一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法

摘要

本发明提供一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于培养方法的具体步骤包括：1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏培养；2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。体外人卵母细胞腔前卵泡培养需要FSH的支持，FSH不仅能促进卵泡的生长，增加其存活天数，还能促进颗粒细胞增殖，促进卵母细胞成熟，是卵泡生长发育调控的重要因子。曲古柳菌素A可有效抑制肿瘤细胞增殖，可为调控细胞周期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡，从而保证细胞成活质量，该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，为一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法。

背景技术

近年来，随着有关胚胎工程技术尤其是试管婴儿技术的的不断发展，对卵母细胞的需求 日益增加，单纯利用体内成熟的卵母细胞已不能满足医学需求，人们开始着眼于研究具有巨 大卵母细胞来源潜力的腔前卵泡的开发和利用。但常规的腔前卵泡培养时颗粒细胞增生分化 不足从而导致卵泡发育存在缺陷，卵泡在营养液中的存活天数很短，培养难度大、成功率低 且不稳定，使得腔前卵泡培养达不到预期的效果而影响其进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是这样实现的：一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其具体步骤包括： 1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复 苏培养；2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液 中进行腔前培养。在在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)。步骤2)的具体方 法是：配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml， 并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；将获取的体外人 卵母细胞在含17％的FCS的Ham‘sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37 ℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。加入的曲古柳 菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。

通过低温贮存能够提高体外人卵母细胞冻存后的存活率及减数分裂等各项功能的恢复， 提高复速率。而卵泡刺激素(FSH)是垂体分泌的一种糖蛋白激素，其主要作用是促进颗粒细 胞增生分化，调节卵泡的发育。体外人卵母细胞腔前卵泡培养需要FSH的支持，FSH不仅能 促进卵泡的生长，增加其存活天数，能促进颗粒细胞增殖，促进卵母细胞成熟，是卵泡生长 发育调控的重要因子。曲古柳菌素A可有效抑制肿瘤细胞增殖，可为调控细胞周期进程进而 诱导肿瘤细胞凋亡，从而保证细胞成活质量，该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。

附图说明

图1是贮体外人卵母细胞贮存方法流程示意图；

图中，1为：冷冻浸泡预处理；2为程序降温冷冻和低温贮存；3为快速升温解冻；4为 复苏后培养；

图2是体外人卵母细胞腔前培养图；

图3是加入曲古柳菌素A(TSA)的细胞分组柱状图。

具体实施方式

实施例1

一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于培养方法的具体步骤包括：

1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻 后复苏培养；

2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中 进行腔前培养。

优选地，进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)。

优选地，步骤2)的具体方法是：配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉 素110IU/ml，链霉素60μg/ml，并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵 泡雌激素FSH；将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham‘sF-10清洗后移入营养 液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并 每24小时换液一次。

优选地，加入的曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。

参见图1，本发明是一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，首先是将体外人卵母细胞 贮存在含蔗糖和丙二醇的冷冻液里进行浸泡冷冻预处理1，再进行程序化的缓慢降温冷冻， 然后低温贮存于液氮中，即降温冷冻和低温贮存2；在需要使用时，先使该体外人卵母细胞 快速升温解冻3，使之复苏，再将已解冻复苏的该体外人卵母细胞放入序贯培养液中，置于 37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱进行培养4，以供体外受精。

将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行 腔前培养。配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml， 并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；在进行培养过程 中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)，曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。 将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham’sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上 覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一 次。

实施例2

贮存方法同实施例1。将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激 素FSH的营养液中进行腔前培养。配置营养液，在基本营养液Ham’sF-10中加入青霉素 100IU/ml，链霉素50μg/ml，并添加15％的脐带血清FCS，并加入浓度为1IU/ml的卵泡雌 激素FSH；在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)，曲古柳菌素A(TSA)在营 养液中的浓度为100μg/1。将获取的体外人卵母细胞在含15％的FCS的Ham’sF-10清洗后 移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行 培养，并每24小时换液一次。试验结果如下：

不同浓度FSH对人腔前卵泡体外生长天数的影响，见表1：

表1

组别 例数 生产天数(平均天数x±s) 对照组 10 2.80±1.69^aI组 14 5.36±0.63^bII组 15 5.47±2.50^cIII组 16 8.13±4.19^d

注：经t检验a与dp＜0.001；a与cp＜0.01；a与b、b与d、d与cp＜0.05；b与cp ＞0.05

不同浓度曲古柳菌素A(TSA)对细胞周期的影响，见表2：

表2

细胞周期 对照组 50μg/L 100μg/L 200μg/L 400μg/L G₁/G₀35.75±1.84 36.84±2.23 41.13±2.15 26.94±2.45 22.61±3.62 S 28.87±3.12 19.61±3.58 25.23±3.42 14.21±2.46 22.82±4.24 G₂/M 20.13±2.56 18.56±2.76 18.49±2.28 20.70±2.64 21.59±1.83 Sub-G₁2.03±0.21 3.04±1.20 2.28±1.02 14.74±2.04 17.63±1.25

由此可见，根据实施例1得出的结果表面试验效果最佳。根据本发明所述的体外人卵母 细胞腔前培养方法可促进颗粒细胞增生分化，调节卵泡的发育，增加其存活天数，可有效抑 制肿瘤细胞增殖，可为调控细胞周期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡，从而保证细胞成活质量， 该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。

在此说明的是实施例中涉及的数值范围均是经过多次实验所得，每一个点都可以实现， 不局限在端点或者终点，篇幅所限，在此不进行一一列举。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修 改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。