用于鉴定小麦千粒重的引物对以及相关分子标记

摘要

本发明公开了一种用于鉴定小麦千粒重的引物对以及相关分子标记。本发明提供的特异引物对，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表的序列4所示的单链DNA片段组成。本发明公开了普通小麦TaGS基因的等位变异序列TaGS-D1a和TaGS-D1b，并提供了鉴定TaGS-D1a和TaGS-D1b等位变异的功能标记及其与小麦千粒重的相关关系。将本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速筛选出具有较高千粒重的小麦品种（材料），从而加速高产小麦新品种的育成步伐。本发明对利用分子标记辅助选择高产小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定小麦千粒重的引物对以及相关分子标记。

背景技术

小麦是我国重要的粮食作物，小麦的高产、稳产是国家粮食安全的重要保障，其 产量的高低直接影响到我国人们生活水平和国家粮食安全。随着人口的增长、耕地减 少和粮食生产成本的不断提高，高产育种将是我国小麦育种的永恒主题。千粒重的高 低与小麦产量直接相关，因此，通过现代分子生物学手段研究控制小麦籽粒大小基因 的遗传基础、克隆粒重相关基因、发掘优异等位变异并开发其功能标记对我国高产育 种具有重要意义。

产量构成要素比较复杂，尤其是穗数和穗粒数，而千粒重的增加则是相对独立的， 并且小麦千粒重也较为稳定，遗传力达59-80%。郑天存认为河南及黄淮南片小麦单产 提高的贡献率依次是千粒重>穗粒数>穗数。所以，千粒重对小麦单产水平的提高起到 了举足轻重的作用。

目前对小麦千粒重已进行了大量的QTL定位研究。Giura等利用小麦单体研究发 现，4A、4B、2B、3A和1B染色体与粒长有关，而1A和1B与小麦粒宽相关。Dholakia 等将与小麦粒长相关的QTL定位于2BL、2DL、5BL、6BS及7BL上。在所定位的QTL 中，2DL上的Xgwm261与小麦粒长、粒宽有关，其对粒长和粒宽的表型贡献率分别为 16.6%和7.7%。Breseghello等通过关联分析研究发现，小麦的2D、5A和5B与粒形和 粒重相关。其中2D染色体上的Xwmc111和Xgwm30与小麦的粒宽有关，而Xwm539与小 麦的粒长相关。5A染色体上的Xwmc150b，Xbarc141与小麦的粒长、籽粒面积及粒重 相关，而与小麦的粒宽相关不显著。Breseghello等发现1A、1B、1D、2B、2D、4B、 5B和6B与小麦籽粒大小及粒形有关，其中位于1B上的Xcdo1196与小麦的粒宽相关， 4B上的Xggat27及5D上的Xcdo346a与小麦的粒长相关。Sun等在2A、5D和6A染色 体上定位了与小麦粒宽相关的QTL，位于6A染色体Xswes123b-Xswes332a附近的标记 受环境影响较小，对小麦粒宽贡献率最高可达20%。1A、1B、2B、4A、4B染色体上存 在与小麦粒长相关的QTL，与其它位点相比4A染色体附近的Xswes24a-Xswes24c遗传 相对稳定，对小麦粒长的贡献率为11.1-14.6%。王瑞霞等利用QTL作图在不同环境条 件下共检测到17个与粒长的相关的QTL，其中位于2A和2D上的两个位点在各环境条 件下均可检测到，分别解释表型变异的10.7%和14.7%。检测到16个影响籽粒宽度的 QTL，分布于1A、1B、2A、2B、3A、3B、5A、5B、5D和6D染色体上，但不同环境中未 检测到影响粒宽的共同QTL。

目前已定位的与小麦粒重及其构成要素相关的QTL已遍布小麦的21条染色体。由 于受作图群体、遗传背景、QTL作图方法、标记类型等因素的影响，使得不同研究者 的结果可比性差。此外，由于大多数QTL对粒重及其构成要素的表型贡献率较小，且 在不同年际及环境间重复性差，所以仍不能满足分子标记辅助选择的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定小麦千粒重的引物对以及相关分子标记。

本发明提供的特异引物对，由序列表的序列3所示的单链DNA片段和序列表的序 列4所示的单链DNA片段组成。

本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5） 或（6）或（7）：

（1）鉴定待测小麦携带等位基因TaGS-D1a还是等位基因TaGS-D1b；所述等位基 因TaGS-D1a如序列表的序列1所示；所述等位基因TaGS-D1b如序列表的序列2所示；

（2）辅助筛选携带所述等位基因TaGS-D1a的小麦品种；

（3）辅助筛选携带所述等位基因TaGS-D1b的小麦品种；

（4）辅助鉴定待测小麦的千粒重；

（5）辅助筛选具有高千粒重性状的小麦品种；

（6）辅助筛选具有低千粒重性状的小麦品种；

（7）辅助比较不同小麦品种的千粒重。

应用所述特异引物对鉴定待测小麦携带等位基因TaGS-D1a还是等位基因 TaGS-D1b的方法如下：以待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩 增，如果PCR扩增产物为562bp待测小麦携带所述等位基因TaGS-D1a，如果PCR扩增 产物为522bp待测小麦品种携带所述等位基因TaGS-D1b。

应用所述特异引物对辅助筛选携带等位基因TaGS-D1a的小麦品种的方法如下：以 待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为 562bp待测小麦为候选的携带所述等位基因TaGS-D1a的小麦品种，如果PCR扩增产物 不为562bp待测小麦为候选的不携带所述等位基因TaGS-D1a的小麦品种。

应用所述特异引物对辅助筛选携带等位基因TaGS-D1b的小麦品种的方法如下：以 待测小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为 522bp待测小麦为候选的携带所述等位基因TaGS-D1b的小麦品种，如果PCR扩增产物 不为522bp待测小麦为候选的不携带所述等位基因TaGS-D1b的小麦品种。

应用所述特异引物对辅助鉴定待测小麦的千粒重的方法如下：以待测小麦的基因 组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为562bp待测小麦 的千粒重疑似为44g以上，如果PCR扩增产物为522bp待测小麦的千粒重疑似为43.5g 以下。

应用所述特异引物对辅助筛选具有高千粒重性状的小麦品种的方法如下：以待测 小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为562bp 待测小麦为候选的具有高千粒重性状的小麦品种，如果PCR扩增产物不为562bp待测 小麦为候选的不具有高千粒重性状的小麦品种。

应用所述特异引物对辅助筛选具有低千粒重性状的小麦品种的方法如下：以待测 小麦的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为522bp 待测小麦为候选的具有低千粒重性状的小麦品种，如果PCR扩增产物不为522bp待测 小麦为候选的不具有低千粒重性状的小麦品种。

应用所述特异引物对辅助比较不同小麦品种的千粒重的方法如下：分别以不同小 麦品种的基因组DNA为模板用所述特异引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物为562bp 的小麦品种的千粒重疑似大于PCR扩增产物为522bp的小麦品种的千粒重。

本发明还保护一种与小麦千粒重相关的分子标记，为以待测小麦的基因组DNA为 模板用所述特异引物对扩增得到的DNA片段。所述分子标记具体可为分子标记甲或分 子标记乙。所述分子标记甲如序列表的序列1自5’末端第870-1431位核苷酸所示。 所述分子标记乙如序列表的序列2自5’末端第870-1391位核苷酸所示。

本发明还保护所述分子标记的应用，为如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；

（b）辅助筛选具有高千粒重性状的小麦品种；

（c）辅助筛选具有低千粒重性状的小麦品种；

（d）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。

应用所述分子标记辅助鉴定待测小麦的千粒重的方法如下：如果所述待测小麦基 因组中具有所述分子标记甲，待测小麦的千粒重疑似为44g以上，如果所述待测小麦 基因组中具有所述分子标记乙，待测小麦的千粒重疑似为43.5g以下。

应用所述分子标记辅助筛选具有高千粒重性状的小麦品种的方法如下：如果所述 待测小麦基因组中具有所述分子标记甲，待测小麦为候选的具有高千粒重性状的小麦 品种，如果所述待测小麦基因组中不具有所述分子标记甲，待测小麦为候选的不具有 高千粒重性状的小麦品种。

应用所述分子标记辅助筛选具有低千粒重性状的小麦品种的方法如下：如果所述 待测小麦基因组中具有所述分子标记乙，待测小麦为候选的具有低千粒重性状的小麦 品种，如果所述待测小麦基因组中不具有所述分子标记乙，待测小麦为候选的不具有 低千粒重性状的小麦品种。

应用所述分子标记辅助比较不同小麦品种的千粒重的方法如下：如果所述待测小 麦基因组中具有所述分子标记甲，将其命名为小麦品种甲；如果所述待测小麦基因组 中具有所述分子标记乙，将其命名为小麦品种乙；小麦品种甲的千粒重疑似大于所述 小麦品种乙的千粒重。

本发明还保护序列表的序列1所示的DNA分子（与小麦千粒重性状相关的等位基 因TaGS-D1a）。

本发明还保护序列表的序列2所示的DNA分子（与小麦千粒重性状相关的等位基 因TaGS-D1b）。

本发明还保护所述等位基因TaGS-D1a和/或所述等位基因TaGS-D1b的应用，为如 下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；（b）辅助筛选具有 高千粒重性状的小麦品种；（c）辅助筛选具有低千粒重性状的小麦品种；（d）辅助比 较不同待测小麦品种的千粒重。

本发明还保护一种检测待测小麦携带等位基因TaGS-D1a还是等位基因TaGS-D1b 的方法，包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR 扩增，如果PCR扩增产物为562bp待测小麦携带所述等位基因TaGS-D1a，如果PCR扩 增产物为522bp待测小麦品种携带所述等位基因TaGS-D1b。

本发明还保护所述方法的应用；为如下（a）或（b）或（c）或（d）：

（a）辅助鉴定待测小麦的千粒重；

（b）辅助筛选具有高千粒重性状的小麦品种；

（c）辅助筛选具有低千粒重性状的小麦品种；

（d）辅助比较不同待测小麦品种的千粒重。

所述应用中，携带所述等位基因TaGS-D1a的待测小麦为候选的具有高千粒重性状 的小麦品种。所述应用中，携带所述等位基因TaGS-D1b的待测小麦为候选的具有低千 粒重性状的小麦品种。所述应用中，携带所述等位基因TaGS-D1a的待测小麦品种的千 粒重大于携带所述等位基因TaGS-D1b的待测小麦品种。

以上任一所述高千粒重性状的含义为千粒重为44g以上。

以上任一所述低千粒重性状的含义为千粒重为43.5g以下。

本发明公开了普通小麦TaGS基因的等位变异序列TaGS-D1a和TaGS-D1b，并提供 了鉴定TaGS-D1a和TaGS-D1b等位变异的功能标记及其与小麦千粒重的相关关系。将 本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速筛选出具有较高千粒重的小麦 品种（材料），从而加速高产小麦新品种的育成步伐。本发明对利用分子标记辅助选择 高产小麦品种具有重要的理论意义和经济价值。

附图说明

图1为TaGS基因的两种等位变异形式的比对谱图。

图2为部分样本的电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可 以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。

实施例1、等位基因的发现及引物对的开发

在对大量小麦品种进行序列分析的基础上，发现小麦TaGS基因，在小麦中TaGS 基因存在的两种等位变异形式，一种如序列表的序列1所示（命名为等位基因 TaGS-D1a），另一种如序列表的序列2所示（命名为TaGS-D1b）。TaGS基因的两种等位 变异形式的比对谱图见图1，起始密码子和终止密码子以方框示出，加下滑线部分为 外显子，阴影部分为序列多态位点，序列缺失部分以短横线代替。

基于TaGS基因的两种等位变异形式设计特异引物对如下：

上游引物（序列表的序列3）：5’-AACTTAGGGAGCGAAAACAA-3’；

下游引物（序列表的序列4）：5’-CACCAAGACTGGAGATGAAA-3’。

实施例2、等位基因和引物对的应用

实验材料为106份中国冬小麦主推品种，具体见表1。

将各个实验材料分别进行如下步骤：

1、提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用实施例1设计的特异引物对进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增的反应体系：模板DNA约100ng，rTaq酶（Takara，code：DX100B）0.2μl， GC bufferⅠ10μl（Takara，code：DRR20GC I），dNTP（Takara，code：D4030RA， 2.5mM each）2μl，上游引物和下游引物各6pmol，用无菌超纯水补充反应体系至20 μl。

PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min、52℃复性1min、72℃ 延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸7min；10℃保温。

3、将PCR扩增产物进行6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（80W恒功率电泳1h），银 染显色。部分样本的电泳图见图2。各个小麦品种均扩增得到了PCR扩增产物，PCR 扩增产物按大小分为两种，一种为562bp，另一种为522bp。结果见表1。

4、将步骤3的PCR扩增产物进行测序。

测序结果表明，562bp的扩增产物均如序列表的序列1自5’末端第870-1431位 核苷酸所示，522bp的PCR扩增产物均如序列表的序列2自5’末端第870-1391位核 苷酸所示。

根据以上结果，可以得出如下结论：以待测小麦的基因组DNA为模板，用实施例 1设计的特异引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物为562bp待测小麦携带等位基 因TaGS-D1a，如果PCR扩增产物为522bp待测小麦品种携带等位基因TaGS-D1b。

5、在河南安阳种植各个小麦品种，收获后检测小麦籽粒的千粒重，进行三次重复 实验，结果取平均值。结果见表1。

表1各个小麦品种的PCR检测结果和千粒重检测结果

表1中的各个小麦品种均可从中国农业科学院作物科学研究所的国家种质资源库 获得。

106个中国冬小麦品种中：83个品种携带等位基因TaGS-D1a，千粒重平均值为 47.63g；23个品种携带等位基因TaGS-D1b，千粒重平均值为40.84g；携带等位基因 TaGS-D1a的小麦品种的千粒重高于携带等位基因TaGS-D1b的小麦品种的千粒重，两 者具有显著差异（P<0.05）。采用千粒重≥44g作为高千粒重标准，83个携带等位基 因TaGS-D1a的小麦品种中，73个为高千粒重品种，即通过是否携带等位基因TaGS-D1a 辅助鉴定高千粒重小麦的准确率为88%。采用千粒重≤43.5g作为低千粒重标准，23 个携带等位基因TaGS-D1b的小麦品种中，18个为低千粒重品种，即通过是否携带等 位基因TaGS-D1b辅助鉴定低千粒重小麦的准确率为78%。