石榴酸或石榴酸化合物在提高体内DHA含量上的应用

摘要

本发明属于食品营养学、临床营养学领域，主要是应用石榴酸或石榴酸化合物来提高哺乳动物和人类体内的二十二碳六烯酸（DHA）的含量；石榴酸化合物包括石榴酸酯、石榴酸盐或石榴酸代谢物；石榴酸包括含有石榴酸的石榴籽油或者含有石榴酸的栝楼籽油。本发明的石榴酸或石榴酸化合物的服用方法为口服。

说明书

技术领域

本发明属于食品营养学、临床营养学领域，主要是应用石榴酸或石榴 酸化合物来提高哺乳动物和人类体内的二十二碳六烯酸（DHA）的含量 。

背景技术

DHA（Docosahexaenoic acid, C22:6n-3），二十二碳六烯酸，俗称 脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，属于Omega-3不饱 和脂肪酸家族中的重要成员。DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主 要元素，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高 达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%，因此，对胎婴儿智 力和视力发育至关重要。研究表明，足量DHA的摄入，可以减少产后抑 郁；DHA以及其衍生物可以杀死多种癌细胞；DHA可以抑制发炎前驱物 质的形成，具有消炎作用；可以降低血脂肪、预防心脑血管疾病。国 外有研究显示，DHA摄入适宜，可降低患阿尔茨海默氏老年痴呆症的风 险，并且能够减缓与年龄增长相关的认知能力的衰退。不仅对老年人 ，DHA对健康年轻人保持全身和脊椎的骨密度峰值也有积极作用。

目前，市场上的DHA补充剂主要有三类，一类是鱼类DHA制品，第二类 是藻类DHA制品，第三类是蛋黄DHA。但是摄入之后对体内的DHA含量的 上升有限，因此利用营养物质提高哺乳动物体内DHA的新方法需要研究 。

共轭亚麻酸（Conjugated linolenic acid）是一种十八碳共轭三烯 脂肪酸，具有非常有益的生理活性，主要包括：抗癌、抗致癌、降血 脂、减肥等。其中，共轭亚麻酸可以改变脂代谢等一系列功能，以及 其在体内转化为共轭亚油酸（conjugated linoleic acid, 9c,11 t-CLA），从而发挥更多的生理功能。共轭亚麻酸可以按双键的位置不 同（8,10,12-18:3和9,11,13-18:3）和双键的几何构型不同（c,c,c- ，c,t,c-，c,t,t-等）而存在不同的异构体，其中，石榴酸（punici c acid, 石榴酸），也称栝楼酸，即9c,11t,13c-18:3是主要的一种 共轭亚麻酸异构体，其结构式如下：

。

石榴酸主要存在于石榴（Punica granatum）和栝楼（Trichosanthe s kirilowii）的种子中，据报道，石榴籽油中含有60~80%的石榴酸 ，不同品种的含量有差别。因此石榴酸是一种无毒、天然、且口服有 效的食品成分。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种石榴酸或石榴酸化合物在提高体 内DHA含量上的应用法，采用本发明的方法能提高哺乳动物和人类体内 DHA的含量。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种石榴酸或石榴酸化合物在提 高体内DHA含量上的应用。

作为本发明的石榴酸或石榴酸化合物在提高体内DHA含量上的应用的改 进：用于提高动物或人体体内的DHA含量。

作为本发明的石榴酸或石榴酸化合物在提高体内DHA含量上的应用的进 一步改进：石榴酸化合物为石榴酸酯、石榴酸盐或石榴酸代谢物。

作为本发明的石榴酸或石榴酸化合物在提高体内DHA含量上的应用的进 一步改进：石榴酸为含有石榴酸的石榴籽油或者含有石榴酸的栝楼籽 油。

作为本发明的石榴酸或石榴酸化合物在提高体内DHA含量上的应用的进 一步改进：

将石榴酸或石榴酸化合物与活性物质混合后进行使用；

所述活性成分为维生素、脂肪酸、酚酸类、黄酮类或抗氧化物质。

作为本发明的石榴酸或石榴酸化合物在提高体内DHA含量上的应用的进 一步改进：

脂肪酸为n-3多不饱和脂肪酸、共轭亚油酸、共轭三烯酸异构体或共轭 三烯酸复合体；

酚酸类为茶多酚或儿茶素；

黄酮类为芦丁或竹叶黄酮。

n-3多不饱和脂肪酸为亚麻酸、DHA和EPA。

本发明中，石榴酸或石榴酸化合物可作为营养补充剂，以提高哺乳动 物及人体内的DHA的含量。

本发明中，石榴酸或石榴酸化合物可以来源于石榴籽油、栝楼籽油等 富含石榴酸的油脂，也可以来源于化学合成。

本发明中，石榴酸或石榴酸化合物采用口服的形式；可单独服用，也 可以在饲料或食品中，以油脂载体化合物等形式。该食品包括功能食 品、动物饲料、牛奶、乳类、谷物食品、婴儿食品、老年食品等。本 发明中，石榴酸化合物与a-生育酚同时存在。本发明中，石榴酸或石 榴酸化合物的应用形式可以是通过乳剂、软凝胶、冲剂、乳品、微乳 液、以及食用油。

本发明属于一种提高动物或人体体内DHA含量的方法，这种方法包括给 动物或人服用石榴酸或石榴酸化合物，以单剂量或多剂量喂给动物或 人，喂食的载体可以多样化。可以营养补充产品的形式使用石榴酸或 石榴酸化合物。营养补充产品包括谷物食品、牛奶、酸奶等乳制品、 婴儿食品、老年配方食品、体重控制产品、运动营养配方食品、饮料 等、低碳水化合物食品、糖尿病人专用食品以及相关保健产品。可将 石榴酸或石榴酸化合物制成动物食品包括宠物饲料（猫粮、狗粮、其 他宠物饲料等）。

本发明的服用方法为口服；用量为石榴酸0.15~3g/d，或者是石榴籽油 0.25~5 mL（石榴酸含量为60%）或石榴籽油0.1875~3.75 mL （石 榴酸含量为80%）。

备注说明：石榴酸含量为60%是指1000mL石榴籽油中含有600g石榴酸。 其余类同。

本发明可接受的载体包括胶囊、软胶囊、片剂、乳剂等，以软胶囊或 硬胶囊形式的补充食品，其胶囊填充物可以包括a-生育酚、可食用明 胶、凝胶、淀粉、糊精、淀粉衍生物。

本发明具有如下优点：

1.简单的通过服用石榴酸或石榴籽油或其他富含石榴酸的油脂，即可 提高体内的DHA的含量，可以起到抗氧化，提高认知等的作用。

2.石榴籽油安全无毒，富含石榴酸（60~80%），是一种很好的补充DH A的新资源。完全可以采取冷榨的方式获取（常规方式），排除了有机 溶剂提取的不安全因素。

3.石榴籽油是采取石榴下脚料石榴籽进行压榨得到的，可以是一种变 废为宝的好方法。

4.目前中老年人补充DHA大多通过摄取鱼油或深海鱼油，但是中老年的 肝脏的吸收以及排毒功能较差，不能很好的吸收及利用DHA，而石榴酸 摄入量少，且在体内的转化率高达90%以上（多篇文献报道）。

5.在正常饮食外额外摄入石榴酸或石榴籽油，对肝脏和脂肪组织并没 有造成不良影响。没有脂滴产生。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为肝脏和脂肪的切片对比图。

具体实施方式

实验1、

采用六周龄的雄性ICR小鼠，适应7 d后，采用以饲料（常规饲料）中 添加含1%的石榴酸的饲料喂养的作为实验组(n = 8)，即，在每kg饲 料中加入含有10g石榴酸的石榴籽油（石 榴酸含量为80%）。其中对照组饮食中，以与石榴籽油等体积的玉米油 代替石榴籽油。自由采食，饲养6周后，处死，取肝脏、肾脏、心脏和 脾脏等备用（用来测定体内DHA含量的水平）。

对ICR小鼠内脏等样品进行总脂肪提取后，对总脂肪进行甲酯化，采用 GC分析ICR小鼠内脏的脂肪酸组成情况，以及石榴酸在体内的代谢情况 。

具体实验步骤如下：

1）总脂肪的提取

a.萃取：根据Floch等人（1957）的方法以氯仿:甲醇=2:1萃取。即取 0.5g内脏，置于20 mL试管中，加入10 mL含50 mg/L 2,6-二叔丁 基对甲酚（BHT）的氯仿甲醇溶液，充分混匀震荡，4℃下浸提24h。

b.过滤：过滤将提取好的样品，过滤至100 ml分液漏斗中。原萃取试 管再用5 ml 氯仿:甲醇 = 2:1清洗，转入分液漏斗；再用5 ml氯 仿清洗，转入分液漏斗。除去滤纸，再加入4 ml生理盐水，并放入分 液漏斗中。轻摇分液漏斗，并打开塞子放气，重复，直到里外气压平 衡。然后剧烈震荡分液漏斗。分液漏斗静置约4小时，两个液面完全分 开。然后收集下层（氯仿层）至圆底蒸发瓶中。

c.浓缩：用圆底蒸发瓶接取分液漏斗的下层有机相，于30℃水浴中抽 真空旋转蒸发，用2 ml氯仿洗涤三次至数滴清亮透明油状提取物，最 后将瓶内酯类转移至甲酯化管。N2吹干具塞试管中的有机试剂。如不 能及时测定，可以充氮后保存在-20℃环境中待测，二周内测完。

2）甲酯化：

a、甲酯化：加入1 mL甲苯和3 mL硫酸甲醇溶液，拧紧盖子，在70  ℃水浴条件下，甲酯化2个小时，每隔30 min进行震荡摇匀，加速甲 酯化。

b、甲酯物的提取：甲酯化完后，加入2 ml正己烷，再加入生理盐水 至瓶口处，拧紧盖子，剧烈震荡1 min，2000 rpm离心10 min。将 上层正己烷相用玻璃吸管小心吸出至一事先放有2 ml蒸馏水的尖头离 心管中，振荡。再将上层转移至事先装有少量Na₂SO₄的尖头离心管中 。将上层移入后，轻轻振荡，若发现其中的Na₂SO₄可以跳动，证明没 有水分吸过来。再将上层石油醚相转移至一具塞试管中。

c、甲酯物的纯化：用正己烷快速过SPE固相萃取小柱，再将样品快速 过柱。用正己烷清洗具塞试管两次，都快速过柱。用5 %乙醚缓慢清 洗聚酰胺柱，液体成滴收集到具塞试管。先用氯仿：甲醇为2:1的溶液 2 ml，再用2ml正己烷慢速清洗柱子。在38 ℃水浴下N2吹干。

3）气相(GC)色谱分析

用100μL正己烷重新融解样品至样品瓶中，进样2μL由岛津气相色谱 仪（GC－2010型）测定样品的脂肪酸成分。气相色谱的分析条件为： 调节空气到50，调节氢气到75。调节Col（柱温）到160 ℃，调节De t（监测器温度）到260℃，调节Aux（进样口温度）到270 ℃。柱温 升温程序:160℃ (0 min)；20℃ /min、180 ℃ (10 min)；20  ℃ /min、220℃ (5 min)；20 ℃ /min、230 ℃ (16.5 mi n)。

脂肪酸的成分分析方法为：采用GC－2014型气相色谱仪测定脂肪酸， 用杭州英谱科技开发有限公司HS色谱数据工作站V4.0采集谱图，并处 理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用混合的脂肪酸甲酯标样(Nu-Ch ek-Prep Inc, USA)来进行鉴定。定量方式采用面积法，定量方法为 归一法。

统计分析方法采用SPSS16.0进行分析。概论值差异（p<0.05）认为统 计学上有差异。

结果如下表1

表1

*表示有显著性差异（p<0.05）

根据表1所得的数据，我们能得出以下结论：摄入1%的石榴酸，可以显 著提高肝脏、肾脏、心脏和脾脏中的DHA的含量。

实验2

采用4周龄的SD大鼠，适应2周后，随机分为3组，每组10只。接下来4 周，3组大鼠每天分别灌以含石榴酸的橄榄油（石榴酸的质量浓度为1 0%）、橄榄油以及水（作为对照组），灌胃剂量为0.5 mL/100g。SD 大鼠采用聚碳酸酯塑料笼饲养，饲养环境保持恒温（22±1^oC），12- h光照和黑暗交替，所有的动物自由饮食。实验结束后（即，灌胃4周 后），处死SD大鼠，迅速解离腹壁后脂肪、肝脏，用生理盐水冲洗， 待测。

腹壁后脂肪、肝脏切片用10%缓冲的中性福尔马林固定，然后石蜡包埋 ，然后切成6 μm薄片，染色后，进行组织学观察。与对照组相比， 橄榄油组和石榴酸组并无显著异常；如图1所示。

对SD大鼠内脏等样品进行总脂肪提取后，对总脂肪进行甲酯化，采用 GC分析SD大鼠 内脏的脂肪酸组成情况，以及石榴酸在体内的代谢情况。统计分析方 法采用SPSS16.0进行分析。概论值差异（p<0.05）认为统计学上有差 异。具体如表2所示。

表2

肝脏脂肪酸（%） 对照组 橄榄油组 石榴酸组 DHA 9.44±0.49 9.01±0.85 13.00±1.58 *

*表示有显著性差异（p<0.05）

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例 。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普 通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均 应认为是本发明的保护范围。