脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方法，该方法从羊脑多头蚴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增出HSP基因序列，该基因的开放阅读框为408bp，编码136个氨基酸。将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌BL21（DE3）后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋白作为抗原，建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法(DIGFA）。本发明通过分子生物学的方法，人工合成了一种可以用于脑多头蚴病诊断的重组抗原，并评价了该表达蛋白在脑多头蚴病诊断中的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以热休克（HSP）重组蛋白为抗原，建立动物多头蚴病 免疫金标渗滤检测法。

背景技术

脑多头蚴病（Coenuriasis）又叫脑包虫病，是由带科的多头带绦虫（ Taenia multiceps）的中绦期幼虫——脑多头蚴（Coenurus cereb ralis）寄生于绵羊、山羊、黄牛、牦牛和骆驼等有蹄动物的脑和脊髓 等处引起的一种寄生虫病，该病是我国草食动物的常见疾病，每年给 畜牧业造成巨大的经济损失。

近年来，血清学诊断技术已应用于脑多头蚴病的诊断，但由于所用的 诊断抗原主要是包囊囊液、多头蚴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它 们来源十分有限，不能满足实际的需要。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种以热休克（HSP）重组蛋白为抗原， 建立动物多头蚴病免疫金标渗滤检测法，旨在解决血清学诊断技术已 应用于脑多头蚴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是包囊囊液、 多头蚴原头节和囊壁等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足 实际的需要的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种脑多头蚴热休克蛋白抗原的制备方 法，该方法从羊脑多头蚴原头节提取总RNA，采用RT-PCR技术首次扩增 出HSP基因序列，该基因的开放阅读框 为408bp，编码136个氨基酸。将此基因克隆到pET-32a(+)载体，构建 重组表达质粒pET-32a-HSP，经转化大肠杆菌BL21（DE3）后IPTG诱导 表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物；以纯化后的表达蛋 白作为抗原，建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗滤法(D IGFA）

进一步，培养基和常用溶液的配制方法为：

利用超纯水配制溶液，用0.22μm的过滤器过滤配制好的IPTG溶液；

将超纯水800 mL 混合Yeast Extract5 g，Trypton、10 gNaCl1 0g，调节pH值至7.2，定容至1 000 mL，并于121℃高压蒸汽灭菌20  min，再置于4℃保存；

将琼脂粉加入液体LB培养基，于121℃的高压灭菌锅灭菌20min，最后 将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v)；最后在琼脂糖培养基温度降低后加 入氨苄青霉素并倒板；

利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度100mg/mL，再用0. 22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存备用；

将27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液， 最后加超纯水定容至1 000 mL；

将1g琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入10mL的5×TBE，定容至100m L；

0.8gN,N'一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶于适量超纯水中，定 容至100mL，于4℃避光保存；

将18.17gTris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为8.8，最后 定容至100mL，并于4℃保存；

将12.11g Tris置于超纯水中溶解，利用浓盐酸调节溶液pH为6.8，最 后定容至100mL，并于4℃保存；

将10gSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干粉，最后定 容至100mL；

将1g过硫酸铵溶于水中，定容至10mL；

1.6 mL双蒸水、2 mL30%丙烯酸胺、1.5 mol/L Tris(pH8.8)1.3  mL、0%过硫酸铵0.05 mL、TEMED 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL；

10%SDS0.01 mL、0.68 mL双蒸水、1.0 mo1/L Tris(pH6.8)0.13  mL、30%丙烯酞胺0.17 mL、10%过硫酸铵0.01 mL、TEMED 0.001  mL；

取14.4g甘氨酸、3gTris混合1gSDS溶解于超纯水，最后定容至1000mL ；

缓冲液：将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯基乙醇、2%SDS 混合于60mmol/LTris-HCl；

将45mL甲醇，45mL水，10mL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R-250；

90mL甲醇:水（1:1），10mL冰乙酸；

将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS（电泳级）0.37g，甲醇200mL，加去 超纯水定容至1000mL；

KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·H₂O2.9g、0.2gKCl 、8.8gNaCl、用超纯水 定容至1000mL，并置于高压灭菌锅灭菌后4℃保存备用；

将NaCl8.8g、1MTris-HCl（pH8.0）20mL、加入800mL超纯水充分搅拌 溶解，再加Tween-200.5mL混匀，最后加超纯水定容至1000mL，并用高 压灭菌锅灭菌后于4℃保存备用；

PBS10mL，BSA0.1g，现配先用；

6.0mgDAB，10mL0.01M PBS，1μL H₂O₂；

NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na₂HPO₄.12 H₂O 3.58 g，KH₂PO₄ 0 .27 g加去离子水溶解并定容至1 000mL；

在上述PBS中按0.05%加入Tween-20，混匀；

含5%FBS的0.01 mol/L pH7.4 PBS溶液；

临用前配制0.1 mol/L 柠檬酸（2.1 g/100 mL），0.2 mol/L  Na₂HPO₄. 12H₂O 6.1 mL， ddH₂O 12.5 mL，邻苯二胺 10 mg，溶解后，加入30%H₂O₂ 40 μ L；

终止液采用2 mol/L H₂SO₄ 。

本发明实施例的另一目的在于提供一种利用上述制备方法制备的脑多 头蚴热休克蛋白抗原建立检测羊脑多头蚴病抗体的重组蛋白胶体金渗 滤法，其特征在于，该重组蛋白胶体金渗滤法包括以下步骤：

脑多头蚴总RNA的提取，将保存于液氮的脑包虫原头蚴抽屉总RNA，利 用总RNA抽提试剂盒，并按照其说明书进行总RNA抽提；

脑多头蚴HSP基因的RT-PCR扩增，根据测序完成的多头带绦虫转录组数 据，利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程 有限公司合成。引物序列为：

上游引物：5’-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’

下游引物：5’-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT -3’

对抽提的RNA，将抽提的脑多头蚴原头节总RNA进行反转录，反应体系 同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增；

Tm-HSP基因胶回收、连接、转化，将RT-PCR扩增得到的HSP基因通过胶 回收、连接、转化，将其插入入pMD 18-T载体，并且转化入DH5a大肠 杆菌进行扩大培养，其具体步骤同Tm-FABP；

pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定；pET-32a-HSP重组质粒在大 肠杆菌中的表达与鉴定；

将鉴定正确的pET-32a-HSP重组质粒转入E.coli BL21（DE3）进行表 达，并且通过SDS-PAGE进行验证，通过免疫印记检测其反应源性，具 体操作步骤同FABP的表达与鉴定；

免疫金标渗滤法（DIGFA）的建立；

DIGFA与ELISA比较检测。

进一步，脑多头蚴HSP基因的RT-PCR扩增，根据四川农业大学动物寄生 虫学实验室测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer  5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列 为：

上游引物：5’-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’

下游引物：5’-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT -3’

对抽提的RNA，将抽提的脑多头蚴原头节总RNA进行反转录，反应体系 同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增。扩增参数为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，循环扩 增30次，最后72℃延伸10min。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检查 结果。

进一步，pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定，根据测序结果， 通过软件分析扩增出的Tm-HSP基因刚好为一个开放阅读框，用Primer  Primer 5.0软件重新设计一对引物，并在上、下游引物的5’端设 计了Bamh I和Xho I酶切位点，引物序列为：

上游引物P1：5’-CCGGAATTCATGGGTCTCAAAGAAACAG-3’

下游引物P2：5’-CCGCTCGAGTCAGAATAGAGCCATTAACTC-3’

以pMD-Tm-HSP质粒为模板，用上述引物对基因的阅读框进行PCR扩增。 该PCR扩增的反应参数：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火 30sec，72℃延伸30sec，循环扩增30次，最后72℃延伸10min。PCR产 物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查结果，并回收目的片段。将pET-32a(+) 质粒及上述胶回收的PCR产物分别用Bamh I和Xho I双酶切，酶切产 物用T4连接酶16℃连接过夜，转入E.coli DH5α感受态细胞，提取质 粒作双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送上海英骏生物技术有限公 司测序。

进一步，免疫金标渗滤法的建立，最佳抗原包被浓度的确定，在垂直 流渗滤法检测盒中央NC膜上中央滴加羊IgG0.5μL，为质控点A。周围 四点B、C、D、E点加HSP抗原0.5μL， 浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、 2mg/mL，干燥后用封闭 液封闭4℃保存备用；

金标试验操作流程，将检测装置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30μ L，待完全渗入后加洗脱液1滴，洗去未结合抗体；再加驴抗羊IgG胶体 金标记物1滴，待渗入后加洗脱液两滴，肉眼判定结果；

金标试验结果判定，检测NC膜中央A点显色红色表示检测有效，周围四 个热休克抗原包被点显色为阳性。结果表示为“+”，“++”，“+++ ”，仅留下白色或粉红底色为无效检测；

灵敏性试验：取阳性混合血清倍比稀释，用DIGFA检测；DIGFA检测血 清稀释为1/5,1/10,1/20,1/40,1/80,1/160梯度；

特异性试验：将制备好的诊断膜检测健康羊血清与羊脑多头蚴血清， 细粒棘球蚴血清，细颈囊尾蚴血清以评估其特异性；

重复性和稳定性试验：将制备好的诊断膜保存于4℃冰箱，每隔一周取 出用于脑多头蚴血清的随机检测。

进一步，DIGFA与ELISA比较检测，ELISA与DIGFA检测脑多头蚴患病动 物和健康动物血清34份，其中脑多头蚴阳性血清6份，健康羊血清20份 ，细颈囊尾蚴阳性血清5份，细粒棘球蚴绵羊血清3份；ELISA试验用p H9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原，按每孔100μL包被酶标板，置4℃过夜； 用PH7.6的PBST洗涤酶标板3次，加待检血清100μL /孔，37℃孵育1 h；PBST洗涤三次后加HRP-兔抗羊IgG100μL /孔，37℃孵育1h；洗涤 3次后加TMB底物溶液，100μL /孔。反应10min后用酶标仪于450nm波 长处测定吸光值。

本发明采用的是抗原为经过筛选的HSPs抗原，是原头节发育过程中应 对宿主特异的生理环境而产生的应激性蛋白。通过Ni柱纯化后的HSP具 有很高的特异性，并且由于重组蛋白表达后处于细胞裂解液上清，并 不需要额外的蛋白复性操作，使HSP蛋白比较完整的保持了天然构像， 有利于其保持高度的敏感性。但重组蛋白仅有一种成分，而天然抗原 中含有多 种蛋白成分，故重组抗原敏感性略低于纯化后的天然抗原。本实验中 的胶体金作为标记物具有操作简单，省事，无毒，无致癌性物质，无 需昂贵仪器等特点。故该检测板便于携带，有利于田间检测，更适宜 在交通不便的偏远地区山羊脑多头蚴病诊断中进行推广应用。

附图说明

图1是本发明提供的重组克隆质粒PCR产物电泳图，M：DNA分子质量标 准；1,4：RT-PCR扩增产物；2,3：质粒PCR产物；

图2. 是本发明提供的重组质粒PCR产物电泳图，M：DNA分子质量标准 DL2000,1,23：重组质粒PCR产物；

图3. 是本发明提供的重组质粒PCR产物电泳及酶切，M：DNA分子质量 标准DL4500；1：重组质粒酶切产物；2：重组质粒；3：重组质粒扩增 产物；

图4是本发明提供的图9.Pet32a-Tm-HSP重组表达质粒双酶切鉴定，M： DNA分子质量标准; 1：重组菌PCR产物；2：双酶切产物；

图5.  是本发明提供的重组蛋白表达产物的SDS-PAGE；

图6. 是本发明提供的IPTG浓度对重组质粒pET32a-Tm-HSP表达效果的 影响；

图7.  是本发明提供的表达蛋白在2mmol/L IPTG条件下，诱导不同 时间取样SDS-PAGE电泳检测，M:蛋白质分子质量标准; 1:诱导0h;  2:诱导3h; 3:诱导4h; 4:诱导5h;

图8 是本发明提供的不同诱导温度对重组质粒表达效果的影响；

图9. 是本发明提供的重组表达蛋白免疫印迹；

图10. 是本发明提供的DIGFA检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图 1至10及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描 述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明通过分子生物学的方法，人工合成了一种可以用于脑多头蚴病 诊断的重组抗原，并评价了该表达蛋白在脑多头蚴病诊断中的应用价 值。

1. 材料与方法 

1.1 脑多头蚴样品   脑多头蚴样品取自发病死亡的山羊脑部，采 集的包囊置于配置好的加了双抗的生理盐水中。用灭菌的眼科剪剪破 包囊，让原头蚴破囊而于双抗生理盐水中，观察其活性。反复用双抗 生理盐水洗涤后，将活性好的原头蚴置于液氮中保存备用。

1.2 血清  阳性血清采自四川某种羊场，自然死亡后剖解证实有包 囊存在的患病羊。阴性血清采自从未发生过脑多头蚴病的四川某种羊 场健康羊。

1.3 主要试剂

限制性内切酶（Bamh I、Xho I）、DNA Marker DL2000、T4 DN A Ligase、pMD18-T载体、DNA Marker 10Kb、DNA Marker Ⅲ和 PCR引物等购自大连宝生生物工程有限公司；

总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；

逆转录试剂盒购自Fermentas公司；

dNTP、质粒抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶、普通琼脂糖胶DNA回收试剂 盒、MasterMix PCR扩增试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司 ；

HRP标记兔抗羊IgG购自博士德公司；

96孔酶标板购自costar公司；

胶体金渗滤试验中的驴抗羊IgG胶体金试剂、吸水材料、胶体金耗材套 装等购自上海金 标生物科技公司；硝酸纤维膜购自博士德生物科技公司。

1.4 菌株及质粒载体

大肠杆菌BL21(DE3)、TaKaRa pMD18-T Vector、E.coli DH₅α克隆 菌购自大连宝生物工程有限公司；原核表达载体pET32a(+)购自invit rogen公司。

1.5 主要仪器设备

赛多利斯的电子天平（BP301S）、Eppendof公司的PCR仪、高速冷冻离 心机（Eppendof 5804R）、Eppendof公司的微量加样器；美国Bio-r ad公司的凝胶成像系统、FORMA公司的CO₂细胞培养箱；Bio-rad公司的 酶联免疫检测仪（Mode 1680）；北京六一仪器厂的垂直电泳槽（DY CZ-24D型）、恒压横流电泳仪（DF-C型）、电泳槽（DYY-III型）；三 洋公司购置的-70℃超低温冰箱；购置于宁波新芝生物科技股份有限公 司超声波细胞粉碎仪（JY92-ⅡDN）；购置于苏净集团安泰有限公司的 超净工作台（AIR TECH）。

1.6 培养基和常用溶液的配制

IPTG(24 mg/mL)：利用超纯水配制溶液，用0.22μm的过滤器过滤配 制好的IPTG溶液。

LB培养基：将超纯水800 mL 混合Yeast Extract(OXOID公司)5 g ，  Trypton(OXOID公司)、10 gNaCl10g，调节pH值至7.2，定容至 1 000 mL，并于121℃高压蒸汽灭菌20 min，再置于4℃保存。

LB琼脂平板：将琼脂粉加入液体LB培养基，于121℃的高压灭菌锅灭菌 20min，最后将琼脂粉的浓度调节为1.5%(w/v)。最后在琼脂糖培养基 温度降低后加入氨苄青霉素(100 g/mL)并倒板。

氨苄青霉素(Amp)：利用购买的氨苄青霉素和超纯水配制成工作液浓度 100mg/mL，再用0.22μm滤器过滤除菌，于-20℃保存备用。

电泳缓冲液5×TBE：将27.5 g、硼酸54g Tris，置于20 mL 0.5  mol/L EDTA(pH8.0)溶 液，最后加超纯水定容至1 000 mL。

10g/L琼脂糖凝胶:将1g琼脂糖粉末置于90mL超纯水，再加入10mL的5× TBE，定容至100mL。

30%丙烯酰胺母液：0.8gN,N'一亚甲叉双丙烯酰胺、29.2g丙烯酰胺溶 于适量超纯水中，定容至100mL，于4℃避光保存。

1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）：将18.17gTris置于超纯水中溶解，利 用浓盐酸调节溶液pH为8.8，最后定容至100mL，并于4℃保存。

1mol/L Tris-HCl（pH6.8）：将12.11g Tris置于超纯水中溶解，利 用浓盐酸调节溶液pH为6.8，最后定容至100mL，并于4℃保存。

10% SDS：将10gSDS干粉溶于80mL的灭菌超纯水中，同过加热溶解干 粉，最后定容至100mL。

10%过硫酸铵：将1g过硫酸铵溶于水中，定容至10mL。

12%SDS聚丙烯酰胺(分离胶)5 mL：1.6 mL双蒸水、2 mL30%丙烯酸 胺、1.5 mol/L Tris(pH8.8)1.3 mL、0%过硫酸铵0.05 mL、TEME D 0.002 mL、10%SDS 0.05 mL。

5% SDS聚丙烯酰胺(浓缩胶)1 mL：10%SDS0.01 mL、0.68 mL双蒸 水、1.0 mo1/L Tris(pH6.8)0.13 mL、30%丙烯酞胺0.17 mL、10 %过硫酸铵0.01 mL、TEMED 0.001 mL。

Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：取14.4g甘氨酸、3gTris混合1gS DS溶解于超纯水，最后定容至1000mL。

5×SDS凝胶加样缓冲液：将0.1%溴酚蓝、25%甘油、14.4mmol/L 2-巯 基乙醇、2%SDS混合于60mmol/LTris-HCl(pH6.8)

考马斯亮蓝染色液：将45mL甲醇，45mL水，10mL冰乙酸，0.25g考马斯 亮蓝R-250。

SDS-PAGE脱色液：90mL甲醇:水（1:1），10mL冰乙酸。

转膜缓冲液：将Tris碱5.8g，甘氨酸2.9g，SDS（电泳级）0.37g，甲 醇200mL，加去超纯水定容至1000mL。

0.01mol/L PBS：KH₂PO₄0.24g、Na₂HPO₄·H₂O2.9g、0.2gKCl、8.8g NaCl、用超纯水定容至1000mL，并置于高压灭菌锅灭菌后4℃保存备用 。

TBST（清洗液）：将NaCl8.8g、1MTris-HCl（pH8.0）20mL、加入800 mL超纯水充分搅拌溶解，再加Tween-200.5mL混匀，最后加超纯水定容 至1000mL，并用高压灭菌锅灭菌后于4℃保存备用。

1%BSA包被液： PBS10mL，BSA0.1g，现配先用。

显色液：6.0mgDAB，10mL0.01M PBS，1μL H₂O₂。

0.01 mol/L pH7.4 PBS(抗原稀释液)：NaCl 8 g，KCl 0.2 g ，Na₂HPO₄.12 H₂O 3.58 g，KH₂PO₄ 0.27 g加去离子水溶解并定 容至1 000mL。

0.01 mol/L pH7.4 PBST（洗涤液）：在上述PBS中按0.05%加入Tw een-20，混匀。

封闭液：含5%FBS的0.01 mol/L pH7.4 PBS溶液。

邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制0.1 mol/L 柠檬酸（2.1 g/1 00 mL），0.2 mol/L Na₂HPO₄. 12H₂O（7.163 g/100mL） 6.1  mL，ddH₂O 12.5 mL，邻苯二胺 10 mg，溶解后，加入30%H₂O₂ 40 μL。

终止液 (2 mol/L H₂SO₄) 。

1.7 主要生物信息学数据库和计算机软件

BLASTx（http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST）BLAST检测；

NCBI（GenBank）数据库:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn；

2 试验方法

2.1  脑多头蚴总RNA的提取  将保存于液氮的脑包虫原头蚴抽提 总RNA，利用上海舜华生物 科技公司的总RNA抽提试剂盒，并按照其说明书进行总RNA抽提。其中 其具体步骤为：

（1）预先配置RD溶液，将TCL和Phenol等体积于灭菌空瓶中混合置于 4℃保存。

（2）于液氮中取出保存的原头蚴，并用0.01%的DEPC水反复冲洗，置 于0.01%的DEPC水处理过后的研钵中，加入1mLRD后进行充分研磨。研 磨结束后将匀浆吸至1.5mL无RNase的离心管中，最后用注射器抽打10 次裂解物。

（3）高速震荡裂解物2min，再于室温静置5min后，通过颠倒离心管的 方式充分混匀，再静置2～5min，接着利用高速离心机12000r/min离心 5min，去除沉淀后，将水相移至1.5mL离心管中。

（4）接着加入相当于提取水相一半体积的W3，颠倒混匀两种溶液，接 着移入平衡好的吸附柱，利用高速离心机9000r/min离心30sec，再将 吸附柱装入刚才的收集管中。

（5）接着在收集管中加入500μLRP液，利用高速离心机9000r/min离 心30sec后，再将吸附柱移入下一个干净的收集管中。

（6）在新的收集管中加入500μLW3液，并于室温下静置1min，接着通 过高速离心机9000r/min离心15sec，倒掉收集管中离心废液，再将吸 附柱装入同一个收集管。

（7）接着往收集管中加入500μLW3液，通过高速离心机9000r/min离 心15sec，倒掉收集管中的废液，最后将吸附柱装入同一个收集管中。

（8）高速离心机离心1min。

（9）将离心后的吸附柱放入另外一个无菌的1.5mL离心管中，接着在 吸附柱吸附膜中央加入50μL纯水，静置1min，再高速离心1min，即为 得到总RNA，再将总RNA放入液氮。

2.2脑多头蚴HSP基因的RT-PCR扩增  根据四川农业大学动物寄生虫 学实验室测序完成的多头带绦虫转录组数据，利用Primer Primer  5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为 ：

上游引物：5’-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’

下游引物：5’-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT -3’

对抽提的RNA，将抽提的脑多头蚴原头节总RNA进行反转录，反应体系 同FABP扩增。合成cDNA，加入引物，进行RT-PCR扩增。扩增参数为： 94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s，循环扩 增30次，最后72℃延伸10min。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检查 结果。

2.3 Tm-HSP基因胶回收、连接、转化

将RT-PCR扩增得到的HSP基因通过胶回收、连接、转化，将其插入入p MD 18-T载体，并且转化入DH5a大肠杆菌进行扩大培养，其具体步骤 同Tm-FABP。

2.4 pET-32a -Tm-HSP重组质粒的构建及鉴定

根据测序结果，通过软件分析扩增出的Tm-HSP基因刚好为一个开放阅 读框，用Primer Primer 5.0软件重新设计一对引物，并在上、下游 引物的5’端设计了Bamh I和Xho I酶切位点。

以pMD-Tm-HSP质粒为模板，用上述引物对基因的阅读框进行PCR扩增。 该PCR扩增的反应参数：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火 30sec，72℃延伸30sec，循环扩增30次，最后72℃延伸10min。PCR产 物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查结果，并回收目的片段。将pET-32a(+) 质粒及上述胶回收的PCR产物分别用Bamh I和Xho I双酶切，酶切产 物用T4连接酶16℃连接过夜，转入E.coli DH5α感受态细胞。提取质 粒作双酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒送上海英骏生物技术有限公 司测序。

2.5  pET-32a-HSP重组质粒在大肠杆菌中的表达与鉴定

将鉴定正确的pET-32a-HSP重组质粒转入E.coli BL21（DE3）进行表 达，并且通过SDS-PAGE进行验证，通过免疫印记检测其反应源性，具 体操作步骤同FABP的表达与鉴定。

2.6 免疫金标渗滤法（DIGFA）的建立

最佳抗原包被浓度的确定  在垂直流渗滤法检测盒中央NC膜上中央 滴加羊IgG0.5μL，为质控点A。周围四点B、C、D、E点加HSP抗原0.5 μL，浓度分别为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL，干燥后用封 闭液（ph7.4，0.01molPBS，1%BSA，0.05%Tween-20）封闭4℃保存备 用。

金标试验操作流程  将检测装置置平板上，在NC膜上滴上羊血清30 μL，待完全渗入后加洗脱液（ph7.4，0.01molPBS，0.05%Tween-20） 1滴，洗去未结合抗体；再加驴抗羊IgG胶体金标记物1滴，待渗入后加 洗脱液两滴，肉眼判定结果。

金标试验结果判定  检测NC膜中央A点显色红色表示检测有效，周围 四个热休克抗原包被点显色为阳性。结果表示为“+”，“++”，“+ ++”，仅留下白色或粉红底色为无效检测。

灵敏性试验：取阳性混合血清倍比稀释，用DIGFA检测。DIGFA检测血 清稀释为1/5,1/10,1/20,1/40,1/80,1/160梯度。

特异性试验：将制备好的诊断膜检测健康羊血清与羊脑多头蚴血清， 细粒棘球蚴血清，细颈囊尾蚴血清以评估其特异性。

重复性和稳定性试验：将制备好的诊断膜保存于4℃冰箱，每隔一周取 出用于脑多头蚴血清的随机检测。

2.7 DIGFA与ELISA比较检测

ELISA与DIGFA检测脑多头蚴患病动物和健康动物血清34份，其中脑多 头蚴阳性血清6份，健康羊血清20份，细颈囊尾蚴阳性血清5份，细粒 棘球蚴绵羊血清3份。ELISA试验用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原（20μ g/ml），按每孔100μL包被酶标板，置4℃过夜。用PH7.6的PBST洗涤 酶标板3次，加待检血清（1:200稀释）100μL /孔，37℃孵育1h。P BST洗涤三次后加HRP-兔抗羊IgG（1:1000稀释）100μL /孔，37℃孵 育1h。洗涤3次后加TMB底 物溶液，100μL /孔。反应10min后用酶标仪于450nm波长处测定吸光 值。

3.试验结果 

3.1多带绦虫原头蚴Tm-HSP基因的克隆

3.1.1原头蚴Tm-HSP基因的PCR扩增

通过1.22步骤中的引物设计等过程进行的脑包虫多头蚴Tm-FABP基因的 RT-PCR扩增，经过1%的琼脂糖凝胶电泳，观测结果显示：其扩增出来 的目标条带大小约400bp（图1），与预期的片段大小相符。

3.1.2 重组克隆质粒的PCR鉴定

将抽提的重组质粒通过PCR鉴定，其通过1%的琼脂糖凝胶电泳显示于4 00bp左右出现了电泳条带，与预期的目标条带大小一致。

3.1.3 重组克隆质粒的序列鉴定

经过PCR鉴定而出现特异大小条带的阳性重组质粒被送往上海英骏生物 技术有限公司测序。

3.1.4 重组克隆质粒的序列分析

利用分析软件DNAMAN和DNASTAR对测序结果进行分析，本次扩增序列全 长408bp，其ORF框为405bp，编码氨基酸135个。将该序列登陆到GenB ank上，登录号为GU205474。通过将该序列与到GenBank已知的登陆序 列比较，可知该序列细粒棘球蚴HSP部分序列（DQ678104.1，AF45008 7.1）的同源性为97%。

3.2 Tm-HSP基因的亚克隆

3.2.1 加酶切位点引物的PCR扩增

根据测序结果，通过软件分析HSP基因的开放阅读框，用Primer Pri mer 5.0软件重新 设计一对引物，并在上、下游引物的5’端设计了BamH I和Xho I酶 切位点，通过PCR扩增出约400bp大小的片段。 

3.2.2 重组质粒的PCR与酶切鉴定

通过设计的酶切位点引物对重组的pMD18-T-HSP质粒进行PCR扩增，获 得了与预期大小相符合的片段，初步说明该基因已经成功插入了载体 。         

3.3 Tm-FABP基因重组表达质粒的构建与鉴定

3.3.1重组表达质粒的双酶切鉴定

将上一步骤中酶切亚克隆质粒而产生的Tm-HSP片段通过胶回收后与原 核表达载体pET-32a(+)连接，构建pET32a(+)-Tm-HSP重组表达质粒， 转化入表达菌BL21，通过单个菌落PCR鉴定和扩大培养。将培养菌液离 心后抽取质粒进行双酶切，将酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，隐约 看到约400bp的目标片段(图5) 

3.4重组表达质粒的诱导表达 

将构建好的pET32a(+)-Tm-HSP转入E.coli BL21(DE3)后，利用IPTG进 行诱导，一定时间后利用SDS-PAGE电泳表达菌菌液获得约34KDa大小的 蛋白，表明多头蚴脂肪酸结合蛋白已经在原核表达系统中表达成功  (图6)。 

3.5重组质粒表达条件的优化

3.5.1 IPTG浓度的优化

将含有pET32a(+)-Tm-HSP质粒的BL21表达菌在IPTG浓度为0.2 mmol/ L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0  mmol/L的条件下分别进行诱导3小时。通过浓度比较得知2 mmol/L的 IPTG浓度为最佳的诱导条件，可以选为诱导表达的工作浓度。

3.5.2诱导时间的优化

将含有pET32a(+)-Tm-HSP质粒的BL21表达菌在2mmol/L条件下经过3  h、4 h、5 h、6h不同诱导时间进行诱导表达，结果显示在5h时间表 达量最佳(图7) 。

3.5.3诱导温度的优化

将含有pET32a(+)-Tm-HSP转入BL21表达菌在选取25 ℃、30 ℃和37  ℃温度，0.4 mmol/LIPTG条件下经过5h的诱导。经过SDS-PAGE电泳 显示结果37 ℃的诱导表达量最大。(图8) 。

3.6重组蛋白的纯化

将菌液通过Ni柱纯化后，按照不同的洗脱峰收集过柱液，最后经过SD S-PAGE进行电泳，寻找最纯的洗脱峰。

3.7 融合蛋白表达产物Western-Blotting检测

经过Ni柱纯化后的蛋白在经过PAGE电泳后，按照1.2.10步骤进行免疫 印记检测。结果显示，通过融合表达的Tm-HSP能够与山羊脑多头蚴患 羊血清发生反应，该蛋白具有反应源性。见图9.

3.8 免疫胶体金渗滤结果（DIGFA）

本方法对阳性患病动物检出率为83.3%（5/6），有5%(1/20)的假阳性 出现，其特异性较差，与细颈囊尾蚴阳性血清有40%（2/5）的交叉反 应，与细粒棘球蚴血清有66.7%（2/3）的交叉反应。重组Tm-HSP蛋白 的最佳包被浓度根据DIGFA检测患病家畜血清的显色结果如图10，判定 当抗原浓度为2mg/mL为最佳显色浓度“+++”，0.5mg/mL、1mg/mL、1 .5mg/mL也有显色反应（图10）。

3.9  DIGFA与ELISA比较检测

ELISA与DIGFA检测患病动物血清结果比较 两法均为阳性的有5份，两 法均为阴性19份，符合率为92.3%（24/26），如表1所示。

表1 DIGFA与ELISA检测结果比较

Table1 Comparison of results of by DIGFA and ELISA

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。

基 因 序 列 表

利用Primer Primer 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物工程有限 公司合成；引物序列为：

上游引物：5’-CGCGGATCCATGGTGAACGATGCAGAGAAGT-3’

下游引物：5’-CCGGTCTCCACCTCCTCAATGGT -3’

用Primer Primer 5.0软件重新设计一对引物，并在上、下游引物的 5’端设计了Bamh I和Xho I酶切位点，引物序列为：

上游引物P1：5’-CCGGAATTCATGGGTCTCAAAGAAACAG-3’

下游引物P2：5’-CCGCTCGAGTCAGAATAGAGCCATTAACTC-3’

408bp序列，测序结果如下: