可。

实施例四：

（1）菌种种子液的富集培养：将棒状杆菌（CorynebacteriumCICC10053）、色杆菌（Chromobacteriura ATCC12473）、梭状芽孢杆菌（Clostridium ATCC19398）分别接种于相应的富集培养基，在各自最适培养温度下恒温振荡培养4天使菌种数量达到有效活菌数≥2.0×10⁹CFU/mL。

棒状杆菌富集培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢铵1g，硫酸镁0.2g，氯化钾0.2g，牛肉膏3g，酵母膏5g，蛋白胨5g，微量元素1g（微量元素组成:酒石酸钠），无菌水配制至1000mL，pH7.2。最适培养温度25℃。

色杆菌富集培养基为NA培养基（1000mL）：牛肉膏3g，蛋白胨5g，蒸馏水配制至1000mL，pH值6.8±0.2。最适培养温度20℃。

梭状芽孢杆菌富集培养基：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏3g，葡萄糖5g，NaCl5g，可溶性淀粉1g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，醋酸钠3.0g，蒸馏水1000mL，pH6.6-7.0。最适培养温度25℃。

（2）嗜冷性微生物菌群的富集培养：将增殖培养的嗜冷性菌种培养液混合（将棒状杆菌菌种培养液：色杆菌菌种培养液：梭状芽孢杆菌菌种培养液的体积比为1:1.5:2.0）接种于富集的营养肉汁培养基（蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl5g、酵母浸膏0.5g、马铃薯提取液20mL以及中微量养分CaCO₃ 0.5g、ZnCl₂ 20mg、FeCl₂·6H₂O100mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O5mg，添加蒸馏水至1000mL，并调节pH7.0），在13℃条件下恒温培养6天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/mL，得到嗜冷性微生物菌群。

（3）嗜冷性微生物菌群的附着载体的制备：按重量百分比将42%稻壳、25%米糠、20%用猪粪饲养蝇蛆产生的蝇蛆粪、10%虾壳粉、3%豆饼渣充分混合均匀，添加硫酸铵调节混合物C/N至26，用蒸馏水调节混合物含水量为58%，添加重量百分比为1.0%的VT-400除臭菌剂和VT-1000堆肥接种剂（VT-400除臭菌剂和VT-1000堆肥接种剂重量比为2:1）混匀进行好氧发酵15天至堆肥后熟阶段，然后将重量百分比为1.5%硫酸铵、重量百分比为0.008%中微量元素微量元素（铁、镁）均匀添加到发酵产物制备形成嗜冷性微生物菌群的附着载体。

（4）冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群的制备：将重量百分比为6%富集培养的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，之后转移至固体发酵箱进行嗜冷性微生物菌群与嗜冷性微生物菌群的附着载体的耦合富集培养，在13℃条件下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10⁹CFU/mL即可，得到针对冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

实施例五：

（1）菌种种子液的富集培养：将棒状杆菌（CorynebacteriumCICC10053）、纤维单胞菌（Cellulomonas ATCC27403）、纤维粘菌（Cytophage ATCC23178）、酵母菌（Candida santamariae和Trichosporon akiyoshidainum）分别接种于相应的富集培养基，在各自最适培养温度下恒温振荡培养5天使菌种数量达到有效活菌数≥2.0×10⁹CFU/mL。

棒状杆菌富集培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢铵1g，硫酸镁0.2g，氯化钾0.2g，牛肉膏3g，酵母膏5g，蛋白胨5g，微量元素1g（微量元素组成:酒石酸钠），无菌水配制至1000mL，pH7.2。最适培养温度25℃。

纤维单胞菌富集培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，土壤浸出液1000mL，pH值7.0。最适培养温度26℃。

其中，土壤浸出液的制备方法为：称取250.00克风干土壤样品（过2毫米尼龙筛）于10升塑料瓶中，用溶液分配器准确加入2500毫升无菌水，置于往复振荡机上振荡5分钟（振荡强度为200转/分钟），然后干滤纸过滤，收集滤液于2000毫升塑料瓶中。整个浸提过程应在恒温条件下进行，温度控制在（25士1）℃。

纤维粘菌富集培养基：KNO₃ 0.5g，甘油磷酸钠0.1g，微量元素液1mL，Tris1.0g，胰蛋白胨2.0g，酵母膏2.0g，NaCl30g，蒸馏水1000mL，pH7.0。最适培养温度20℃。其中微量元素液（1L）：H₃BO₃2.85g，MnCl₂.4H₂O1.8g，FeSO₄ 1.36g，酒石酸钾钠1.77g，CuCl₂.2H₂O26.9mg，ZnCl₂ 20.8mg，CoCl₂.6H₂O40.4mg，Na₂MoO₄.2H₂O25.2mg，蒸馏水1000mL。

酵母菌富集培养为YPD培养基（1000mL）：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，，蒸馏水1000mL，pH自然。最适培养温度12℃。

（2）嗜冷性微生物菌群的富集培养：将增殖培养的嗜冷性菌种培养液混合（将棒状杆菌菌种培养液：纤维单胞菌菌种培养液：纤维粘菌菌种培养液：酵母菌菌种培养液的体积比为1:1.5:1.0:1.5）接种于富集的营养肉汁培养基（蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl5g、酵母浸膏0.5g、马铃薯提取液20mL以及中微量养分CaCO₃ 0.5g、ZnCl₂20mg、FeCl₂·6H₂O100mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O5mg，添加蒸馏水至1000mL，并调节pH7.0），在13℃条件下恒温培养6天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/mL，得到嗜冷性微生物菌群。

（3）嗜冷性微生物菌群的附着载体的制备：按重量百分比将42%稻壳、25%米糠、20%用猪粪饲养蝇蛆产生的蝇蛆粪、10%虾壳粉、3%豆饼渣充分混合均匀，添加硫酸铵调节混合物C/N至26，用蒸馏水调节混合物含水量为58%，添加重量百分比为1.0%的VT-400除臭菌剂和VT-1000堆肥接种剂（VT-400除臭菌剂和VT-1000堆肥接种剂重量比为2:1）混匀进行好氧发酵15天至堆肥后熟阶段，然后将重量百分比为1.5%硫酸铵、重量百分比为0.008%中微量元素微量元素（铁、镁）均匀添加到发酵产物制备形成嗜冷性微生物菌群的附着载体。

（4）冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群的制备：将重量百分比为6%富集培养的嗜冷性微生物菌群均匀添加于嗜冷性微生物菌群的附着载体，之后转移至固体发酵箱进行嗜冷性微生物菌群与嗜冷性微生物菌群的附着载体的耦合富集培养，在13℃条件下恒温搅拌培养8天使菌种数量达到有效活菌数≥1.0×10⁹CFU/mL即可，得到针对冷浸田养分活化的嗜冷性微生物菌群。

实施例六：

在赤红壤发育的水稻土（冷浸田）上开展本发明专利产品的应用效果试验，试验前取样检测土壤基本理化性质为：pH5.1，有机质31.7g/kg，碱解氮（N）164.4mg/kg，速效磷（P₂O₅）14.3mg/kg，速效钾（K₂O）51.0mg/kg，土壤肥力中等。供试作物为晚稻和早稻，品种为合丰占。供试嗜冷性微生物菌群为实施例一、实施例二、实施例三和实施例四的产品。试验设4个处理：处理1：无菌剂添加（对照）；处理2：实施例一产品（50kg/亩）；处理3：实施例二产品（50kg/亩）；处理4：实施例三产品（50kg/亩）；处理5：实施例四产品（50kg/亩）；处理6：实施例一、实施例二、实施例三和实施例四产品混合物（重量百分比1:1:1:1）灭菌（50kg/亩）。每个处理重复3次，完全随机排列，小区面积100m²（10m×10m），小区间筑埂，共18个小区，周围设保护行。处理2、处理3、处理4、处理5和处理6产品一次基施7d后进行耕耙田。在水稻抛秧前每个小区均一次性施用复混肥45kg/亩（35kg/亩，插秧后5d施用尿素5kg/亩）。水稻品种合丰占，秧龄5叶1针，插秧密度为20*20cm。其他管理措施参照水稻栽培技术规程进行。应用结果表明（表1-3）：在冷浸田上使用嗜冷性微生物菌群产品，与对照处理相比，可增加土壤微生物量，提高土壤碱解氮、速效磷、有机质和水溶性有机质含量，提升水稻产量。

测定方法如下：

（1）土壤微生物数量（细菌、放线菌、真菌）采用稀释平板法，制备土壤悬液，接种于细菌、放线菌、真菌培养基中，通过平板计数测定微生物数量，具体步骤参照《土壤与环境微生物研究法》，2008。

（2）土壤微生物量碳测定采用熏蒸提取—仪器分析法，新鲜土壤经氯仿熏蒸后，用0.5mol/L K₂SO₄溶液提取土壤，再经自动总有机碳（TOC）分析仪测定，具体步骤参照《土壤与环境微生物研究法》，2008。

（3）土壤碱解氮、速效磷、速效钾测定分别采用碱解扩散法、0.5mol/LNaHCO₃法、NH₄OAc浸提--火焰光度法；土壤pH、有机质测定分别采用电位法、重铬酸钾容量法——外加热法。以上5项测定方法均为标准方法，分别为LY/T1229-199、LY/T1233-1999、LY/T1236-1999、LY/T1239-1999、LY/T1237-1999。

（4）土壤水溶性有机质测定采用0.5mol/L K₂SO₄溶液浸提，再经自动总有机碳（TOC）分析仪测定，具体步骤参照《土壤溶解性有机碳测定方法与应用》，吕国红等，2006。

表1添加实施例产品对稻田土壤微生物的影响

注:同列数据后不同小写字母表示Duncan检验在P=0.05水平上差异显著。

表2添加实施例产品对稻田土壤理化性质的影响

注:同列数据后不同小写字母表示Duncan检验在P=0.05水平上差异显著。

表3添加实施例产品对水稻产量的影响

注:同列数据后不同小写字母表示Duncan检验在P=0.05水平上差异显著。