乳酸菌固态混菌发酵方法、所得菌剂及其用途

摘要

本发明公开了一种乳酸菌固态混菌发酵方法，本发明将屎肠球菌、乳酸杆菌、及粪肠球菌先接种至液态发酵培养基进行培养，得到三个菌种的种子液，再将三个菌种的种子液接入同一固态发酵培养基进行发酵培养，将所得的发酵物料烘干，向烘干后的发酵物料中添加酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸菌固态混菌发酵菌剂。本发明还公开了使用乳酸菌固态混菌发酵方法得到的乳酸菌固态混菌发酵菌剂及该菌剂在水产养殖水体水质改良中的用途。本发明可节约生产成本，降低发酵能耗，所得产品活性稳定，用于养殖水体水质改良有很好的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳酸菌发酵方法，尤其涉及一种乳酸菌固态混菌发酵方法，本发明还涉及用该方法制得的乳酸菌固态混菌发酵菌剂，本发明还进一步涉及了乳酸菌固态混菌发酵菌剂在养殖水体水质改良中的用途。

背景技术

近20年来,水产养殖业在我国得到了迅猛的发展，随着集约化程度的提高，养殖密度的增大，代谢产物也大幅增加，养殖水体污染日益严重；同时工业废水、生活污水的排放也使养殖水域环境质量日益下降。这不仅直接危害养殖对象，而且也是疾病频繁发生的主要诱因。因而，如何改善养殖水质成为水产养殖成败的关键问题之一。无度地使用各种药物和无度、无序、无处理地换水、排污成了养殖者的常用手段和措施。最终，前者破坏了养殖动物、微生物和环境所构成的动态平衡，导致疾病的爆发，并且危及养殖产品的食用安全，后者既加大了外来风险又增加了水源的污染，增加病害交叉感染和流行的机率。近年来，微生物制剂在水产养殖中作为饲料添加剂、池塘水质净化剂得到了广泛的应用，应用结果表明，微生态制剂不仅可以改善养殖水域环境，还可以提高养殖对象的机体免疫力，减少病害的发生，使养殖活动向着良性循环方向发展。

大量的研究表明，乳酸菌可促进养殖水体饵料生物大量繁殖、生长，并且可分解残饵、粪便及水中有机质，改良水质，抑制水体中有害菌的繁殖生长，调节菌藻平衡。乳酸菌固态产品保质期长短及保质期内乳酸菌活菌数与产品质量息息相关。乳酸菌活菌数低，则不易在水环境中成为优势菌群，无法发挥其功效。

现有乳酸菌固态发酵多为熟料发酵，能耗大，生产成本高，且多采用单菌种发酵，菌种单一，代谢产物种类及数量均有限，所得到的发酵产品的活菌数量低，保质期短，储存过程中活性不断降低，产品质量难以保障。

酵母多糖是一种绿色饲料添加剂，具有提高水产动物免疫功能，调节动物肠道微生态平衡(促进有益菌增殖、控制致病菌生长)，从而维持动物的生长和健康。因此，酵母多糖与益生菌的联用，在水产养殖中的应用具有很好的前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生产成本较低、产品活菌数高的乳酸菌固态混菌发酵方法。本发明的另一个目的是公开了使用本发明的乳酸菌固态混菌发酵方法所得菌剂和所述菌剂在养殖水体水质改良中的用途。

为达到所述目的，本发明的技术方案如下：

一种乳酸菌固态混菌发酵方法，包括如下步骤：

(a)将屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacid bacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）分别接种至液态发酵培养基进行培养，得到三个菌种的种子液。

(b)将上述三个菌种的种子液接入固态发酵培养基进行发酵培养。

(c)将步骤(b)所得的发酵物料烘干。

(d)向烘干后的发酵物料中添加酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸菌固态混菌发酵菌剂。

其中，上述步骤(a)中屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的接种量为1.8～2.2‰，接种至液态发酵培养基后在36～38℃恒温发酵24～30h；所述液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蔗糖4～6‰，柠檬酸三铵1.5～2.5‰，酵母膏4～6‰，乙酸钠1.5～2.5‰，磷酸氢二钾1.5～2.5‰，硫酸镁0.16～0.24‰，硫酸锰0.03～0.07‰，生石灰0.8～1.2‰，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至7.5～8.0；所述液态发酵培养基可无需灭菌处理，直接使用。

其中，上述步骤(a)中屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的接种量优选为2‰，接种至液态发酵培养基后在37℃恒温发酵24h；所述液态发酵培养基各组分含量优选为：按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰1‰，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节其pH值至8.0；所述液态发酵培养基可无需灭菌处理，直接接种发酵。

其中，上述步骤(b)中三个菌种的种子液的接种量相等，均为固态发酵培养基重量的27～33%，培养条件为：36～38℃恒温发酵48～54h；所述固态发酵培养基由以下组分组成：以麸皮为基质，按重量百分比记，蔗糖4～6‰，柠檬酸三铵1.5～2.5‰，酵母膏4～6‰，乙酸钠1.5～2.5‰，磷酸氢二钾1.5～2.5‰，硫酸镁0.16～0.24‰，硫酸锰0.03～0.07‰，生石灰2.5～3.5％，余量为麸皮；所述固态发酵培养基可无需灭菌处理，直接接种发酵。

其中，上述步骤(b)中将三个菌种的种子液接种至固态发酵培养基的接种量优选为30%，培养条件优选为：37℃恒温发酵48h；所述固态发酵培养基各组分含量优选为：以麸皮为基质，按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰3％，余量为麸皮；所述固态发酵培养基可无需灭菌处理，直接接种发酵。

其中，上述步骤(c)中发酵物料的烘干温度为48～52℃，烘干至发酵物料含水量低于10%即可。

其中，上述步骤(d)中向发酵物料中添加的酵母多糖重量为发酵物料重量的1.5～2.5‰，优选的，添加的酵母多糖重量为发酵物料重量的2‰。

用上述方法获得的乳酸菌固态混菌发酵菌剂和所述乳酸菌固态混菌发酵菌剂在养殖水体水质改良中的用途也属于本发明的保护范围。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）本发明所用的采用生料发酵（培养基不需灭菌），培养基中使用了廉价的农副产品麸皮为基质，发酵能耗大大降低，节约生产成本；

（2）本发明采用三种乳酸菌混合发酵，无论是活菌或是代谢产物都更加丰富，产品改良水质效果更佳；

（3）本发明的乳酸菌固态混菌发酵菌剂在储存过程中活性稳定，提高了产品质量。

本发明的详细内容可通过后述的说明及所附图而得到。

附图说明

图1为本发明乳酸菌固态混菌发酵方法的工艺路线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

本发明所涉及到的部分菌种购于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，屎肠球菌（Enterococcus Faecium）产品编号为：ACCC00658；乳酸杆菌（Lacticacid bacteria）产品编号为：ACCC11026；粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）产品编号为：ACCC10180；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产品编号为：ACCC02973。

本发明所涉及到的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）和侧孢芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室赠送提供。

预备试验例1乳酸菌的筛选

1实验材料与方法

1.1材料

养殖废水取自武汉市东西湖区养殖池塘。

1.2方法

向1000mL三角瓶中加入500mL养殖废水，高压灭菌处理后测定水中亚硝酸盐含量，再以104CFU/mL菌浓度投入试验菌，置于25℃光照培养箱，每隔24h，将养殖废水振荡均匀后取样，测定水中亚硝酸盐含量。

亚硝酸盐：依据国标GB/T11893-1989水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法测定。

2实验结果

亚硝酸盐是对鱼类毒害作用较强的物质，一旦超出安全值范围，必会导致鱼类大量死亡，因而需在短时间内将其降解，避免给养殖户带来巨大的经济损失。由表1的结果可以看出，屎肠球菌、乳酸杆菌及粪肠球菌相比其他试验菌而言，对亚硝酸盐的降解效果更快更好。

表1试验菌对养殖废水的亚硝酸盐降解作用

预备实施例1液态发酵培养基的制备

配制液态发酵培养基，其组成为：按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰1‰，余量为水；按重量百分比称取各组分加入水中，搅拌至溶解，调pH至8.0。

预备实施例2固态发酵培养基的制备

配制固态发酵培养基，其组成为：按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰3％，余量为麸皮；以麸皮为基质，按重量百分比称取各组分加入麸皮，搅拌混匀。

实施例1乳酸菌固态混菌发酵菌剂的制备

1.将购买来的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）菌株的菌粉分别接种于装有灭过菌的液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到这三个菌种的菌液。

2.将步骤1所得的三种菌液接种于装有灭过菌的固态发酵培养基的发酵袋中恒温发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵结束后将发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%，得到这三个菌种的菌粉。

3.将步骤2所得的三种菌粉再分别接种至液态发酵培养基进行扩大培养，接种量为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到三个菌种的种子液。

4.在发酵罐中加入固态发酵培养基，接种入三个菌种的种子液，每个菌种的种子液接种量均为固态发酵培养基重量的30%。发酵条件：发酵温度为37℃，发酵时间为48h。发酵结束后得到发酵物料。

5.将上述步骤4得到的发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%。

6.向烘干的发酵物料中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸固态菌混菌发酵菌剂。

对照例1屎肠球菌固态发酵菌剂

1.将购买来的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）接种于装有灭过菌的液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到屎肠球菌菌液。

2.将步骤1所得的屎肠球菌菌液接种于装有灭过菌的固态发酵培养基的发酵袋中恒温发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵结束后将发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%，得到屎肠球菌菌粉。

3.将步骤2所得的屎肠球菌菌粉再接种至液态发酵培养基进行扩大培养，接种量为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到屎肠球菌的种子液。

4.在发酵罐中加入固态发酵培养基，接种入屎肠球菌的种子液，种子液接种量为固态发酵培养基重量的30%。发酵条件：发酵温度为37℃，发酵时间为48h。发酵结束后得到发酵物料。

5.将上述步骤得到的发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%。

6.在烘干的发酵物料中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到屎肠球菌固态发酵菌剂。

对照例2乳酸杆菌固态发酵菌剂

1.将购买来的乳酸杆菌（Lacticacid bacteria）接种于装有灭过菌的液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到屎肠球菌菌液。

2.将步骤1所得的乳酸杆菌菌液接种于装有灭过菌的固态发酵培养基的发酵袋中恒温发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵结束后将发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%，得到乳酸杆菌菌粉。

3.将步骤2所得的乳酸杆菌菌粉再接种至液态发酵培养基进行扩大培养，接种量为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到乳酸杆菌的种子液。

4.在发酵罐中加入固态发酵培养基，接种入乳酸杆菌的种子液，种子液接种量为固态发酵培养基重量的30%。发酵条件：发酵温度为37℃，发酵时间为48h。发酵结束后得到发酵物料。

5.将上述步骤得到的发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%。

6.向烘干的发酵物料中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸杆菌固态发酵菌剂。

对照例3粪肠球菌固态发酵菌剂

1.将购买来的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）接种于装有灭过菌的液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到屎肠球菌菌液。

2.将步骤1所得的粪肠球菌菌液接种于装有灭过菌的固态发酵培养基的发酵袋中恒温发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵结束后将发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%，得到粪肠球菌菌粉。

3.将步骤2所得的粪肠球菌菌粉再接种至液态发酵培养基进行扩大培养，接种量为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到粪肠球菌的种子液。

4.在发酵罐中加入固态发酵培养基，接种入粪肠球菌的种子液，种子液接种量为固态发酵培养基重量的30%。发酵条件：发酵温度为37℃，发酵时间为48h。发酵结束后得到发酵物料。

5.将上述步骤得到的发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%。

6.向烘干的发酵物料中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到粪肠球菌固态发酵菌剂。

试验例1本发明产品对养殖水体水质改良效果研究

1.试验材料与方法

1.1材料

养殖废水取自武汉市东西湖区养殖池塘

1.2方法

向1000mL三角瓶中加入500mL养殖废水，高压灭菌处理后测定水中氨氮、亚硝酸盐、总磷及COD，再以104CFU/mL菌浓度分别投入本发明实施例1的菌剂及三个对照例的菌剂，置于25℃光照培养箱，每隔24h，将养殖废水振荡均匀后取样，分别测定氨氮、亚硝酸盐、总磷及COD。

氨氮：依据国标HJ535-2009水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法测定；

亚硝酸盐：依据国标GB/T11893-1989水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法测定；

总磷：依据国标GB/T11893-1989水质总磷的测定钼酸铵风光光度法测定

COD：依据国标HJ399-2007水质化学需氧量的测定快速消解分光光度法测定。

2.试验结果

2.1养殖废水氨氮变化

氨氮是水体中无机氮的主要存在形式，以离子氨和分子氨的形式存在。其中分子氨对水产养殖动物有害，浓度过高会抑制养殖动物的生长，甚至死亡，即使在安全浓度范围，对养殖动物的生理功能也有显著的影响，因此控制氨氮是健康养殖的关键措施之一。

如表2所示，投入菌剂后的养殖废水中的氨氮均呈先上升后下降趋势，这可能是因为乳酸菌还原亚硝酸盐的产物中含有氨氮。同时可以看出，本发明产品相比于三个对照例的乳酸菌固态发酵菌剂，对养殖废水的氨氮降解效果更佳。

表2本发明产品及三种乳酸菌固态发酵菌剂对养殖废水的氨氮降解作用

2.2养殖废水亚硝酸盐变化

亚硝酸盐是对鱼类毒害作用较强的物质，一旦超出安全值范围，必会导致鱼类大量死亡，因而需在短时间内将其降解，避免给养殖户带来巨大的经济损失。

如表3所示，投入菌剂后的养殖废水中亚硝酸盐均呈下降趋势，但本发明产品相比于三个对照例的乳酸菌固态发酵菌剂，对养殖废水的亚硝酸盐降解作用更快。

表3本发明产品及三种乳酸菌固态发酵菌剂对养殖废水的亚硝酸盐降解作用

2.3养殖废水总磷变化

无机磷是浮游植物繁殖生长最重要的三大营养盐之一，也是水产动物生长发育所必须的重要营养元素。由于饵料和水产动物排泄物在养殖系统中积累，在高密度养殖的养殖水体中，作为主要营养元素的磷含量普遍偏高，而且具有随时间增加而升高的规律，易造成养殖水体的富营养化，导致有害藻类的大量繁殖，危害水产动物。

如表4所示，投入菌剂后的养殖废水中总磷均呈下降趋势，但本发明产品相比于三个对照例的乳酸菌固态发酵菌剂，对养殖废水的总磷降解作用明显更好。

表4本发明产品及三种乳酸菌固态发酵菌剂对养殖废水的总磷降解作用

2.4养殖废水COD变化

有机物污染是导致水产养殖病害的另一个重要因素，有机物过多促使有害微生物大量繁殖，不仅消耗大量溶氧，同时产生许多有害的代谢产物如氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等。有机物污染与水体COD呈显著的正相关性。

如表5所示，投入菌剂后的养殖废水中COD均呈下降趋势，但本发明产品相比于三个对照例的乳酸菌固态发酵菌剂，对养殖废水的COD降解效果更好。

表5本发明产品及三种乳酸菌固态发酵菌剂对养殖废水的COD降解作用

试验例2本发明产品储存过程中活性变化规律

1.实验材料与方法

1.1培养基

检测培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2活菌数测定方法

将待测样品按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从稀释液中分别吸取100μl菌液涂平板，每一稀释度做3次重复。将无菌培养基熔化后倒平板，待凝固后编号，然后量取吸取100μl菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度共用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板于37℃倒置培养24h，进行菌落计数。选择适宜的稀释度Z，采用菌落数在30-300个之间的平板进行计数。

1.3活菌数计算方法

W=X×Z×10

式中W-------样品中乳酸菌活菌数，CFU/ml；

X-------平板上乳酸菌菌落平均数；

Z-------样品稀释倍数。

2.实验结果

表6为本发明实施例1菌剂及未添加酵母多糖的本发明实施例1发酵物料、三个对照例的乳酸菌固态发酵菌剂在储存半年时间内，每月取样后采用稀释涂平板法测定活菌数。

表6本发明及未添加酵母多糖的本发明发酵物料、三种乳酸菌固态发酵菌剂在储存半年内活菌数变化

如表6所示，本发明产品相比于对照例的三种乳酸菌菌剂，生物量高，在储存过程中活菌数降低幅度相对较小。同时可以看出，乳酸菌固态混菌发酵菌剂添加酵母多糖后，生物量变化幅度小，活性更加稳定。