大豆蚜Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AgKaSPI对蜡蚧刺束梗孢菌侵染的表达响应

摘要

[目的]探究Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂KaSPI在大豆蚜Aphis glycines的生长发育、消化和免疫防御等过程中的作用.[方法]基于大豆蚜转录组数据PCR克隆大豆蚜Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA序列;qRT-PCR分别检测AgKaSPI在大豆蚜1-4龄若虫和成虫以及蜡蚧刺束梗孢菌Akanthomyces lecanii侵染3,6,12,24,48和72 h时大豆蚜成虫中的表达水平;siRNA干扰AgKaSPI 3,6,12,24和48 h后qRT-PCR检测RNAi干扰效率,并记录RNAi后12,24,48和96 h时大豆蚜成虫死亡数和产蚜量;双抗体夹心法检测蜡蚧刺束梗孢菌侵染和RNAi干扰AgKaSPI后大豆蚜成虫体内AgKaSPI蛋白含量以及丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性变化;观察并记录RNAi干扰AgKaSPI后6h蜡蚧刺束梗孢菌侵染大豆蚜成虫12,24,48和96 h时的死亡数.[结果]在大豆蚜体内克隆得到了一条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因AgKaSPI的cDNA序列(GenBank登录号:MK440557),序列全长1019 bp,开放阅读框长324 bp,编码107个氨基酸.AgKaSPI具有Kazal结构域,推测分子量和等电点分别为11.43 kD和9.24.基因表达模式研究发现,AgKaSPI在大豆蚜各个龄期均有表达.大豆蚜成虫经蜡蚧刺束梗孢菌侵染24 h时,AgKaSPI基因表达量显著上调,为对照的4.31倍;相应AgKaSPI蛋白含量也显著上调,为对照的1.69倍;而丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性受到抑制.RNAi干扰AgKaSPI6 h时,大豆蚜成虫体内AgKaSPI表达量下降了71.05％;KaSPI蛋白含量在干扰12 h时下降了51.11％,丝氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性显著增强;干扰96 h时每百头大豆蚜产蚜量减少了49头且大豆蚜成虫的死亡率增加了10.12％.[结论]AgKaSPI在大豆蚜各个龄期均有表达,且在蜡蚧刺束梗孢菌侵染24 h后表达量显著上调.AgKaSPI可能通过调节丝氨酸蛋白酶活性参与了大豆蚜对蜡蚧刺束梗孢菌的免疫反应.