一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法

摘要

本发明涉及一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法，按照如下步骤操作：第一步，利用机械法分离出生后7天小鼠触须部毛囊；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F-12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养；第三步，将传代两次的毛囊干细胞体外培养形成拟胚体EB；第四步，制作小鼠成纤维细胞培养及饲养层细胞；第五步，EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞分化。本发明方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达类似的原始生殖细胞。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种小鼠毛囊干细胞向原始生殖细胞分化的技术方法，特别是涉及一种将小鼠毛囊干细胞采用体外培养方式，经过形成拟胚体（EB）进行诱导，然后以小鼠成纤维细胞为饲养层采用共培养方式诱导形成原始生殖细胞的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。 

背景技术：

从2003年开始，多个实验组报导了他们将哺乳类干细胞，包括人类干细胞，诱导为各发育阶段的生殖细胞。在以雄性配子为目标的报导中，2003年Toyooka等首先以Vasa基因为PGC报告系统(reporter system)及BMP4为诱导因子，将小鼠干细胞诱导为PGCs（原始生殖细胞primordial germ cells）；并接着将分离出来的PGCs与睾丸细胞混合后移植到睾丸中产生精子。2004年，Geijsen等利用SSEA1为早期生殖细胞表面标记，加上RA(retinoic acids)诱导小鼠干细胞，成功在体外获得单倍体，並将其注射入小鼠卵子中，受精卵发育至囊胚期。德国研究小组Nayernia等同样利用RA诱导小鼠干细胞，并以Stra8及Prm1为报告系统，获得的类精细胞在注射入卵子后能获得后代。此外，Nayernia等人也用小鼠骨髓干细胞在体外转分化出了原始生殖细胞以及精原细胞样的细胞。2009年，我国研究小组Yu等报导成功将小鼠干细胞诱导为精子。这项研究值得关注的是首次将高表达DAZL基因做为诱导配子的方案。2011年日本Hayashi等利用小鼠胚胎干细胞，加上BMP4等诱导因子，分离出PGCs。在移植到睾丸后，获得成熟精子，并获得下一代小鼠。 

综合最近研究进展，大都采用胚胎干细胞（ESC）作为原材料，但是ESC处在哺乳动物个体发育的早期，而且取材困难，因此采用成体干细胞代替ESC向生殖细胞分化可以更好地解决问题。毛囊干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的多能成体干细胞。 

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法。本发明方法分离出生后7天小鼠触须部毛囊，体外培养毛囊干细胞，将传代两次的毛囊干细胞体外培养形成拟胚体（EB）；然后以小鼠成纤维细胞（MEF）为饲养层，采用共培养的方式分化发育形成原始生殖细胞样细胞，并具有与体内正常发育的原始生殖细胞相类似的形态和特异基因表达特征。 

为了实现上述发明目的，本发明方法按照如下步骤操作：第一步，利用机械法分离小鼠触须部毛囊：用手术镊子将出生后7天小鼠毛囊从触须部皮肤上取下，转移至磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）+10%胎牛血清（FCS）的操作液中，在操作液中清洗，并去除与毛囊连接在 一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪等杂质，在新鲜DMEM/F-12（细胞培养液Dulbecco's Modified Eagle Medium，F-12 Nutrient Mixture）中将毛囊清洗；第二步，体外培养毛囊干细胞：毛囊经DMEM/F-12洗完后，置于0.25% Trypsin-0.04% EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F-12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，以培养当天为零代，每4天传代一次；第三步，毛囊干细胞体外形成EB：当毛囊干细胞培养到第二代又3-4天时（即培养的11-12天），离心收集细胞，弃上清，加入0.25%Trypsin室温消化5分钟，然后轻轻吹打至单细胞，终止消化，Medium 199洗两遍后转入24孔板悬浮培养，置于EB培养基中培养；第四步，小鼠成纤维细胞（MEF）培养及饲养层细胞的制作：将怀孕13.5天的母鼠杀死取出胎鼠，取出头、四肢、内脏、尾将躯干转移至磷酸盐缓冲液清洗，置于0.25% Trypsin-0.04% EDTA，37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后，加入10%胎牛血清（FCS）终止，转入成纤维细胞培养基中培养，以培养当天为零代，细胞达90%汇合度时传代；取1-3代成纤维细胞，倒掉培养基，加入含有10μg丝裂霉素C的成纤维细胞培养液，置于培养箱中1.5-2小时，取出用磷酸盐缓冲液清洗，用0.25% Trypsin将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止后DMEM高糖清洗，转入24孔板贴壁培养；第五步，EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞（PGC）分化：用0.25% Trypsin消化EB,室温消化过程中用枪吹打至单细胞，用血清终止消化，收集细胞，离心；弃上清，加入PGC培养液悬浮细胞，将细胞稀释到细胞浓度为5×10⁴个/ml PGCs培养液里；向铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的24孔中加入0.5ml重悬的细胞，将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2中培养；培养液包括：DMEM高糖,10%胎牛血清(FCS),0.23mM丙酮酸钠,0.1mM NEAA(Non-Essential Amino Acids,非必需氨基酸,Hyclone公司),2mM L-谷氨酰胺，0.1mM β-巯基乙醇,20ng/ml表皮生长因子（EGF）,40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）,40ng/ml干细胞生长因子（SCF）。 

本发明方法第二步所述毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12，2% B-27，20ng/ml表皮生长因子（EGF），40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），1%青链霉素。 

本发明方法第三步所述EB培养基包括Medium 199(pH 7.0),3mg/ml牛血清蛋白（BSA）,1mg/ml胎球蛋白,5ul/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS),0.23mM丙酮酸钠,1ng/ml表皮生长因子（EGF）,5mIU/ml促卵泡素（FSH）,3mIU/ml促黄体素（LH）。 

本发明方法第四步所述成纤维细胞培养基包括：DMEM高糖、10%胎牛血清（FCS），1%丙酮酸钠,1%NEAA，1%青链霉素。 

本发明方法成功利用机械法分离出生后7天小鼠触须部毛囊，体外培养毛囊干细胞（HFSC），利用HFSC体外形成EB的方法进行分化，分化后与小鼠成纤维细胞采用共培养的方式进行诱导，获得了与体内正常原始生殖细胞（PGC）形态和特异分子标记表达类似的PGC。 

附图说明：

图1为出生后7天小鼠触须部毛囊的分离显微图。 

图2为小鼠毛囊干细胞体外培养显微图。 

图3为传代两次的毛囊干细胞体外诱导形成EB显微图。 

图4为小鼠成纤维细胞饲养层制作。 

图5为毛囊干细胞经EB诱导后与MEF共培养向PGC分化的各时间段显微图。 

图6为检测毛囊干细胞分化的PGC是否表达正常PGC相关基因。 

图7为毛囊干细胞分化的PGC进行免疫荧光组织化学染色。 

具体实施方式：

下面结合附图并通过具体实施例对本发明方法做进一步阐述。 

实施例1、 

1、小鼠毛囊的分离 

毛囊干细胞（HFSC）来源于出生后7天小鼠触须部皮肤毛囊。用手术镊子将出生后7天小鼠毛囊从触须部皮肤上取下，见图1中1，转移至磷酸盐缓冲液（PBS,pH 7.0）+10%胎牛血清（FCS，Hyclone公司）的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与毛囊连接在一起的皮脂腺，立毛肌，脂肪等杂质，见图1中2,在新鲜DMEM/F-12(Hyclone公司)中将毛囊洗3次。 

2、毛囊干细胞的体外培养 

毛囊经DMEM/F-12（Hyclone公司）洗完3遍后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA（Hyclone公司），37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后加入10%血清终止消化，于DMEM/F-12（Hyclone公司）中洗3遍，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12（Hyclone公司）；2%B-27(Gibco公司)；20ng/ml表皮生长因子（EGF，Sigma公司）；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Peprotech公司）；1%青链霉素（Hyclone公司），以培养当天为零代，每4天传代一次。图2所示为小鼠毛囊干细胞体外培养显微图。图2中1为过细胞筛后单细胞悬液，培养1天后有明显细胞聚集物出现（图2中2），继续培养3天后，克隆球变大，边界清晰（图2中3），传代1次后克隆的边缘非常光滑紧凑，克隆呈一个个的球状（图2中4-5），传代两次后细胞的克隆球数进一步增多（图2中6）。 

3、毛囊干细胞体外形成拟胚体（EB） 

当毛囊干细胞培养到第二代又3-4天时（即培养的11-12天），1500rpm离心5min收集细胞，弃上清，加入0.25%Trypsin（Hyclone公司）室温消化5分钟，然后轻轻吹打至单细胞，终止消化，Medium 199洗两遍后转入24孔板（SARSTEDT公司）悬浮培养，置于EB 培养基中培养，EB培养基包括Medium 199(Gibco公司，pH 7.0),3mg/ml牛血清白蛋白（BSA,Sigma公司），1mg/ml胎球蛋白（Fetuin，Merck公司）,5ul/ml ITS(胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠Gibco公司),0.23mM丙酮酸钠（Hyclone公司）,1ng/ml表皮生长因子（EGF,Sigma公司）,5mIU/ml促卵泡素（FSH,Sigma公司）,3mIU/ml促黄体素（LH，Sigma公司）。图3所示为传代两次的毛囊干细胞体外诱导形成EB显微图。图3中1是将毛囊干细胞消化为单细胞，图3中2是培养1天后形成的EB前体，经过2-3天后EB边缘清晰并且变得光滑，呈不规则形状（图3中3-4）。 

4、小鼠成纤维细胞（MEF）培养及饲养层细胞的制作 

将怀孕13.5天的母鼠杀死取出胎鼠，取出头、四肢、内脏、尾等将躯干转移至磷酸盐缓冲液清洗3遍，置于0.25% Trypsin-0.04%EDTA（Hyclone公司），37℃消化10分钟，轻轻吹打混匀后，加入10%胎牛血清（FCS，Gibco公司）终止，转入成纤维细胞培养基中培养，成纤维培养基包括：DMEM高糖（Hyclone公司）、10%胎牛血清（FCS，Gibco公司），1%丙酮酸钠（Hyclone公司）,1%NEAA（Hyclone公司），1%青链霉素（Hyclone公司）；以培养当天为零代，细胞达90%汇合度时传代；取1-3代成纤维细胞，倒掉培养基，加入4ml含有10μg丝裂霉素C(索来宝公司)的成纤维细胞培养液，置于培养箱中1.5-2小时，取出用磷酸盐缓冲液洗5遍，用0.25% Trypsin（Hyclone公司）将贴壁的成纤维细胞消化下来，终止后DMEM高糖洗3遍，转入24孔板贴壁培养。图4中1为转入24孔板12小时后的饲养层，细胞汇合率达到50%左右，图4中2表示成纤维细胞为GFP阴性（为了与GFP阳性的PGC区别开来）。 

5、EB培养后与饲养层共培养向原始生殖细胞（PGC）分化 

用0.25%Trypsin（Hyclone公司）消化EB,室温消化过程中用枪吹打至单细胞，用10%胎牛血清（FCS，Gibco-BRL）终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min；弃上清，加入少量PGC培养液悬浮细胞，将细胞稀释到细胞浓度为5×10⁴个/ml PGCs培养液里；向铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的24孔中加入0.5ml重悬的细胞，将培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO₂中培养，培养液包括：DMEM高糖（Hyclone公司）,10%胎牛血清(FCS，Gibco公司),0.23mM丙酮酸钠（Hyclone公司）,0.1mM NEAA（Hyclone公司）,2mM L-谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇（sigma公司）,20ng/ml表皮生长因子（EGF，sigma公司）,40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Peprotech公司）,40ng/ml干细胞生长因子（SCF，sigma公司）。图5中1为EB消化成的单细胞与底下铺的饲养层共培养，图5中2为1天后很多细胞贴壁，到PGC分化的第5天，出现折光度大，“亮晶晶”的细胞(图5中3)，这些细胞的数目随着培养时间的增加，数目越来越多（图5中4-6）。 

6、RT-PCR检测分化的PGC生殖细胞特异基因表达 

定量PCR运用SYBRPremix Ex TaqTM kit（TaKaRa公司）和ABI 7300 real-time PCR仪（Applied Biosystems），采用β-actin作为内参基因。检测如下基因：Dazl,Fragllis，Stella，Figa，Oct3/4，SCP3。图6显示在PGC分化过程中，PGC特异基因Dazl,Blimp1，Stella在分化第4天表达较高，C-kit在第6天表达较高，vasa在第2天表达较高。 

体系如下： 

Mix的配制： 

每个标本在每次反应中需重复6次，并设置阴性对照(以去核糖核酸酶水代替cDNA模板)，以排除加样误差及模板污染，模板相对定量法参考ABI7300System Software，以action为内参照,任选一野生型标本CT值为标准值/10计算vvt,标准差/标准误差及基因表达的相对定量。通过t-test检验目的基因不同的样本中的表达差异是否具有统计学意义。 

7、细胞免疫荧光化学检测分化的PGC特定基因表达 

取出分化的PGC，弃培养基，PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛（索来宝公司）室温固定15分钟。或PBS洗3遍，每遍5分钟。用PBST（PBS+0.5%Trition-100）溶液进行透化，室温10分钟。PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.0）洗1遍，5分钟。加入含10％山羊血清或马血清(索来宝公司)的PBST（PBS+0.5%Trition-100），室温封闭30－60分钟。弃封闭液，加入一抗（1：50－1：200，abcam公司）稀释于封闭液中，4℃过夜或37℃孵育2小时。1％BSA的PBS洗3遍，每遍5分钟。加入二抗（1：50－1：200，碧云天公司）稀释于二抗稀释液中，37℃避光放置1小时。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入终浓度的DAPI（碧云天公司），室温放置5分钟。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入500μl PBS或PBS甘油（1：1）在荧光显微镜下拍照或避光保存。图7中1-3说明分化的PGC呈Vasa阳性并在细胞质表达，图7中4-6说明分化的PGC呈Dazl阳性并在细胞质表达，图7中7-9说明分化的PGC呈OCT-4阳性并在细胞核表达。