一种产果胶酶微生物菌株及其在烟草中的应用

摘要

本发明涉及一种产果胶酶微生物菌株及其在烟草中的应用，属于微生物发酵及应用领域。所述微生物菌株为疣孢青霉（

说明书

技术领域： 

本发明涉及一种产果胶酶微生物菌株及其在烟草中的应用，属于微生物发酵及应用领域。

背景技术：

果胶质是植物细胞间将细胞壁粘合在一起的亲水胶体，是D-半乳糖醛酸和D-半乳糖醛酸甲酯以α-1,4糖苷键连接而成的直链聚合物。果胶酶是能够分解果胶质的多种酶的总称，主要由植物和微生物产生。微生物中细菌、放线菌、酵母、真菌均可分泌果胶酶（R S Jayani, S Saxena, R Gupta. 2005. Microbial pectinolytic enzymes: A review. Process Biochemistry,40(9): 2931-2944.）。

果胶质作为烟叶细胞壁的构成成分，对烟叶品质和烟气成分有重要影响。果胶质对烟叶的吸湿性和弹性起一定作用，但含量过高时会导致焦油生成量增加，且在燃吸过程中产生甲醇、甲醛等有害成分，对烟叶品质不利（朱大恒,李彩霞.1999.烟气有害成分与烟叶化学成分的关系.烟草科技,(4):25-27）。在模拟卷烟抽吸条件下，果胶的热裂解试验发现其气体成分中含有乙醛、丙烯醛等多种对人体有害的羰基化合物（S Zhou，Y Xu，et al.2011. Pyrolysis behavior of pectin under the conditions that simulate cigarette smoking. Journal of analytical and applied pyrolysis,91(1):232-240）。降低烟叶中的果胶含量不仅可以改善烟叶质量，且能够降低焦油生成量及烟气有害成分，利用果胶酶可以有效降低果胶含量，改善烟叶品质。中国专利（公开号：CN 1778210A）中公开了一种利用酶溶液改善烟叶品质的方法，所述酶为蔗糖酶、淀粉酶、麦芽糖酶、纤维二糖酶、果胶酶、复合纤维素酶和/或葡萄糖淀粉酶。然而，目前的专利技术多集中在利用商品化的果胶酶及多酶复合物处理烟叶或梗丝，以改善品质，缺乏利用产果胶酶微生物及发酵液处理烟草的使用技术。

醇化片烟中存在大量的具有特定功能的微生物（杨金奎，段焰青，陈春梅等.2008.醇化烟叶表面可培养微生物的鉴定和系统发育分析.烟草科技,(11):51-55）,其作用贯穿烟叶醇化的整个过程，具有潜在的利用价值。另外，有研究表明，疣孢青霉（Penicillium verruculosum）的一些菌株能够产纤维素酶（Seonghun Kim and Chul Ho Kim.2012. Production of cellulase enzymes during the solid-state fermentation of empty palm fruit bunch fiber. Bioprocess Biosyst Eng, 35(1-2):61-67），关于该微生物菌株产果胶酶特性以及在烟草中的应用未公开报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足提供一种产果胶酶微生物及其发酵液在烟草中的应用方法。

产果胶酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum）TS63-9菌株系本专利申请人从醇化片烟中分离、鉴定的一种具有分泌果胶酶能力的真菌新菌株，该菌株已于2012年10月31日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.6747。

用产果胶酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum）TS63-9菌株发酵液处理烟丝或片烟，能够显著地降低烟草果胶含量，改善吸食品质。另外，该微生物菌株发酵液还可以降低烟梗中果胶含量。

本发明从醇化片烟中筛选具有产果胶酶能力的菌株，经发酵后应用于烟草中，可保证菌株来源的安全性及与烟草作用的特异性，能够有效降低烟叶（或烟梗）果胶含量，改善感官质量。

Penicillium verruculosum TS63-9菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长缓慢，前期菌落呈白色绒毛状，后期颜色变深，为绿色絮状，背面为黄绿色，28℃培养6d后菌落直径达36mm。显微镜观察其分生孢子穗形似扫帚状，分生孢子梗有横隔膜，顶端产生若干个间枝，间枝上生出5~7个小梗，小梗顶端产生分生孢子；分生孢子呈球形或亚球形，直径2.5μm~3.5μm。TS63-9菌株分生孢子梗及分生孢子显微形态见图1。利用引物5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇，5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇经PCR扩增该菌株ITS rRNA 基因序列，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据，根据ITS序列构建的TS63-9菌株系统发育进化树见图2.

本发明是利用Penicillium verruculosum TS63-9菌株经摇瓶发酵所得发酵粗酶液处理烟叶或烟梗，从而达到降低烟草果胶含量，改善烟草品质的目的，本发明主要内容如下：

（1）孢子悬液制备：在无菌的条件下，将Penicillium verruculosum TS63-9菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，经培养后加入无菌水制备孢子悬液。

（2）摇瓶培养：将孢子悬液接种至装有发酵培养基的三角瓶中进行发酵培养。

（3）发酵液处理：在实验室条件（20℃~25℃）下，用离心机将培养所得发酵液离心，得到上清液即为粗酶液。

（4）利用TS63-9菌株经摇瓶发酵所得粗酶液处理片烟或烟丝，能够明显降低烟草果胶含量，提高烟气香气量及浓度，改善烟草感官评吸质量。另外利用TS63-9菌株经发酵所得粗酶液处理梗丝，能够显著降低烟梗果胶含量。

本发明具体实施过程为：

（1）孢子悬液制备：在无菌条件下，将Penicillium verruculosum TS63-9菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，培养基量为试管体积的1/4左右为宜。菌株在20℃~40℃下生长20h~168h后，加入与培养基体积比为1:1左右的无菌水，振荡得到孢子悬液。菌株适宜的生长温度为25℃~35℃，适宜的培养时间为24h~72h。

（2）摇瓶培养：将孢子悬液以3%~11%的接种量接种至装有25mL~75mL发酵培养基的三角瓶（250mL）中进行发酵培养。培养温度为24℃~40℃，摇床转速为160rpm~240rpm，培养时间48h~168h。适宜的培养温度为26℃~32℃，适宜的培养时间为72h~120h。

发酵培养基组成是（g/L）：橘皮粉或烟梗粉末2.5~10.0，KH₂PO₄ 1.0~3.0，(NH₄)₂SO₄ 1.5~5.5，MgSO₄· 7H₂O 0.1~0.5，CaCl₂ 0.1~0.5，Tween-80 1.0~2.0mL/L，pH 5.0~7.0。

（3）发酵液处理：在实验室条件（20℃~25℃）下，将所得发酵液于0℃~4℃、5000rpm~10000rpm条件下离心5min~15min，得到上清液极为粗酶液。

（4）用接有空压泵的喉头喷雾器将TS63-9菌株发酵粗酶液均匀喷施于烟丝或片烟中，粗酶液添加水平为5%~15%（v/w），处理温度为30℃~50℃，作用时间4h~12h，随后于80℃~90℃下作用20min~40min使粗酶液失活。对处理完样品进行果胶含量及常规化学成测定，并进行感官质量评价（YC/T 138-1998 烟草及烟草制品 感官评吸方法[S]）。结果表明，TS63-9菌株发酵粗酶液能够显著地降低烟丝或片烟中果胶含量，提高烟气香气量及浓度，改善吸食品质；经处理样品各项化学成分相对较均衡，变化不显著。

（5）用接有空压泵的喉头喷雾器将TS63-9菌株发酵粗酶液均匀喷施于梗丝中，粗酶液添加水平为5%~15%（v/w），处理温度为30℃~50℃，作用时间6h~12h，随后于80℃~90℃下作用20min~40min使粗酶液失活。通过测定果胶含量发现，TS63-9菌株发酵粗酶液能够降低烟梗果胶含量。

在卷烟工艺生产线上，建议在配叶贮叶前、贮梗丝前或配丝贮丝前将TS63-9菌株发酵粗酶液与香料或香精料液混合后均匀施加。

上述粗酶液果胶酶活力测定：在10mL具塞刻度试管中加入1.0mL 0.5%果胶溶液（pH4.0柠檬酸缓冲液配制），55℃水浴预热5min，加入0.5mL经适当稀释的粗酶液，55℃水浴反应40min后，加入3mLDNS溶液，沸水浴10min，取出后用自来水迅速冷却至室温，定容至10mL。以灭活酶液为对照，在540nm下测定吸光度值，根据半乳糖醛酸标准曲线计算还原糖含量。半乳糖醛酸标准曲线见图3。

果胶酶活力：在上述反应条件下，每小时水解果胶底物产生1mg半乳糖醛酸的酶量为1个酶活力单位，以U·mL^-1表示。

烟草中果胶含量的测定如下：

样品于45℃下烘干并磨成粉末，准确称取1g烟末（或梗末）置于250mL具塞三角瓶中，加入100mL5%醋酸溶液，室温下170rpm振荡萃取30min，用G3玻璃砂芯漏斗抽滤，蒸馏水冲洗3次以上，用60mL柠檬酸缓冲液（pH4.2）将残渣转移至三角瓶中，加入900u/g的果胶酶，于50℃恒温水浴中酶解3h，趁热抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤3~4次，合并洗涤液，蒸馏水定容至100mL，用流动分析仪检测样品液中的半乳糖醛酸。

果胶含量计算：

X=                                               ×100%；

X：样品中果胶含量，以D -半乳糖醛酸含量计，单位为质量百分数（100%）；

C：样品液半乳糖醛酸的仪器观测值，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

V：样品液体积，为100mL；

m：试样质量，单位为毫克（mg）；

w：试样水分含量。

附图说明

 

图1为Penicillium verruculosum TS63-9菌株分生孢子梗及分生孢子显微形态观察（1000×）；

图2为Penicillium verruculosum TS63-9菌株系统发育进化树；（注：图中的线段0.002表示序列差异的分枝长度，括号中的序号为菌株在Genebank中的登录号）

图3为计算果胶酶活力大小的半乳糖醛酸标准曲线。

具体实施方式

    以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的试验，均设置三次重复，结果取平均值。

实施例1

在20mL体积的试管中加入5mL的马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成斜面，将Penicillium verruculosum TS63-9产果胶酶菌株接种于斜面上28℃培养48h，加入5mL无菌水，振荡得到孢子悬液。将孢子悬液以5%的比例接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。培养温度28℃，摇床转速200rpm，培养时间72h。发酵液在4℃、6000rpm条件下离心，得到上清液即为粗酶液。经过试验测定，所得粗酶液果胶酶活力为701.5 U·mL^-1。

发酵培养基组成为（g/L）：烟梗粉末7.5，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 2.5，MgSO₄· 7H₂O 0.3，CaCl₂ 0.3，Tween-80 1.0mL/L，pH 6.0。

云南昌宁2012年初烤烟叶，品种为红花大金元，等级为C3L，采用QS-5实验室烟叶切丝机制备烟丝样品，烟丝于22℃、湿度60%条件下平衡48h以上。

粗酶液以5%、10%、15%（v/w）的水平用喷雾器均匀喷施于烟丝中，对照组喷施等量的经高温处理粗酶液。将塑料袋密封，放于40℃烘箱中处理6h，结束后于80℃处理20min使酶失活。取出少量样品45℃烘干后测定果胶含量及烟叶化学成分，其余样品用实验室用卷烟机卷制，进行感官质量评吸。

果胶含量测定结果见表1，烟草化学成分测定结果见表2，感官质量评吸结果见表3。

由表1可以看出，经过发酵粗酶液处理后，烟丝果胶含量明显降低。未经处理样品果胶含量为9.03%，5%、10%、15%添加水平处理后样品果胶含量分别为7.99%、5.40%、4.96%，与空白对照相比较分别降低了11.5%、40.3%、45.1%，降低量随着酶液添加量的增加而增加。由此可见，本发明Penicillium verruculosum TS63-9菌株发酵粗酶液能够有效降低烟丝果胶质含量。

表1 果胶含量测定结果

由表2可以看出，10%、15%添加水平处理后样品还原糖、总糖含量略有增加，钾、氯含量稍有减少；5%、10%、15%添加水平处理后烟样淀粉含量稍微增加；三个添加水平处理后烟样常规化学成分变化不显著，均处于适宜范围，内在化学成分协调。                                     

表2 烟草常规化学成分测定结果

由表3可以看出，与空白对照相比较，粗酶液以5%添加水平处理后烟丝后，烟气香气质不变，香气量略有增多，浓度稍微变浓，感官质量有所改善；10%添加水平处理后烟气香气质没有发生变化，香气量增多、较浓，浓度明显增大、饱满，余味尚适，综合感官品质得到改善；15%添加水平处理后烟气香气质不变，香气量、浓度基本不变，刺激性有所增大，综合感官品质稍微变差，说明Penicillium verruculosum TS63-9菌株发酵粗酶液处理烟丝需要适宜的添加量。

表3 感官质量评吸结果

    实施例2

在20mL体积的试管中加入5mL的马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成斜面，将Penicillium verruculosum TS63-9产果胶酶菌株接种于斜面上28℃培养24h，加入5mL无菌水，振荡得到孢子悬液。将孢子悬液以5%的比例接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。培养温度28℃，摇床转速200rpm，培养时间120h。发酵液在4℃、6000rpm条件下离心，得到上清液即为粗酶液。经过试验测定，所得粗酶液果胶酶活力为695.2 U·mL^-1。

发酵培养基组成为（g/L）：烟梗粉末7.5，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 2.5，MgSO₄·7H₂O 0.3，CaCl₂ 0.3，Tween-80 1.5mL/L，pH 6.0。

梗丝样品丝于22℃、湿度60%条件下平衡48h以上

粗酶液以5%、10%、15%（v/w）的添加水平处理梗丝，对照组喷施等量的经高温处理粗酶液。喷施后将塑料袋密封，放于烘箱中40℃条件下处理8h，结束后于80℃处理20min使酶失活。结果表明：未处理空白样品果胶含量为10.95%，5%、10%、15%添加水平处理后梗丝果胶含量分别为10.34%、9.07%、8.54%，与空白对照相比分别降低了5.6%、17.2%、22.0%；说明Penicillium verruculosum TS63-9发酵粗酶液能够明显降低烟梗中果胶质含量。烟梗是制作烟草薄片的主要原料，降低烟梗果胶质含量有利于烟草薄片的制作工艺。

实施例3

在20mL体积的试管中加入5mL的马铃薯葡萄糖琼脂培养基制成斜面，将Penicillium verruculosum TS63-9产果胶酶菌株接种于斜面上28℃培养72h，加入5mL无菌水，振荡得到孢子悬液。将孢子悬液以5%的比例接种至装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。发酵培养基基以橘皮粉为碳源，培养温度28℃，摇床转速200rpm，培养时间72h。发酵液在4℃、6000rpm条件下离心，得到上清液即为粗酶液。经测定，所得粗酶液果胶酶活力为501.9 U·mL^-1。

发酵培养基组成为（g/L）：橘皮粉5.0，KH₂PO₄ 2.0，(NH₄)₂SO₄ 1.5，MgSO₄· 7H₂O 0.3，CaCl₂ 0.3，Tween-80 1.0mL/L，pH 6.0。

将本实施例所制得的粗酶液处理烟叶、片烟或烟梗，也可得到近似于实施例1、2的应用效果。