丹酚酸B在制备用于三氧化二砷诱导心脏毒性的保护及协同抗肿瘤作用药物中的应用

摘要

本发明公开了丹酚酸B在制备用于三氧化二砷诱导心脏毒性的保护及协同抗肿瘤作用药物中的应用。本发明所述的丹酚酸B可以是丹酚酸B的药物组合物，包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型。用于口服时，可以是片剂、胶囊、软胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊；用于肠胃外给药途径时，可以是水针、冻干粉针、无菌粉针、输液。本发明药物组合物优选片剂和水针剂型。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种药用活性成分在制 备药物中的应用，尤其涉及在丹酚酸B制备药物中的应用。

背景技术

三氧化二砷(As₂O₃)是目前治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)最有效的药 物之一,被美国NCCN确定为APL复发的首选用药。近年来三氧化二砷不单治疗 白血病,而且在淋巴瘤、骨髓瘤等恶性肿瘤的治疗研究方面也取得了一些成果。 虽然常规治疗剂量的砷剂相对安全,但在临床应用中仍常出现一些不良反应,特 别是心脏毒性反应,限制了As₂O₃在临床的广泛使用。目前三氧化二砷引起心脏 毒性的研究,国内外虽均有文献报道,但多为小样本资料,少有大宗临床研究。国 外报道用砷剂治疗白血病心脏毒性发生率高达92.9%,甚至100%。三氧化二砷引 起的心脏毒性主要为心电图改变,50%以上患者可引起Q-T间期延长,其他表现 有窦性心动过速、非特异性ST-T变化和心动过速。最常见的急性合并症还有液 体潴留(心包、胸腔积液)。此外，重者在治疗中会出现尖端扭转型室性心动过 速,完全性房室传导阻滞或猝死等。目前对于As₂O₃化疗过程中出现的心脏毒性 尚无特异性疗法，常规静脉使用大剂量维生素C。

丹参是一直以来被广泛用于治疗心血管疾病如心绞痛，心梗，中风的传统 中药丹酚酸B是丹参中最丰富并且具有生物活性的丹酚酸。已被证明具有重要 的心血管保护作用。研究证明丹酚酸B具有抑制肿瘤增长作用，提示丹酚酸B 与抗癌药物联用很可能在癌症治疗中发挥增效减毒的作用。通过系统研究丹酚 酸B对三氧化二砷诱导的心肌细胞损伤及心脏毒性的保护作用及分子机制，丹 酚酸B与三氧化二砷联合用药充分发挥二者的增效减毒作用，提高三氧化二砷 的临床疗效并降低其心脏毒性，

发明内容

本发明公开了丹酚酸B在制备用于心肌细胞保护作用的药物中的应用；

更具体地，本发明公开了丹酚酸B在制备用于三氧化二砷诱导心脏毒性的 保护作用药物中的应用；

本发明还公开了丹酚酸B和三氧化二砷联合用于制备抗肿瘤药物的应用；

本发明公开了丹酚酸B在制备用于协同抗肿瘤作用药物中的应用。

本发明进一步公开了丹酚酸B在制备用于协同抗肿瘤药物三氧化二砷中的 应用。

本发明所述的上述应用,所述的丹酚酸B为药物组合物，由丹酚酸B与一种 或多种药学上可接受的载体或赋形剂制成药物组合物。

本发明所述三氧化二砷诱导心脏毒性的保护及协同抗肿瘤作用的药物为丹 酚酸B的药物组合物，所述药物组合物最小单元所含活性成分丹酚酸B的量为 2.5-100mg。

本发明所述的丹酚酸B药物组合物为临床上任何可接受的剂型形式，包括 口服及肠胃外给药形式的各种剂型。用于口服时，可以是片剂、胶囊、软胶囊、 口服液、糖浆、颗粒、滴丸、口崩片、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊； 用于肠胃外给药途径时，可以是水针、冻干粉针、无菌粉针、输液。本发明药 物组合物优选片剂和水针剂型。

上述药物组合物，所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于口服制 剂的药用赋形剂，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性 剂、吸附载体等。

上述药物组合物，所述药学上可接受的载体或赋形剂可选自适用于注射剂 的药用赋形剂，包括溶剂、抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂、PH调节 剂。

药物组合物最小单元是指一片，一颗胶囊，一袋颗粒或一支注射剂等。

本发明剂型可使用药物制剂工艺学本领域熟练技术人员所公知的惯常使用 的任何方法产生并且对此没有特别限制。

例如，本发明片剂可通过使用本领域公知的合适的方法粒化、干燥和筛分 主要药剂和赋形剂、粘合剂等等，向所得混合物中加入润滑剂等等然后混合并 形成片剂。造粒可通过本领域公知的任何合适的方法进行，例如湿法造粒、干 法造粒或加热造粒。合适的非限制性实例包括使用高速搅拌造粒机、流动造粒 干燥机、挤压造粒机或滚筒压紧器进行这些造粒方法。此外，例如干燥和筛分 的方法可以根据进行造粒的需要进行。主要药剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂等 等的混合物还可直接形成片剂。

如果需要薄膜包衣，可以使用本领域已知的任何薄膜包衣装置，并且作为 薄膜包衣基质，合适的实例包括糖衣基、亲水膜包衣基、肠溶薄膜包衣基和缓 释薄膜包衣基。

附图说明

图1 丹酚酸B与三氧化二砷联用对心脏功能的影响结果；正常组，As2O3组， As2O3+Sal B组和Sal B组小鼠给药结束后分别对其进行小动物心动超声。通 过M-mode成像分别对各组左室末端收缩直径(LVDs),左室末端舒张直径 (LVDd),射血分数（EF）和左室短轴缩短率（FS）进行定量比较。

图2 丹酚酸B与三氧化二砷联用对心肌损伤的影响结果；分别对正常组，As2O3 组，As2O3+Sal B组和Sal B组小鼠心脏组织进行HE染色分析。

图3 丹酚酸B与三氧化二砷联用对血浆中心肌酶活性的影响结果；收集正常 组，As2O3组，As2O3+Sal B组和Sal B组的血清，并对血清中 CK,LDH,GOT,CAT,SOD和GSH-Px的活性进行测定。

图4 三氧化二砷诱导的心肌细胞损伤模型；MTT对细胞存活率测定。(A)三 氧化二砷(0μM to 10μM)可以浓度依赖性的降低心肌细胞存活率。(B)Sal B(0.1μM to 10μM)对心肌细胞存活没有影响。

图5 丹酚酸B对三氧化二砷诱导的心肌细胞损伤的保护作用；(A)Sal B可 以浓度依赖性的提高三氧化二砷诱导的细胞存活率的下降。(B)LDH试剂盒测定 Sal B对LDH水平的影响。(C)Hoechst 33342/PI荧光染色检测细胞凋亡及坏 死。(D)荧光测定法检测Caspase-3活性。(E)荧光测定法检测胞内ROS水平。

图6 丹酚酸B增强三氧化二砷对HepG2和HeLa肿瘤细胞的抗肿瘤作用；MTT 法分别检测Sal B对HepG2和HeLa细胞存活率的影响。

图7 丹酚酸B增强三氧化二砷对S180肿瘤小鼠的抗肿瘤作用；将给药结束 后的小鼠取出肿瘤，并对其肿瘤重量进行测定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明，不构成对本发明的进一 步限制。

实施例1 丹酚酸B和三氧化二砷联用对体内心肌的保护作用

实施例1.1 体内As₂O₃所诱导的小鼠心肌病模型建立

6-8周鼠龄的ICR小鼠(北京维通利华，北京，中国)。动物适应1周并 且期间自由获取食物和水。60只小鼠随即分为4组:正常对照组（control）;三 氧化二砷单给药组（As2O3）;三氧化二砷与丹酚酸B联合给药组（As2O3+Sal B）;丹酚酸B单给药组（Sal B）。所有处理均采用尾静脉注射，每天注射一次, 给药两周。control组小鼠被注射10ml/kg生理盐水；As₂O₃组注射1.5mg/kg As₂O₃; As₂O₃+Sal B组先注射2mg/kg Sal B,1小时后注射1.5mg/kgAs₂O₃;Sal B组注 射2mg/kg的Sal B.

实施例1.2 小动物心脏超声

两周后，将小鼠用三溴乙醇麻醉，将小鼠经胸腔超声心动超声（visunlsonics， 型号：VEVO770）检测心脏功能和结构变化。为测定左心室收缩功能和心房直径， 后用带有15-MHz探针的Acuson Sequoia C-256仪器进行超声心动图分析。通 过M-mode成像定量左室末端收缩直径(LVDs),左室末端舒张直径(LVDd),射 血分数（EF）和左室短轴缩短率（FS）。

结果如图1所示，与正常组相比，三氧化二砷组射血分数明显下降，而联合 给药组可以显著上升。同样，三氧化二砷组左室短轴缩短率明显下降，而联合 给药组可以显著上升。然而，左室末端收缩和舒张直径在各组间没有显著差异。

实施例1.3 形态学检查

两周后，心动超声后，用大剂量戊巴比妥纳将小鼠全部致死，取心脏组织 用4%的甲醛固定。5mm的组织切片用苏木精和曙红染色。在光学显微镜下进 行形态学检查。

结果如图2所示，正常组:组织结构基本正常。As₂O₃组:大面积心肌纤维溶 解断裂，多量出血。As₂O₃+Sal B组:少量心肌纤维溶解断裂。Sal B组:组织结 构基本正常，可见少量出血点。

实施例1.4 血浆收集和生化检测

在水合氯醛麻醉下使用毛细管收集小鼠内眦的血样。血样在采集后一小时 内在3053g下离心10分钟，随后血浆中LDH,GSH-PX,CAT,SOD,CK,GOT的活性根 据厂商说明书，通过从Jiancheng Bio-engineering Institute(南京，中国) 购买的商业检测试剂盒来测定。

结果如图3所示，与三氧化二砷组相比，丹酚酸B与三氧化二砷联用可以 降低LDH,CAT,CK,GOT的活性，提高保护酶SOD,GSH-PX的活性。证明二者联用 具有保护三氧化二砷诱导的心肌氧化损伤作用。

实施例2：丹酚酸B对体外心肌细胞的保护作用

实施例2.1 三氧化二砷诱导的H9c2细胞损伤模型

大鼠心肌细胞H9C2（胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系）（中国科 学院上海细胞库）在添加胎牛血清的达尔贝克改良的Eagle’s培养基中，于 37°C 下 5% CO₂的条件下培养。细胞经常地传代并在实验前继代培养到90%的集 合。细胞以1×104的密度接种于96孔板.三氧化二砷(0，2,4,6,8,10μmol) 预处理24h后，每孔加入5mg/ml MTT(0.1mg/每孔)并孵育4h.。弃上清， 每孔加150μl DMSO溶解，570nm酶标仪(Spectrafluor,TECAN,Sunri se, Austria)检测吸光度。

结果如图4A所示，三氧化二砷浓度依赖性的降低细胞存活率，其中三氧化 二砷10μmol作用24h,细胞存活率为62.97%，确定为模型条件。

实施例2.2 丹酚酸B对H9c2心肌细胞的影响

H9c2心肌细胞以1×10⁴的密度接种于96孔板.丹酚酸B(0.1,1,10μ g/ml)预处理12h后，每孔加入5mg/ml MTT(0.1mg/每孔)并孵育4h.。弃 上清，每孔加150μl DMSO溶解，570nm酶标仪(Spectrafluor,TECAN,Sunrise, Austria)检测吸光度。

结果如图4B所示，丹酚酸B(0.1,1,10μg/ml)对心肌细胞无增殖及毒性 作用。

实施例2.3 丹酚酸B对三氧化二砷诱导的H9c2心肌细胞的保护作用

大鼠心肌细胞H9C2（胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系）以 1×104的密度接种于96孔板.丹酚酸B(0.1,1,10μg/ml)预处理12h后， 三氧化二砷10μM作用24h,之后每孔加入5mg/ml MTT(0.1mg/每孔)并 孵育4h.。弃上清，每孔加150μl DMSO溶解，570nm酶标仪(Spectrafluor, TECAN,Sunrise,Austria)检测吸光度。

结果如图5A所示，丹酚酸B可以浓度依赖性的保护三氧化二砷诱导的心肌 细胞死亡。其中丹酚酸B剂量10μg/ml达到最大保护作用。

实施例2.4 LDH释放测定

大鼠心肌细胞H9C2（胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系）以 3×10⁵的密度接种于每孔。丹酚酸B(10μg/ml)预处理12h后，三氧化二 砷10μM作用24h,，之后收集上清。LDH水平根据LDH试剂盒说明书测定。

结果如图5B所示,10μM ATO可以显著提高LDH释放。而加入10μg/ml Sal B预处理后，LDH活性可以显著降低。LDH是细胞出现死亡的标志，结果证明 Sal B能够保护ATO诱导的心肌细胞死亡。

实施例2.5 Hoechst 33342/PI染色

利用Hoechst 33342/PI染色，并通过高内涵成像分析系统检测细胞死亡 水平(Molecular Devices,USA)。H9c2细胞于96-孔板中培养36小时.丹 酚酸B(10μg/ml)预处理12h后，三氧化二砷10μM作用24h,之后细胞 于5mg/ml Hoechst 33342避光孵育15分钟，并用PBS洗2次。PI(终浓 度1μg/ml)加入细胞中，用高内涵成像系统获取图像，并用HCS软件对其核 大小和细胞膜渗透性进行计算分析。

结果如图5C所示,通过高内涵成像系统成像，正常组细胞被染成低蓝色， 三氧化二砷组可观察到亮蓝色荧光，并可看到呈PI阳性的红色荧光，而丹酚酸 B预处理组可以明显改善三氧化二砷导致的形态变化。

实施例2.6 CASPASE-3活性分析

Caspase-3活性通过荧光激活的caspase-3染色试剂盒(BioVision,CA, USA)，按操作说明进行测定。丹酚酸B(10μg/ml)预处理12h后，三氧化二砷 10μM作用24h，之后300μL(1×10⁶cell s/mL)细胞液加入1μL FITC-DEVD-FMK底物在黑暗中37°C孵育1h。荧光通过酶标仪在激发波长485 nm和发射波长535nm下进行测定。

结果如图5D所示,10μM ATO可以提高caspase-3活性,而加入丹酚酸B后 可以抑制三氧化二砷诱导的caspase-3活化。

实施例2.7 ROS产生测定

ROS水平根据总ROS检测试剂盒操作说明书进行检测。丹酚酸B(10μg/ml) 预处理12h后，三氧化二砷10μM作用24h，之后收集细胞并用1×洗液 洗一次，之后用100μl的carboxy-H2DCFDA(终浓度25μM)在黑暗中37°C 孵育30min。荧光通过酶标仪在激发波长495nm和发射波长529nm下进行测 定。

结果如图5E所示,与正常组相比，Sal B预处理可以降低ATO诱导的ROS 释放，而ATO处理组可以提高ROS水平。ROS产生会促使细胞损伤和凋亡进 程，结果证明Sal B能够保护三氧化二砷诱导的心肌细胞氧化应激损伤。

实施例3丹酚酸B和三氧化二砷联用对抗肿瘤作用的影响

实施例3.1 丹酚酸B联合三氧化二砷对A549肿瘤细胞的影响实验

HepG2细胞（人肝癌细胞）和HeLa细胞（人宫颈癌细胞）分别以5×10³密度接种于96孔板，细胞分别用三氧化二砷（10μM）单独处理，Sal B（10μ g/ml)单独处理和二者联用共同处理细胞48h,用MTT检测细胞活力。

如图6所示,从图6的结果可以看出丹酚酸B能够显著增强三氧化二砷诱导体 外HepG2和HeLa细胞的生长抑制率。

实施例3.2 丹酚酸B联合三氧化二砷对S180体内肿瘤小鼠的影响实验

ICR小鼠皮下接种5×10⁶密度的S180细胞（小鼠肉瘤细胞）。24小时后， 小鼠随机分为4组，每组15只。(a)Control组中小鼠被注射10ml/kg生理盐水； (b)As₂O₃组注射1.5mg/kg As₂O₃;(c)As₂O₃+Sal B组先注射2mg/kg Sal B,1 小时后注射1.5mg/kgAs₂O₃;(d)Sal B组注射2mg/kg的Sal B。均尾静脉注射， 每天注射一次,给药两周。两周后，处死小鼠取出肿瘤，称量肿瘤重量。

结果如图7所示，从图7的结果可以看出丹酚酸B与三氧化二砷联用能够降低 体内S180肿瘤的重量。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并 非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述 说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有 的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明的保护范围之中。