大豆细菌性斑点病菌harpinZPsgA1蛋白的表达和应用

摘要

本发明公开了一种大豆细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv.glycinea）A1菌株hrpZPsgA1基因。该基因可调节植物生长发育并使植物获得广谱抗病性。本发明采用GST融合表达harpinZPsgA1蛋白，可以显著提高其在大肠杆菌中的表达量。所述蛋白可以促进作物生长，有效防治由烟草花叶病毒引起的植物病害。

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，更具体地说，涉及一种编码植物多功能活性和广谱抗性细菌信号因子hrpZ_PsgA1基因的克隆及其高效表达产物的纯化，以及该纯化蛋白harpinZ_PsgA1促进植物生长及抗病方面的应用。 

背景技术

大豆是一种其种子含有丰富的蛋白质的豆科植物，其种子呈椭圆形、球形，颜色有黄色、淡绿色、黑色等，故又有黄豆、青豆、黑豆之称，是豆科植物中最富有营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源，在今天世界上许多地方是人和动物的主要食物。大豆具有多种用途，最常用来做各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质，而豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜饲料，是最重要的经济作物之一。 

高等植物过敏性反应（hypersensitive response；HR）是植物受到病原细菌侵染，发生非亲和性反应时，在病原菌入侵点周围植物组织局部快速死亡形成枯斑，是植物对病原菌抗性的一种普遍表现形式。hrp基因（hypersensitive reaction and pathogencity gene）是一类决定病原菌对寄主植物致病性和诱导非寄主植物产生过敏性反应的基因。hrp基因是由多个hrp位点组成的基因簇，具有复杂的结构，并具有至少四方面的功能：基因调控、蛋白质泌出和编码HR反应激发子，以及参与细菌纤毛（pilus）的合成。在hrp基因所编码的HR反应激发子中，harpin是一类非特异性蛋白质激发子，该蛋白质富含甘氨酸，不含半胱氨酸，对热稳定，对蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反 应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制，是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋白。Wei（1992）首次从梨火疫（E.amylovora）中分离得到一种能引起过敏反应的蛋白激发子HrpN，随后在丁香假单胞菌和青枯假单胞菌中也分离到了相应的harpin类蛋白。 

以往研究表明，harpin可以通过启动多种信号途径来诱导植物获得抗性，harpin蛋白可以通过启动至少三条信号通路即：水杨酸（SA）信号通路、茉莉酸（JA）/乙烯（ET）信号通路和脱落酸（ABA）信号通路来诱导植物获得多种有益表型，如促进生物生长，使植物增强对病原菌和害虫的抗性，作为新型微生物蛋白农药的代表具有广泛的应用前景。 

大豆细菌性斑点病是我国，尤其是北方，大豆产区的一种主要病害，给我国的大豆生产带来巨大损失。大豆细菌性斑点病主要危害大豆的幼苗、叶片、叶柄、茎及豆荚。幼苗染病子叶生半圆形或近圆形褐色斑。叶片染病初生褪绿不规则形小斑点，水渍状，扩大后呈多角形或不规则形，大小约3～4mm，病斑中间深褐色至黑褐色，外围具一圈窄的褪绿晕环，病斑融合后成枯死斑块。茎部染病初呈暗褐色水渍状长条形，扩展后为不规则状，稍凹陷。荚和豆粒染病生暗褐色条斑。大豆细菌性斑点病的致病菌为丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.glycinea），其也是世界范围内重要的植物病原细菌。 

因此，有获取可有效提高植株对丁香假单胞菌大豆致病变种的抗性，促进植株生长的harpin类蛋白及其相关的生物制品的需要。 

发明内容

本发明的目的为提供大豆细菌性斑点病菌的harpin类蛋白，表达所述蛋白的重组载体及其构建的工程菌。 

本发明是通过如下技术手段实现的： 

在本发明的第一方面，提供了一种编码具有harpin蛋白功能的氨基酸序列的核苷酸序列hrpZ_PsgA1，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。 

在本发明的第二方面，提供了一种载体，其特征在于，所述载体含有第一方面所述的核苷酸序列，优选地，所述载体为pET41a(+)-hrpZ_PsgA1重组载体。 

在本发明的第三方面，提供了第二方面所述的pET41a(+)-hrpZ_PsgA1重组载体的构建方法，其由以下方法构建： 

（1）将大豆细菌性斑点病菌A1菌株在28℃条件下于KB固体培养基上培养，之后提取A1菌株基因组DNA，用5'端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点的引物对hrpZ_PsgA1-P1和hrpZ_PsgA1-P2以A1菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增： 

hrpZ_PsgA1-P1：5'-GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC BamH1（SEQ ID NO：3）， 

hrpZ_PsgA1-P2：5'-GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG EcoR1（SEQ ID NO：4）； 

反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，循环35次，72℃延伸10min，将PCR产物与pMD18-T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-hrpZ_PsgA1并将其转化到大肠杆菌DH5α中； 

（2）以重组质粒pMD18-T-hrpZ_PsgA1为模板，PCR扩增，扩增产物回收后经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET41a(+)上，使得hrpZ_PsgA1基因与pET41a(+)上的还原型谷胱甘肽GST标签融合，进而得到重组质粒pET41a(+)-hrpZ_PsgA1。 

在本发明的第四方面，提供了含有第二方面所述载体的重组细胞，优选地，所述重组细胞为重组大肠杆菌BL21/pET41a(+)-hrpZ_PsgA1。 

在本发明的第五方面，提供了第四方面中所述的重组大肠杆菌BL21/pET41a(+)-hrpZ_PsgA1的构建方法，其包括将重组质粒ET41a(+)-hrpZ_PsgA1转化至大肠杆菌BL21中，获得重组大肠杆菌BL21/pET41a(+)-hrpZ_PsgA1。 

在本发明的第六方面，提供了第一方面所述的核苷酸序列所编码的蛋白harpinZ_PsgA1，其序列为SEQ ID NO：2。 

在本发明的第七方面，提供了包含第四方面所述的重组细胞或第六方面所述的蛋白的生物制品。 

在本发明的第八方面，提供了第七方面所述的生物制品在植物病害防治中的应用，优选地，所述植物病害为烟草花叶病毒引起的植物病害。 

本发明中使用的缩略语： 

LB：细菌培养基，酵母粉5g/L+胰蛋白胨10g/L+NaCl10g/L，PH7.0；KB：假单胞菌培养基，胰蛋白胨10g/L+甘油10g/L+K₂HPO₄1.5g/L+MgSO₄·7H₂O1.5g/L；Km50：50μg/ml的卡那霉素；IPTG：异丙基硫代-β-半乳糖苷；PMSF：蛋白酶抑制剂苯甲基黄酰氟。 

有益效果 

1.本发明公开了一种大豆细菌性斑点病A1菌株的hrpZ_PsgA1基因序列及其 所编码的蛋白质，采用基因工程方法利用GST融合表达harpin蛋白，显著提高其在大肠杆菌中的表达量。并通过GSTrap FF对目的蛋白进行纯化，纯蛋白浓度约为1mg/ml。 

2.本发明所获得harpinZ_PsgA1富含甘氨酸，不含半胱氨酸，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应。 

3.本发明所获得harpinZ_PsgA1处理烟草，可以促进烟草的生长，显著提高烟草对烟草花叶病毒病的抗性，以上结论证明harpinZ_PsgA1具有开发成生物源农药的应用价值。 

附图说明

图1.重组质粒pET41a(+)-hrpZ_PsgA1PCR及酶切验证：A重组质粒pET41a(+)-hrpZ_PsgA1的PCR扩增，其中M1为DNA markerλ-HindIII；M2为DNA marker DL2000；1为pET41a(+)-hrpZ_PsgA1；2为pET41a(+)-hrpZPsgS1；B重组质粒pET41a(+)-hrpZ_PsgA1的酶切验证，其中M1为DNA marker DL2000；1为hrpZ_PsgA1；2为hrpZPsgS1；3为清水对照。 

图2.harpinZ_PsgA1的表达及纯化：其中M为蛋白marker；1为harpinZ_PsgA1粗提蛋白；2为纯化的harpinZ_PsgA1蛋白。 

图3.harpinZ_PsgA1的生物活性检测：其中1为BL21；2为BL21/pET41a(+)；3为PBS缓冲液；4为harpinZ_PsgA1。 

图4.harpinZ_PsgA1对烟草种子的促生作用，其中A为不同浓度的harpinZ_PsgA1对烟草种子的促生作用；B为harpinZ_PsgA1处理烟草种子16天后根长差异显著性分析。 

图5.harpinZ_PsgA1诱导烟草抵抗烟草花叶病毒（TMV）侵染。 

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，由技术常识可知，本发明也可通过其它的不脱离本发明技术特征的方案来描述，因此所有在本发明范围内或等同本发明范围内的改变均被本发明包含。 

实施例1.hrpZ_PsgA1基因的克隆 

将大豆细菌性斑点病菌丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.glycinea）A1菌株（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）（保藏地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏日期为2012年10月22日，保藏号为CGMCC No.6700）在28℃条件下于KB固体培养基上培养，待菌株生长到对数期，提取A1菌株基因组DNA，根据GenBank中登录号为L41862的hrpZ序列，设计完整开放阅读框（ORF）引物，在5'端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点； 

hrpZ_PsgA1-P1：5'-GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC； 

hrpZ_PsgA1-P2：5'-GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG。 

以A1菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，循环35次，72℃延伸10min。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR和酶切验证得到阳性转化子。提取重组质粒DNA并测序。序列分析采用DNAStar软件，同源性比对在GenBank（http://www.ncbi.nlm.gov）中通过 Blast程序进行比对。 

实施例2.harpinZ_PsgA1蛋白的表达及纯化 

以测序正确的阳性重组质粒pMD18-T-hrpZ_PsgA1为模板，PCR扩增。扩增产物回收后经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET41a(+)上，使得hrpZ_PsgA1基因与pET41a(+)上的还原型谷胱甘肽GST标签融合，进而得到重组质粒pET41a(+)-hrpZ_PsgA1。将重组质粒和pET41a(+)转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR和酶切鉴定出阳性重组菌株。 

重组菌株BL21/pET41a(+)-hrpZ_PsgA1在LB液体培养基（km50μg/ml）中37℃（200rpm/min）振荡培养过夜，次日按照1%的比例转接到km50的液体LB中，37℃振荡培养约2-3h，至OD600=0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃振荡培养2-3h。取诱导的菌液离心收集菌体，用PBS（磷酸缓冲液）洗三次，重溶于1/20原菌体培养体积的磷酸缓冲液中，向菌体悬浮液中加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶，终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂PMSF，经超声波破碎后离心取上清即为粗提蛋白，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。 

使用GSTrap FF对标签蛋白进行纯化，具体操作参见操作说明书进行，纯蛋白浓度约为1mg/ml。以上获得的纯化harpinZ_PsgA1可以在促进植物生长，诱导植物抗病方面得到应用。 

实施例3：大豆细菌性斑点病菌A1菌株hrpZ_PsgA1基因的克隆与测序 

大豆细菌性斑点病菌A1菌株首先在KB固体培养基上筛选，该菌株能分泌荧光色素，并能在紫外光下检测到荧光。将选取的单克隆菌落，于28℃条件 下在KB液体培养基中震荡培养24h，用于提取基因组DNA。根据Genbank中登录号为L41862的hrpZ序列，设计完整开放阅读框（ORF）引物，在5'端分别引入BamH1和EcoR1酶切位点； 

hrpZ_PsgA1-P1：5'-GGGGATCCATGCAGAGTCTCAGTCTTAAC； 

hrpZ_PsgA1-P2：5'-GGGAATTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTG。 

以A1菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，循环35次，72℃延伸10min。将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR和酶切验证得到阳性转化子。提取重组质粒DNA送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。对重组质粒pMD18-T-hrpZ_PsgA1序列测定结果显示，hrpZ_PsgA1基因大小为1026bp，编码341个氨基酸，其编码的蛋白质富含甘氨酸（13.19%），不含半胱氨酸。 

实施例4：harpinZ_PsgA1蛋白的表达及纯化 

1.hrpZ_PsgA1基因工程表达菌株的构建 

以测序正确的阳性重组质粒pMD18-T-hrpZ_PsgA1为模板，PCR扩增。扩增产物回收后经BamH1和EcoR1双酶切后连接到表达载体pET41a(+)上，使得hrpZ_PsgA1基因与pET41a(+)上的还原型谷胱甘肽GST标签融合，进而得到重组质粒pET41a(+)-hrpZ_PsgA1。将重组质粒和pET41a(+)转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR及酶切鉴定出阳性菌株（图1）。 

2.harpinZ_PsgA1蛋白的表达 

（1）活化原种：重组菌株BL21/pET41a(+)-hrpZ_PsgA1接种于LB液体培养 基（km50μg/ml）中37℃（200rpm/min）振荡培养过夜，次日按照1%的比例转接到km50的液体LB中，37℃振荡培养约2-3h，至OD600=0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃振荡培养2-3h。 

（2）破碎细胞：收集菌液8000rpm/min，4℃离心10min收集菌体，用PBS（磷酸缓冲液）洗三次，重溶于1/20原菌体培养体积的磷酸缓冲液中，向菌体悬浮液中加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶，终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂PMSF。10000rpm/min，4℃离心15min，收集上清，即为harpinZ_PsgA1的粗提蛋白。SDS-PAGE检测融合蛋白大小为62kDa，harpinZ_PsgA1大小为35kDa，GST标签大小为27kDa（图2）。 

3.harpinZ_PsgA1的纯化 

使用GSTrap FF对标签蛋白进行纯化，具体步骤按照说明书显示的方法，纯化之前，用0.45μm滤膜过滤harpinZ_PsgA1粗提蛋白，去除粗提蛋白中一些细胞碎片或其它杂质，以免阻塞纯化柱，纯化时使用蠕动泵上样。纯化的样品经超滤柱超滤、浓缩，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，纯蛋白于-70℃保存。 

4：harpinZ_PsgA1蛋白的生物活性检测 

用无头的注射器向烟草叶背面细胞间隙注射harpinZ_PsgA1粗提液，同时以BL21、BL21/pET41a(+)和清水处理为对照，36h内观察叶片HR发展情况（图3）。 

实施例5：harpinZ_PsgA1蛋白质的应用举例 

1.harpinZ_PsgA1促进烟草的生长 

将纯化的harpinZ_PsgA1稀释后浸泡烟草种子，同时以清水为对照。12h后吸出蛋白液，加入30%的NaClO表面消毒5min，灭菌水清洗三次后倒置于灭菌的滤纸上，待种子吸干水后用灭菌牙签点入含MS培养基的方形培养皿中，置于光照培养箱中，垂直培养，每个处理设置5个重复。20d后观察，测定根长和鲜重，应用SPSS软件对数据进行统计分析。 

经过3次独立生物学重复得出50-200μg/ml的harpinZ_PsgA1对烟草有明显的促生作用（图4A和图4B），100μg/ml的harpinZ_PsgA1与清水对照组存在显著性差异。 

2.harpinZ_PsgA1诱导烟草抗烟草花叶病毒 

使用100μg/ml纯化的harpinZ_PsgA1预先喷雾处理烟草中部叶片，以清水喷雾处理为对照。6h后在处理叶片上摩擦接种烟草花叶病毒。3天后，我们观察病斑的数目及直径。 

结果显示，经harpinZ_PsgA1处理后的烟草叶片，其上形成的病斑数要明显少于清水处理组，病斑抑制率可达60%以上。（图5）。 

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，等效替换以及具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。