彩色生物纤维素在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用

摘要

本发明涉及彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，本发明以彩色的生物纤维素凝胶作为底物与纤维素酶产生菌的发酵培养液反应，反应完成后直接观测溶液的颜色，而不使用DNS试剂进行显色反应。本方法利用纤维素酶破坏生物纤维素凝胶的空间网状结构，使进入其中的色素分子释放出来显色，从而简便、快速地实现纤维素酶产生菌活性的鉴定。本发明的方法不依靠对还原糖的显色反应，不使用DNS试剂进行显色反应，一方面能够降低检测的误差，另一方面也简化了检测步骤，节约了成本，提高了检测效率。

说明书

技术领域

本申请涉及生物技术领域，特别涉及彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性的快速检测中的应用。

背景技术

纤维素酶（cellulase）是指在纤维素分解过程中能够起生物催化作用的酶，其通常使纤维素转化为还原糖类。纤维素酶是一种复合酶，主要由外切β葡聚糖酶、内切β葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶组成。其在饲料、食品、纺织品领域均有广泛的应用。目前发现，可以产纤维素酶的微生物很多，但是一般用于工业生产的主要是真菌类，如木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）和青霉属（penicillium）等。其常常通过诱变选育而来，但是这也导致了这些菌种容易退化，退化之后产酶能力大大降低甚至消失，因此在纤维素酶的生产中，如果不能及时发现纤维素酶产生菌的退化，常常会造成人力物力的大量浪费，无形中增加了生产成本，降低了生产效率。

目前，常用的纤维素酶产生菌活性测定方法为DNS法，其基本原理是以纤维素类原料（如试纸等）为底物，加入纤维素酶产生菌的发酵培养液，其中产生的纤维素酶就能够使纤维素底物被转化为还原糖，再加入显色试剂DNS与还原糖反应，生成呈色物质，根据溶液的颜色来判断或计算纤维素酶产生菌的活性。但是上述方法存在许多缺陷，首先，DNS法是实质上是以还原糖的量为直接检测指标的，底物纯度往往不高，其在含有纤维素的同时还常常含有半纤维素，甚至是还原糖类，而纤维素酶产生菌发酵培养液中也常常会含有糖类物质，因此在检测时会出现较大误差；其次，上述的方法较为复杂，操作繁琐，还要使用额外的DNS化学试剂，增加成本，且检测效率较低。

生物纤维素（Biocellulose），也称细菌纤维素（Bacterial  cellulose，BC）是指在不同条件下，由醋酸菌属等中的某种微生物合成的纤维素的统称。与天然纤维素相比，其具有很高的纯度、精细的空间网状结构、很强的持水性能及生物可降解性。目前已广泛应用于食品、造纸、医疗等多个领域。

彩色生物纤维素的制备方法是本领域已知的，例如CN102100365A、CN101703222A中都公开了彩色椰果（即生物纤维素）的生产方法。 

发明内容

针对上述现有技术中的缺陷，本发明提供了彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用。

本发明的彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，其以彩色的生物纤维素凝胶作为底物与纤维素酶产生菌的发酵培养液反应，反应完成后直接观测溶液的颜色，而不使用DNS试剂进行显色反应。

上述的彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用， 彩色生物纤维素凝胶优选以凝胶颗粒的形式使用。

上述的彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，彩色生物纤维素凝胶颗粒优选在使用前用清水反复洗涤至洗涤用水无色。

上述的彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，彩色生物纤维素凝胶颗粒的用量优选为纤维素酶产生菌发酵培养液重量的1/5-1/20。

上述的彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，纤维素酶产生菌为木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）和青霉属（penicillium）微生物中的一种或多种。

上述的彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，其中纤维素产生菌的发酵培养液并无特殊要求，只要是无色并能够使纤维素酶产生菌生长、繁殖，产生纤维素酶即可。

上述的彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，所述的反应是在35-55℃下反应40-70min。

本发明中的方法利用纤维素酶破坏生物纤维素凝胶的空间网状结构，使进入其中的色素分子释放出来显色，从而简便、快速地实现纤维素酶产生菌活性的鉴定。本发明的方法不依靠对还原糖的显色反应，不使用DNS试剂进行显色反应，一方面能够降低检测的误差，另一方面也简化了检测步骤，节约了成本，提高了检测效率。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，其不应该限制本发明的范围，任何在本领域可以容易的作出的改变都可以被认为在本发明的范围之内。

实施例1：彩色生物纤维素检测纤维素酶产生菌活性

按照CN102100365A说明书实施例1的方法制备高色牢度的绿色生物纤维素凝胶（即椰果）；用清水反复洗涤至洗涤用水无色后将其切割成绿色生物纤维素凝胶颗粒。

配制纤维素酶产生菌培养基：蔗糖35g、酵母粉10g，硫酸铵4g，加水至200ml，灭菌备用；

纤维素酶产生菌发酵培养液的制备：无菌条件下，向上述纤维素酶产生菌培养基接种经过活化的康氏木霉，28℃下培养80小时，制得康氏木霉发酵培养液。

将上述绿色生物纤维素凝胶颗粒10g置于50ml的康氏木霉发酵培养液中，35℃下反应70分钟；过滤除去剩余的生物纤维素凝胶颗粒。得到绿色溶液。

由于康氏木霉经过发酵培养产生了纤维素酶，纤维素酶破坏了生物纤维素凝胶的空间网状结构，其中的绿色素释放出来，使溶液呈现绿色。

对比实施例1：

按照同样的方法制备绿色生物纤维素凝胶颗粒和纤维素酶产生菌培养基。不接种康氏木霉，直接将绿色生物纤维素凝胶颗粒10g置于50ml的康氏木霉发酵培养液中，35℃下反应70分钟；过滤除去剩余的生物纤维素凝胶颗粒。得到无色的溶液。

由于未接种康氏木霉，则溶液中没有包含纤维素酶，不能破坏了生物纤维素凝胶的空间网状结构，不能释放出绿色色素，因此溶液呈现无色。

 

实施例2：彩色生物纤维素检测纤维素酶产生菌活性

按照CN101703222A说明书实施例1的方法制备红色的红曲生物纤维素凝胶（即红曲椰果）；用清水反复洗涤至洗涤用水无色后将其切割成红色的生物纤维素凝胶颗粒。

配制纤维素酶产生菌培养基：葡萄糖20g、酵母粉12g、甘油1g、硫酸铵3g、磷酸二氢钾2g、加水至200ml，灭菌备用；

纤维素酶产生菌发酵培养液的制备：无菌条件下，向上述纤维素酶产生菌培养基接种经过活化的桧状青霉，30℃下搅拌培养90小时，制得桧状青霉发酵培养液。

将上述红色生物纤维素凝胶颗粒15g置于300ml的桧状青霉发酵培养液中，55℃下反应40分钟；过滤除去剩余的生物纤维素凝胶颗粒。得到红色溶液，经721分光光度计检测，在490nm处的吸光值为0.732。

由于桧状青霉经过发酵培养产生了纤维素酶，纤维素酶破坏了生物纤维素凝胶的空间网状结构，其中的红色素释放出来，使溶液呈现红色。

对比实施例1：

按照同样的方法制备红色生物纤维素凝胶颗粒和纤维素酶产生菌培养基。接种退化的桧状青霉，30℃下搅拌培养90小时，制得退化桧状青霉发酵培养液。将红色生物纤维素凝胶颗粒15g置于300ml的桧状青霉发酵培养液中，55℃下反应40分钟，过滤除去剩余的生物纤维素凝胶颗粒。得到淡红色的溶液，经721分光光度计检测，在490nm处的吸光值为0.267。

由于接种的是退化的桧状青霉，其纤维素产酶活性退化，则溶液中仅包含少量的纤维素酶，少量的纤维素酶仅仅能轻微破坏生物纤维素凝胶的空间网状结构，释放出少量的红色素，因此溶液呈现淡红色。

 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。