利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法

摘要

一种利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法，选用已经在市场上商业化的原料酮酸或其相应的可溶性酮酸盐类化合物为初始原料，将初始原料溶解于磷酸盐缓冲液；然后加入氨基供体；将磷酸吡哆醛（PLP）和氨基转移酶主酶加入到含氨基供体及主原料酮酸或其相应的可溶性酮酸盐类化合物的体系中，恒温条件下反应，得到较高ee值的产品n=1,2,3,4,5，或n=0,1。该方法工艺条件稳定，操作简单，收率高，成本低，且利于环境保护，适用于规模化生产，为制备手性氨基酸化合物提供了一种新的思路和方法。

说明书

（一）技术领域：

本发明涉及合成手性环状烷基氨基酸的方法，特别是利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法。

（二）背景技术：

不对称生物催化由于其经济效益高，同时由于酶的专一特性，使得这种方法具有高的立体选择性、化学及光学专一性的优点，因此已经成为工业上合成化学品、医药及农药中间体的重要方法。其中，制备手性氨基酸的方法中，主要是基于通过液相层析拆分外消旋混合物，通过化学拆分的方法进行拆分。

各种拆分方法都存在难于进行工业化生产、成本相对较高且收率较低的缺点，理论收率值可达到50%，实际应用过程中收率仅为10%-20%，因此，应用该类方法的生产成本非常昂贵。有时化学拆分法还使用价格昂贵的手性拆分剂，大大地增加了生产成本；另外所采用的化学试剂操作较为复杂，且后处理不利用环境保护。

（三）发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法，通过利用氨基转移酶或其全细胞进行不对称生物催化，提供一种制备高光学纯度的手性氨基酸的方法，选用已经在市场上商业化的原料酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物为初始原料，酮酸结构式为n=1,2,3,4,5，或n=0,1；可溶性酮酸盐结构式为n=1,2,3,4,5，X为可使相应酮酸形成可溶性盐的金属，或n=0,1，X为可使相应酮酸形成可溶性盐的金属，将初始原料溶解于磷酸盐缓冲液；然后加入氨基供体；将磷酸吡哆醛（PLP）和氨基转移酶主酶加入到含氨基供体及主原料酮酸类化合物或其可溶性酮酸盐类化合物的体系中，恒温条件下反应，得到较高ee值的产品，n=1,2,3,4,5，或n=0,1，反应过程参见图2-图3。该方法能得到高收率，高光学纯度的手性氨基酸产品，极大地简化了后处理纯化操作。该方法工艺条件稳定，操作简单，收率高，成本低，且利于环境保护，适用于规模化生产，为制备手性氨基酸化合物提供了一种新的思路和方法。

本发明的技术方案：利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）投料：向反应釜中加入主原料酮酸或其可溶性铜酸盐类化合物，其中酮酸结构式为n=1,2,3,4,5，或n=0,1；可溶性酮酸盐类化合物的结构式为n=1,2,3,4,5，X为可使相应酮酸形成可溶性盐的金属，或n=0,1，X为可使相应酮酸形成可溶性盐的金属，加入磷酸盐缓冲液，使主原料酮酸或其可溶性铜酸盐类化合物均匀溶解于磷酸盐缓冲液中，其中磷酸盐缓冲液浓度为50-200mM,pH=8.0；酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与磷酸盐缓冲液的用量比为1g/10～100mL；

（2）加氨基供体：向反应釜中，加入氨基供体，所述氨基供体为L-氨基酸或D，L-氨基酸，搅拌至全部溶解，调节体系至pH=6～9；其中，酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与氨基供体的摩尔比为1：1～10eq；

（3）加氨基转移酶及辅酶：向反应釜中，加入辅酶磷酸吡哆醛和氨基转移酶主酶，氨基转移酶主酶为来源于Enterobacter sp.TL3的氨基转移酶主酶BcATen、来源于Escherichia coli K12的氨基转移酶主酶BcATes或来源于E.coli的氨基转移酶主酶AAT；其中，酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与磷酸吡哆醛的摩尔比为1：0.01～0.1；酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与氨基转移酶主酶的用量比为1g/0.01～0.5g；

（4）反应：体系于反应釜中搅拌，搅拌速度为150rpm～250rpm，并于20～40℃下反应24～72h；

（5）后处理：体系取样跟踪，原料转化完毕，向体系中滴加酸调节至体系pH<1，然后体系用硅藻土过滤，滤液再用可形成可溶性盐的无机碱调节体系pH=5～6，控制体系温度，使其小于30℃，将滤液浓缩，抽滤，淋洗，得到固体粗产品，再经离子交换树脂纯化，浓缩得到纯度较高的产品n=1,2,3,4,5或n=0,1；纯度95.0～98.0％，收率52.3～85.0％，ee值93.6～99.5%，MS(M+H)+=144.1～172.1；其中，酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与离子交换树脂的用量比为5～15：1。

上述所述步骤（1）中主原料酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与磷酸盐缓冲液的用量比为1g/30～80mL。

上述所述步骤（2）中主原料酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与氨基供体的摩尔比为1：1～8eq。

上述所述步骤（3）中主原料酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与辅酶磷酸吡哆醛的摩尔比为1：0.01～0.08；主原料酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与氨基转移酶主酶的用量比为1g/0.05～0.5g。

上述所述步骤（4）中反应温度为25～35℃，搅拌速度为180rpm～220rpm，反应时间为32～72h。

上述所述步骤（5）中酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与离子交换树脂的用量比为6～13：1。

上述所述步骤（1）中酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与磷酸盐缓冲液的用量比为1g/40～60mL；所述步骤（2）中酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与氨基供体的摩尔比为1：1～5eq；所述步骤（3）中酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与辅酶磷酸吡哆醛的摩尔比为1：0.01～0.05；酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与氨基转移酶酶主酶的用量比为1g/0.05～0.3g；所述步骤（4）中反应温度为27～33℃，搅拌速度为190rpm～210rpm，反应时间为32～50h；所述步骤（5）中酮酸或其可溶性酮酸盐类化合物与离子交换树脂的用量比为8～12：1。

上述步骤（1）中酮酸或的可溶性酮酸盐类化合物n=1,2,3,4,5，或n=0,1中的X为Li、K或Na。

上述所述步骤（2）中L-氨基酸为L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸或L-高苯丙氨酸；D,L-氨基酸为D,L-谷氨酸、D,L-天冬氨酸、D,L-赖氨酸或D,L-高苯丙氨酸。

上述所述步骤（5）中酸为浓盐酸或磷酸；可形成可溶性盐的无机碱为4mol/L NaOH或KOH溶液。

本发明的优越性：1、本发明采用已商业化或者易制备的原料，廉价易得，并且工艺简单，仅通过一步得到收率和纯度较高的单一构型的手性环状烷基氨基酸，产品纯度稳定在95.0～98.0％，收率稳定在52.3～85.0％，ee值稳定在93.6～99.5%，具备规模化生产的能力；

2、本发明反应条件温和，工艺安全稳定，对环境比较友好，满足规模化生产的要求。

（四）附图说明：

图1为本发明所涉利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法应用步骤流程图。

图2为本发明所涉利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸n=1,2,3,4,5的作用机理图。

图3为本发明所涉利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸n=0,1的作用机理图。

结合图1、图2及图3可以更加直观的理解上述发明的技术方案。

（五）具体实施方式：

对于实施方式中出现的区间范围，是由于在一次试验中温度随反应过程的进行会出现一定的浮动；PH值测试结果的表述也是化工合成领域的常规表述。

实施例1：利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）投料：向200L反应釜中，加入2.12kg主原料2-环己基-2-氧乙酸钠盐，加入100L磷酸盐缓冲液(50mM,pH=7.0)，使主原料2-环己基-2-氧乙酸钠盐均匀溶于磷酸盐缓冲液中；

（2）加氨基供体：向200L反应釜中，加入1.75kg的L-谷氨酸作为氨基供体，搅拌至全部溶解，调节体系至pH=7.0；

（3）加氨基转移酶及辅酶：向200L反应釜中，加入0.03kg的辅酶磷酸吡哆醛PLP，0.21kg氨基转移酶主酶BcATes；

（4）反应：体系于反应釜中搅拌，搅拌速度为150rpm，并于30℃保温72h；将滤液浓缩，抽滤，淋洗，得到固体粗产品，

（5）后处理：体系取样跟踪，原料转化完毕，向体系中滴加浓HCl，至体系pH<1,然后体系用50kg硅藻土过滤，滤饼弃，滤液再用4N NaOH溶液调节体系pH=5～6，控温<30℃，使其小于30℃，将滤液浓缩，抽滤，淋洗，得到固体粗产品，再经离子200L交换树脂纯化，浓缩得到1.2kg纯度较高的产品纯度98.0％，ee值>99.5%，1H NMR(400MHz，D₂O)：δ3.15（m，1H），1.61～1.53(m，5H)，1.36（m，1H），1.23(m，2H)，1.08～1.00（m，3H）,0.79（m，2H），(M+H)⁺=158.1。

实施例2：利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）投料：向200L反应釜中，加入1.25kg主原料环戊基丙酮酸钠，加入100L磷酸盐缓冲液(100mM,pH=8.0)，使主原料环戊基丙酮酸钠均匀溶于磷酸盐缓冲液中；

（2）加氨基供体：向200L反应釜中，加入11.21kg的L-谷氨酸作为氨基供体，搅拌至全部溶解，调节体系至pH=8.0；

（3）加氨基转移酶及辅酶：向200L反应釜中，加入0.025kg的辅酶磷酸吡哆醛PLP，0.12kg氨基转移酶主酶BcATen；

（4）反应：体系于反应釜中搅拌，搅拌速度为200rpm，并于25℃保温60h；

（5）后处理：体系取样跟踪，原料转化完毕，向体系中滴加浓HCl，调节至体系pH<1,然后体系用50kg硅藻土过滤，滤饼弃，滤液再用4N NaOH溶液调节体系pH=5～6，控温<30℃，将滤液浓缩，抽滤，淋洗，得到固体粗产品，再经约110L离子交换树脂纯化，浓缩得到0.75kg纯度较高的产品

纯度95.0％，ee值>99.0%，1H NMR(400MHz,D2O)：δ2.79（d，1H），1.89(m，1H)，1.65～1.43(m，6H),2.19(m，2H)。MS：(M+H)+=144.1。

实施例3：利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）投料：向200L反应釜中，加入1kg主原料环庚基丙酮酸加入100L磷酸盐缓冲液(50mM,pH=7.5)，使主原料环庚基丙酮酸均匀分散于磷酸盐缓冲液中，然后加入0.71kg NaOH使其成钠盐，均匀溶于磷酸盐缓冲液中；

（2）加氨基供体：向200L反应釜中，加入1.56kg的L-天冬氨酸作为氨基供体，搅拌至全部溶解，调节体系至pH=7.5；

（3）加氨基转移酶及辅酶：向200L反应釜中，加入0.1kg的辅酶磷酸吡哆醛PLP，0.5kg氨基转移酶主酶AAT；

（4）反应：体系于反应釜中搅拌，搅拌速度为250rpm，并于30℃保温48h；

（5）后处理：体系取样跟踪，原料转化完毕，向体系中滴加浓HCl，调节至体系pH<1,然后体系用50kg硅藻土过滤，滤饼弃，滤液再用4N NaOH溶液调pH5～6，控温<30℃。将滤液浓缩，抽滤，淋洗，得到固体粗产品，再经约95L离子交换树脂纯化，浓缩得到0.54kg纯度较高的产品，

纯度96.0％，ee值>93.6%，1H NMR(400MHz,D2O)：δ3.08（d，1H），1.77(m，1H)，1.63～1.26(m，12H)。(M+H)+=172.1

实施例4：利用氨基转移酶合成手性环状烷基氨基酸的方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）投料：向200L反应釜中，加入1kg主原料酮酸钠盐100L磷酸盐缓冲液(50mM,pH=8.0)，使主原料酮酸钠盐均匀溶于磷酸盐缓冲液中；

（2）加氨基供体：向200L反应釜中，加入3.69kg的L-天冬氨酸作为氨基供体，搅拌至全部溶解，调节体系至pH=8.0；

（3）加氨基转移酶及辅酶：向200L反应釜中，加入0.03kg的辅酶磷酸吡哆醛PLP，0.10kg氨基转移酶主酶AAT；

（4）反应：体系于反应釜中搅拌，搅拌速度为200rpm，并于30℃保温72h；

（5）后处理：体系取样跟踪，原料转化完毕，向体系中滴加浓HCl，调节至体系pH<1,然后体系用50kg硅藻土过滤，滤饼弃，滤液再用4N NaOH溶液调pH5～6，控温<30℃。将滤液浓缩，抽滤，淋洗，得到固体粗产品，再经约105L离子交换树脂纯化，浓缩得到0.59kg纯度较高的产品，

纯度97.8％，ee>99.0%。1H NMR(400MHz，D2O)：δ3.99（t，2H），3.44(t，2H)，3.00（d，1H），1.75(m，1H)，1.57（m，2H），1.33（m，2H）。(M+H)⁺=160.1

此类合成方法采用的工艺稳定，反应条件温和，整个生产过程中操作简单、对环境比较友好，为合成手性环状烷基氨基酸提供了一种新的思路和方法。