用于生成具有单链悬突的双链核酸的方法

摘要

本发明提供双链扩增产物的构造与一个或两个单链悬突结合的方法，该方法提高了上述靶扩增产物的生产。单链悬突能被用于后扩增捕获和随后的检测/操作。单链悬突能够在没有来自双链靶扩增产物中互补链的干扰的情况下捕获/检测/操作。

说明书

背景技术

在分子生物学及相关领域，通常希望制备诸如可与寡核苷酸（例如捕获探 针）相互作用的PCR产物的双链核酸。这可通过例如升高温度或提高pH直 到双链核酸变性而使核酸的两条链被分开来完成。变性后，可添加捕获探针并 逆转条件从而使捕获探针的退火能够发生。然而，如果两条链依然存在于样品 中，它们可能复性，显然会与捕获探针进行竞争。这当然就降低了捕获过程的 效率。

一种解决方案是在用捕获探针捕获链中的一条前物理分开核酸的两条链。 然而，这需要额外的操作，这样花费时间并且还可能导致材料的损耗。

因此，在PCR中将会有利的是，阻止DNA聚合酶一直复制到模板的3′ 末端，从而留下单链5′悬突（如US5525494（Zeneca Limited，1996年6月11 日）中的记载）。

阻断DNA聚合酶从而形成单链悬突的常见方式是在PCR引物与无意义寡 核苷酸序列之间插入碳接头，但这种方式对本发明获得的PCR效率和随后的 捕获没有好处。与本发明相比，其缺点在于由于碳接头的非刚性结构，无意义 寡核苷酸序列有翻回到靶核苷酸序列上的潜力-从而干扰PCR聚合酶。碳接头 还可以卷起来，从而使无意义寡核苷酸序列和引物序列紧密靠近，使PCR聚 合酶可通读接头。接头的上述干扰随后降低多重PCR试验的批间（inter-assay） 均匀性，而由于所使用的聚合酶阻断剂（blocker）的刚性结构，本发明中没有 见到上述干扰。

WO9421820描述了一种PCR方法，该方法使用具有不可复制的区域的引 物来生成具有单链悬突（尾）的PCR产物。发明者在PCR引物中使用两种非 碱基类似物（1,3-丙二醇和1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇）来阻止聚合酶复制用作 引物的寡核苷酸的所有核苷碱基，从而留下与位于非碱基类似物的5’侧的核苷 碱基对应的单链悬突。

然而，WO9421820和US5525494没有公开在特异性和灵敏度方面对PCR 反应有利或便于随后捕获PCR产物的聚合酶阻断剂。

发明概述

本发明提供双链靶扩增产物的构造与一个或两个单链悬突结合的方法，该 方法提高了上述靶扩增产物的生产。单链悬突能被用于后扩增捕获和随后的检 测/操作。单链悬突能够在没有来自双链靶扩增产物中互补链的干扰的情况下 改善捕获/检测/操作。

附图简述

图1：

变性的PCR产物或BFO修饰的PCR产物的检测结果作为PCR产物的数 量的函数。对于两个检测体系，显示了通过DNA捕获寡核苷酸和对-TINA修 饰的DNA捕获寡核苷酸进行的检测。更多信息，参见实施例1。

图2：

用在本发明中的示例性双官能寡核苷酸的示意图。

图3：

采用1（上图）和2双官能寡核苷酸的引物组的多重PCR的示意图。

图4A显示了50nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。详情参见实施例2。

图4B显示了100nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。详情参见实施例2。.

图5A显示了200nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。详情参见实施例2。

图5B显示了400nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。详情参见实施例2。

图形6显示了邻-TINA和C3间隔基修饰的双官能寡核苷酸的Luminex捕 获分析的结果。详情参见实施例2。

发明内容

本发明提供一种方法，包括如下步骤：

a.提供模板核酸；

b.提供双官能寡核苷酸（bfo），所述双官能寡核苷酸包含其3′末端的引物 /模板（pt）区域（与所述模板核酸的部分互补）和捕获区域（cr），其中所述 pt区域和所述cr区域被聚合酶阻块（B）（polymerase block）隔开；

c.混合步骤a-b的组分并提供使所述bfo的pt区域与所述模板核酸退火的 条件；

d.在可使引物延伸的条件下，延伸所述bfo的pt区域；

e.从而生成具有与所述bfo的cr区域对应的单链悬突（dso）的双链核酸。

在优选的实施方案中，步骤b的bfo理解为：

5′cr-B-pt 3′。

在另一个实施方案中，步骤b的bfo理解为：

X–B–pt 3′

其中“X”可以为“cr”、“B”和“pt”的任何组合。

例如，X=3′pt-B-cr 5′-B-5′cr（在这种情况下，该特定的bfo的式将会是： 3′pt-B-cr 5′-B-5′cr-B-pt 3′）。

优选地，步骤d中的延伸作为选自由如下反应组成的组的反应的一部分完 成：靶指数扩增（例如聚合酶链式反应（PCR）、连接酶链式反应（LCR）、滚 环式扩增）、等温靶指数扩增（例如基于核酸序列的扩增（NASBA）、链置换 扩增（SDA）、转录介导的扩增（TMA））、靶线性扩增（例如反转录、双脱氧 测序）。

在一个实施方案中，所述模板核酸为RNA，因此所述聚合酶为反转录酶。 PCR

当所述方法为PCR时，将认识到所述方法进一步包括如下步骤：

f.提供第二引物，所述第二引物与步骤d的第一延伸产物互补

g.使步骤d的产物变性

h.在使引物延伸的条件下，延伸与所述第一延伸产物退火的所述第二引 物

步骤f-h可称为第二链合成。

在一个实施方案中，所述第二引物也是bfo。因此，第二bfo的pt区域启 动（prime）第二链合成。第二bfo与第一bfo的代表性的不同点在于pt区域 的序列和/或cr区域的序列。应理解的是，核苷酸类似物和修饰的核苷酸的长 度、内容（content）以及聚合酶阻块的特征也可能不同。当第一和第二引物都 是bfo时，所述方法的双链产物（扩增子）在两端都具有单链悬突（捕获区域）。

聚合酶通常是热稳定的，以便可多次重复变性、退火和延伸。否则，将必 须在每个变性步骤后添加聚合酶。正常地，重复2-45次、更优选5-35次、最 优选10-30次。应理解的是，重复的次数通常取决于第一循环中模板核酸的量、 所希望的最终产物量和所述过程的效率。

多重

在上面描述的涉及PCR的实施方案中，使用了两个引物。引物1为bfo， 引物2可以为bfo或者可以为典型的PCR引物。无论哪种方式，所述的两个 引物可称为引物组或引物对，所述引物组或引物对一起使某序列能够扩增而生 成PCR产物（扩增子）。

所述方法可使用多个引物对来代替仅使用一个引物对，从而使PCR反应 为多重PCR。对于引物组2，有一个引物可以为bfo或者两个引物可以都为bfo， 对于另外的引物组，同样如此。

在一个实施方案中，当各引物组中所述引物中只有一个为bfo时，引物组 1的bfo的捕获区域可与引物组2的bfo的捕获区域相同。即两个扩增子可被 具有相同序列/部分的捕获探针捕获。

在一个更优选的实施方案中，所述引物组1的bfo的捕获区域与引物组2 的bfo的捕获区域不同。即两个扩增子可被具有不同序列/部分（即固体表面 上两个分离的区域，例如分离的珠或在阵列上两个分离的位置上）的捕获探针 捕获，对于另外的引物组，同样如此。

在另一个实施方案中，当各引物组中两个引物都是bfo时，用于引物组1 的随后捕获的bfo的捕获区域可与用于引物组2的随后捕获的bfo的捕获区域 相同，即两个扩增子可被具有相同序列/部分的捕获探针捕获。

在一个更优选的实施方案中，用于所述引物组1的随后捕获的bfo的捕获 区域与用于引物组2的随后捕获的bfo的捕获区域不同。即两个扩增子可被具 有不同的序列／部分（即固体表面上的两个分离的区域，例如分离的珠或在阵 列上分离位置上）的捕获探针捕获，对于另外的引物组，同样如此。

在各引物组中的两个引物都为bfo这样的实施方案中，用于引物组1的随 后检测/操作的bfo的捕获区域可与用于引物组2的随后检测/操作的bfo的捕 获区域相同，即两个扩增子可被具有相同序列/部分的探针检测/操作。

在一个更优选实施方案中，用于引物组1的随后检测/操作的bfo的捕获 区域与用于引物组2的随后检测/操作的bfo的捕获区域不同，即两个扩增子 可被具有不同序列/部分的探针检测/操作，对于另外的引物组，同样如此。 供本方法中使用的双官能寡核苷酸（bfo）

引物／模板区域

正常地，所述双官能寡核苷酸的引物/模板区域完全由天然核苷酸组成。 因此，在大多数情况下，它仅仅由DNA单体组成。在某些实施方案中，它还 可以包括DNA和RNA单体的混合物或仅仅由RNA组成。在其他实施方案中， 所述bfo的引物/模板区域可包括一个或多个修饰的单体/核酸类似物/骨架变 体，只要这些形式仍然使pt区域可被聚合酶延伸。因此，在一个实施方案中， 优选的是，从所述pt区域的3′末端开始数最初的2、3、4、6、8或10个核苷 酸为未修饰的DNA单体或未修饰的RNA单体。

所述双官能寡核苷酸的模板/引物区域的长度通常在5-40个核苷酸之间， 更优选长度在8-30个核苷酸之间，最优选长度在10-25个核苷酸之间。

应认识到，所述模板/引物没有必要必须在其整个长度上与模板核酸互补。 例如，它可以在聚合酶阻块和与模板核酸互补的区域之间具有另外的序列。上 述另外的序列例如可包括限制位点。

捕获区域

优选所述捕获区域的长度在5-40个核苷酸之间，更优选其长度在8-30个 核苷酸之间，最优选其长度在10-25个核苷酸之间。

所述捕获区域可以包括两种天然核苷酸（未修饰的DNA单体和未修饰的 RNA单体），它还可以包括修饰的单体和/或核苷酸类似物。例如，可在糖、 和/或核苷酸间连键和/或碱基上修饰所述单体。特别优选的单体为2-O-修饰的 核苷酸（例如2-O-烷基、2-O-Flour）、双环核苷酸（例如LNA（锁核酸）和 BNA）、吗啉基（morpholino）、FANA等。

在一个实施方案中，所述捕获区域可包括PNA（肽核酸）或由PNA（肽 核酸）组成。在另一个实施方案中，所述捕获区域可仅由核苷酸类似物与能够 采用标准寡核苷酸（磷酰胺）化学被掺入的修饰的核苷酸组成。在这个实施方 案中，没有使用PNA。

所述捕获区域通常为选自由适配子和单链捕获序列组成的组的寡核苷酸。 本文使用的术语适配子是指采用三维结构并通过这个结构结合至配体（与通过 杂交结合相对）的寡核苷酸。因此，所述适配子可能已经通过SELEX发展为 结合某种蛋白质。所述适配子还可结合抗体，在这种情况下，所述适配子可称 为抗原决定部位（抗体结合位点）。

在任何这些情况中，所述捕获区域能够与配体例如蛋白质（诸如抗体或能 够与所述捕获区域退火的单链寡核苷酸形式的配体）相互作用。

bfo的其他官能

供本发明的方法中使用的bfo可包括另外的功能。例如，所述bfo可包含 释放基团，诸如可裂解的接头（例如二硫键或光裂解（photocleavable）的部分）。 所述bfo还可包含捕获基团，例如生物素。在一个实施方案中，所述bfo既包 含捕获基团也包含释放基团。所述引物组（或多个引物组）的另一个引物也可 包含其他官能。

聚合酶阻块（B）

至于什么是引物/模板区域、什么是双官能区域的捕获区域，所述引物/模 板区域容易与捕获区域区分，因为当所述bfo在延伸反应中用作模板时（例如 PCR期间），所述引物/模板区域从所述bfo的3′末端延伸至第一核苷酸或不允 许进一步引物延伸的其他部分。因此，所述第一核苷酸或不允许进一步引物延 伸的其他部分为聚合酶阻块，并且所述阻块可以为上面提到的修饰的核苷酸或 核苷酸类似物中的一种。

优选所述聚合酶阻块位于距离所述引物/模板区域的模板区域的3’末端至 少5、6、10、12、15、18、21、24或27个核苷酸的位置上。因此，在相应的 实施方案中，所述引物/模板区域由此至少为5、6、10、12或15、18、21、24 或27个核苷酸长。

所述阻块（B）可以是被掺入核酸的骨架结构中遇到聚合酶时阻止DNA 或RNA聚合酶进一步延伸的任何部分。所述阻块通常选自由核苷酸类似物、 修饰的核苷酸、接头部分（a linking moity）和嵌入剂组成的组。

核酸类似物可以为例如LNA、吗啉、FANA、HNA。

优选的接头部分为聚亚烷基二醇接头，例如聚乙二醇接头（PEG）。还可 使用其他接头。

嵌入剂

在一个实施方案中，优选所述聚合酶阻块包含嵌入剂，即能嵌入DNA或 RNA的碱基之间的部分。嵌入剂通常包括芳环体系。

用在bfo中的所述嵌入剂原则上可通过允许嵌入的接头附着到单体上，或 者可包括所述嵌入剂作为另外单体。

在范围最宽的实施方案中，上述单体可描述为：

X–L-I

其中X为可被嵌入寡核苷酸或寡核苷酸类似物或者PNA或PNA类似物 的骨架中的骨架单体单元；L为接头，I₁为包含至少一个基本为平面的共轭体 系的第一嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆积。

优选地，所述骨架单体单元X包含亚烷基二醇例如乙二醇或1-O-亚甲基 甘油，并任选地包含部分位于一个环系统例如糖基（glycon）中的亚烷基二醇。 例如，所述骨架单体X可为最终含有选自氮、硫、磷和氧的杂原子的4、5或 6元环的一部分。优选地，所述亚烷基二醇直接连接相邻的寡核苷酸单体单元， 应理解在此实施方案中，所述亚烷基二醇仍然可为一个环系统例如糖基的一部 分。

在一个实施方案中，所述单体的接头L包括0到60个原子。

在另一个实施方案中，L包括一条链或一个环或者它们的组合和/或它们 的取代物。

在另一个实施方案中，L包含烷基链或氧杂烷基链或氮杂烷基链或硫杂烷 基链或者酰胺基或硫代酰胺基或磺酰胺基或者它们的组合。.

在一个优选的实施方案中，包含磷原子的骨架单体单元X的单元长度小 于6个原子，其中所述骨架单元长度为从一个单体到下一个单体的最短距离。

优选用作阻块（作为另外的单体添加）的嵌入剂能够选自由如下单体组成 的组：WO/2006/125447（在此通过引用并入）中记载的TINA单体、 WO/2003/052134和WO/2003/052133、WO/2003/051901（在此通过引用并入） 中记载的INA单体、Narayanan S等人在NAR 2004，32：2901-2911（在此 通过引用并入）中记载的5′-附加酰胺基帽（acylamido caps）。

TINA

已发现TINA（扭转嵌入核酸）对bfo的某些应用特别有利，因为它似乎 引导捕获区域远离所述引物/模板区域单体。因此当TINA单体用作阻块时， 所述捕获区域将几乎没有与所述引物/模板区域相互作用的倾向。

所述TINA单体可描述为如下通用结构Z：

X-L-I₁-C-I₂

其中Ｘ为能掺入寡核苷酸或寡核苷酸类似物或者PNA或PNA类似物的骨 架中的骨架单体单元：L为接头；I₁为包含至少一个基本为平面的共轭体系的 第一嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆积；C 为任选的连接基（conjugator）；并且I₂为包含至少一个基本为平面的共轭体系 的第二嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆积。

在一个优选的实施方案中，所述骨架Ｘ能够掺入到如下分子的寡核苷酸 中：DNA、RNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、 （2’-NH）-TNA、（3’-NH）-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、β-D-核糖 -LNA、β-D-木糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环DNA、6-氨基双环DNA、5-epi- 双环DNA、a-双环DNA、三环DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、 双环[4.3.0]酰胺DNA、β-D-吡喃核糖-NA、a-L-吡喃木糖-NA、2’-R-RNA、 2’-OR-RNA、2’-AE-RNA、a-L-RNA、β-D-RNA以及它们的组合和变体。

在另一个实施方案中，所述骨架单体单元Ｘ包含亚烷基二醇例如乙二醇或 1-O-亚甲基甘油，并任选地包含部分位于一个环系统例如糖基中的亚烷基二 醇。例如，所述骨架单体X可为最终含有选自氮、硫、磷和氧的杂原子的4、 5或6元环的一部分。优选地，所述亚烷基二醇直接连接相邻的寡核苷酸单体 单元，应理解在此实施方案中，所述亚烷基二醇仍然可为环系统例如糖基的一 部分。

在一个实施方案中，所述柔性碱基堆积单体的接头L包括0到60个原子。

在另一个实施方案中，L包括链或环或者它们的组合和/或它们的取代物。

在另一个实施方案中，L包含烷基链或氧杂烷基链或氮杂烷基链或硫杂烷 基链或者酰胺基或硫代酰胺基或磺酰胺基或者它们的组合。

在一个优选的实施方案中，I₁为任选地选自苯、萘、甘菊环烃、双环杂芳 环体系和它们的取代物的单环或多环芳环体系。

在一个优选的实施方案中，I₁在所述单环或多环芳环体系的1，2位上与L 和C连接。

在另一个实施方案中，I₁在所述单环或多环芳环体系的1、3位上与L和 C连接。

在另一个实施方案中，I₁在所述单环或多环芳环体系的1，4位上与L和 C连接。

在一个更优选的实施方案中，I₁为L和C位于邻位（L和C位于1，2位） 或对位（L和C位于1，4位）的苯环。

所述柔性碱基堆积单体的C为任选的连接基。在一个C为非任选的优选 实施方案中，C选自1-12个碳原子的烷基、2-12个碳原子的烯基、2-25个碳 原子的炔基或重氮基或者它们的长度不超过25个碳原子和/或氮原子的组合。

在另一个实施方案中，所述柔性碱基堆积单体中不含有任何连接基。因此， I₁和I₂可以直接连接，例如通过共轭体系直接连接。

在另一个实施方案中，C选自由直链或支链或单环芳环以及它们的最终含 有选自氮、硫、磷和氧的杂原子的取代物组成的组。

在另一个实施方案中，所述C的烯基为乙炔基或重复的乙炔基。

在一个优选的实施方案中，包含磷原子的骨架单体单元X的单元长度小 于6个原子，其中所述骨架单元长度为从一个单体到下一个单体的最短距离。

在一个优选的实施方案中，所述接头部分L的长度为至少2个原子并最 终具有选自氮、硫、磷和氧的杂原子。优选地，所述接头部分L的长度在2 到10个原子之间，更优选地在2到5个原子之间。在一个最优选的实施方案 中，所述接头部分的长度为3个原子，对应于X和I₁之间有5个键。

所述柔性碱基堆积单体的I₂包含至少一个基本为平面的共轭体系的第二 嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆积。

在一个优选的实施方案中，I₂选自双环芳环体系、三环芳环体系、四环芳 环体系、五环芳环体系以及它们的杂芳环类似物和它们的取代物。最优选四环 芳环体系，具体为芘。

在一个具体实施方案中，I₂为1H-菲并[9,10-d]咪唑-2-基基团或芘。

在最优选的实施方案中，Z可描述为下式：

其中R选自芳乙炔基（arylethynyl）、芘乙炔基（pyreneethynyl）和1H-菲 并[9.10-d]咪唑-2-基，基团R可在苯的邻、间或对位上取代。更优选邻位和对 位。

INA

INA（嵌入核酸）可描述为如下通式：

X-Y-Q

其中Ｘ是能掺入到核酸或核酸类似物的骨架中的骨架单体单元，优选X 包括亚烷基二醇。

Ｑ为包含至少一个基本为平面的共轭体系的嵌入剂，所述体系能够与 DNA的核苷碱基共堆积，优选Q为选自由苯、萘、甘菊环烃、双环杂芳环体 系、三环芳环体系、四环芳环体系、五环芳环体系和它们的杂芳环类似物和它 们的取代物的单环或多环芳环体系。最优选四环体系，具体为芘。

Y为连接所述骨架单体单元和所述嵌入剂的接头部分。

Q和Y的总长度通常为更优选为

在一个优选的实施方案中，包含磷原子的骨架单体单元X的单元长度小 于6个原子，其中所述骨架单元长度为从一个单体到下一个单体的最短距离。 捕获区域-配体相互作用

包含1个或2个单链悬突（捕获区域）的双链核酸通常进行进一步操作，优 选地，所述dso的捕获区域（cr）与配体（例如寡核苷酸或蛋白质）相互作用。

纳米结构

因此，双链核酸例如可用在纳米技术中用于生成基于核酸的纳米结构。在 这样的实施方案中，具有单链悬突的双链核酸通常与第二双链核酸接触，优选 与同样具有单链悬突的双链核酸接触。通常，设计单链悬突使它们具有互补区 域，即它们能与彼此退火。一个单链悬突可具有允许与超过一个（例如，2个 或3个）的其它单链悬突退火的长度。这样，刚性双链核酸能够以各种方式连 接来形成纳米结构。

捕获

在另一个实施方案中，所述方法进一步包括捕获步骤，其中所述dso的捕 获区域（cr）与捕获探针退火。如实施例1中所示，用在本发明中的聚合酶阻 块B（例如上面描述的TINA）改善了捕获。意图不受理论的限制，一般认为 改善的捕获是基于刚性的TINA结构，该结构引导捕获区域远离双链区域，从 而增加捕获区域的可接近性。

所述捕获探针通常固定在固体载体上或者可选地使所述捕获探针适合在 固体载体上固定。

所述固体载体例如可以为珠、印迹（blot）或阵列（array）。

在dso与捕获探针接触并且捕获探针与cr退火后，通常进行分馏步骤以 将退火了的分子（PCR产品）与没退火的分子分离。

在一个优选的实施方案中，所述捕获探针包含嵌入剂，例如上述的TINA 单体或INA单体。所述捕获探针还可包含2个以上嵌入剂。如实施例部分所 示，包含嵌入剂的捕获探针提高了捕获反应的效率。

当靶扩增产物已经被捕获在固体表面时，通常下一步会是如下的一步或多 步：

a检测阶段，借此观测所固定的靶扩增产物

b纯化阶段，借此纯化所固定的靶扩增产物

c操作阶段，借此进一步操作所固定的靶扩增产物

实施例

介绍

在本发明的方法中，将诸如TINA分子的聚合酶阻块置于双官能寡核苷酸 中。连接TINA分子的寡核苷酸3’的部分起常规PCR引物的作用，而连接TINA 分子的寡核苷酸5’的部分为无意义（nonsense）寡核苷酸尾。这种方法具有多 个优点，能概括为：i）提高了多重PCR的效率；ii）提高了检测多重PCR反 应时的分析灵敏度；iii）降低了在用于检测多重PCR产物的微阵列（microarray） 和生物传感器方法中的非特异性交叉反应；以及iv）更容易设计且PCR反应 更均匀。双官能寡核苷酸中的TINA分子仍需提高PCR反应的效率，但TINA 分子也通过PCR聚合酶消除了通读现象（read-through），使无意义寡核苷酸序 列留下作为单链悬突。单链PCR悬突使得检测多重PCR反应无需先使PCR 产物变性-提高了检测PCR扩增子的分析灵敏度。由于能够自由设计无意义寡 核苷酸标签序列，多个PCR扩增子间的交叉反应的风险降低了。由于通过无 意义寡核苷酸标签-序列鉴别（discriminated）PCR扩增子，PCR扩增子能够设 计为具有相似长度。通过使PCR扩增子的长度相等，可实现多重PCR效率的 均匀化-简化了多重PCR试验的优化。本发明所述的方法的最终好处为多重 PRC试验的批间均匀性更大。

实施例1：

本实验的目的在于比较变性的PCR产物的固相检测和BFO修饰的PCR 产物的检测。

PCR反应：

为常规PCR选择以来自大肠杆菌的eltA基因为目标的引物组，而以rrs 基因为目标的引物组用于BFO修饰的PCR。两个引物组的序列都是基于 Brandal LT等人的J Microbiol Methods（2007，2月：68（2）：331-41）。实施 例中的所有寡核苷酸都购自IBA GmbH或DNA技术股份公司（0.2μmol合成 规模，采用HPLC纯化和质量控制）。

临床的ETEC大肠杆菌菌株D2262（estA，eltA和rrs，阳性）于37℃在 SOS板上生长过夜。将一半菌落溶于100μL水中并在95℃使细胞裂解15分钟。 以2300g离心一分钟除去细胞碎片（Cell debris），上层清液用于PCR。

用于eltA基因的常规PCR的引物对为：

名称∶序列∶

eltATAG17F   AAGAGAAGGAGAAAGAGTCTCTATGTGCATACGGAGC

eltABio R    生物素-CCATACTGATTGCCGCAAT

PCR片段长度：322bp.

用于rrs基因的双官能寡核苷酸PCR的引物对为：

名称∶序列∶

rrs T-TAG17F  AGAGGAAGAAGAGAGAAXCCCCCTGGACGAAGACTGAC

rrsBio R      生物素-ACCGCTGGCAACAAAGGATA

PCR片段长度：401bp.

Ｘ为对-TINA（如第10页描述的Z，其中R为芘乙炔基，R在苯的对位 取代），生物素为标准的生物素。

PCR在25μL反应体积中进行，该反应体积由如下组成：1×PCR缓冲液 （1.61g/LTris–HCl、6.88g/L Trizma  碱、2.12g/L(NH₄)₂SO₄、100μL/吐温80、 5g/L Ficoll 400）、各0.2mM的dNTP、各0.2μM的引物、2.5mM MgCl₂、0.08% BSA、1μL模板DNA和1U KAPA2GO Robust HS DNA聚合酶。在SensoQuest Labcycler上，采用由以下步骤组成的PCR程序进行PCR：步骤1：95℃，4 分钟；步骤2：步骤3到步骤5循环30次；步骤3：95.0℃，15秒；步骤4： Y℃，30秒；步骤5：72.0℃，30秒；以及步骤6∶72℃，1分钟。对于eltA PCR， Y为59.5℃；对于rrs PCR，Y为53.1℃。采用来自Macherey-Nagel的MN Nucleospin Extract II试剂盒纯化PCR产物。在nanodrop^TM上测量DNA浓度， 对于eltA PCR反应DNA浓度为18.3ng/μL，对于rrs PCR反应DNA浓度为 42.4ng/μL。

BFO修饰的PCR产物的Luminex检测

在Luminex200^TM上，采用与以各孔中eltA、estA和rrs为目标的一组三个 磁珠（MagPlex^TM）偶联的捕获寡核苷酸检测BFO修饰的rrs PCR产物。用于 estA的捕获寡核苷酸与珠15偶联，用于rrs的捕获寡核苷酸与珠29偶联，用 于eltA的捕获寡核苷酸与珠61偶联。BFO修饰的PCR产物的单链悬突被基 于Watson-Crick的反平行双链形成常规DNA或对-TINA修饰的DNA寡核苷 酸捕获。

捕获寡核苷酸名称：捕获寡核苷酸序列：

C_estA_AD_008NH2-CX-HEGL-TTTCCTCTTCCTTT

C_rrs_AD_008NH2-CX-HEGL-TCTCTTCTTCCTCT

C_eltA_AD_008NH2-CX-HEGL-TTTCTCCTTCTCTT

C_estA_AD_010NH2-CX-HEGL-XTTTCCTCTTCCTTTX

C_rrs_AD_010NH2-CX-HEGL-XTCTCTTCTTCCTCTX

C_eltA_AD_010NH2-CX-HEGL-XTTTCTCCTTCTCTTX

X为对-TINA、NH2-CX为氨基修饰的环己烷间隔基，HEGL为C18六乙 二醇（hexaethyleneglycol）间隔基。

常规DNA捕获寡核苷酸采用Luminex推荐的基于EDC的寡核苷酸偶联 步骤偶联，而对-TINA修饰的寡核苷酸采用基于NHS-EDC的自身（in–house） 偶联步骤偶联以保证在珠上涂覆同等程度的寡核苷酸。

Luminex试验采用V形微量滴定板（NUNC，商品目录号249952）进行。 将三种珠中每个的0.2μL与PCR产物、杂交缓冲液和无菌水混合成100μL的 最终体积。以三倍稀释系列稀释PCR产物，从0.5μLPCR产物开始。最后的 缓冲液由20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、400mM NaCl、pH为6.5的0.03%Triton X-100组成。在35℃，以900rpm的搅拌速度（来自ThermoScientific的iEMS Incubator/shaker^TM）将板培育30分钟。用5mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、100mM NaCl、pH为6.5的0.03%Triton X-100洗涤板三次，再添加检测缓冲液。所述 检测缓冲液由5μg/mL链霉亲和素（Streptavidine）-R-PE（优质级S-21388， Invitrogen）、100μg/mL牛血清蛋白组分V（K39619718921，默克）、20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、400mMNaCl、pH为6.5的0.03%Triton X-100组成。在35℃， 以900rpm的搅拌速度将板培育15分钟，并用5mMNaH₂PO₄/Na₂HPO₄、 100mMNaCl、pH为6.5的0.03%Triton X-100洗涤三次，再在Luminex200^TM系统上进行分析，每个珠计算至少300次。

常规PCR产物的Luminex检测：

在Luminex200^TM上采用以各孔中eltA、estA和rrs为目标的三重磁珠 （MagPlex^TM）检测eltA PCR产物。用于rrs的捕获寡核苷酸与珠13偶联，用 于estA的捕获寡核苷酸与珠15偶联，用于eltA的捕获寡核苷酸与珠81偶联。 采用与BFO修饰的PCR产物的Luminex检测相同的规程使寡核苷酸与 MagPlex^TM偶联。

捕获寡核苷酸名称：捕获寡核苷酸序列：

C_rrs_AD_004    NH2-CX-HEGL-AGAGGAAGAAGAGAGAACCCCCTGG

C_estA_AD_005   NH2-CX-HEGL-AAAGGAAGAGGAAAAGGCACCCGGT

C_eltA_AD       NH2-CX-HEGL-AAGAGAAGGAGAAAGAGTCTCTATGTG

C_rrs_AD_005TT  NH2-CX-HEGL-XAGAGGAAGAAGAGAGAACCCCCTGGX

C_estA_AD_006   NH2-CX-HEGL-XAAAGGAAGAGGAAAAGGCACCCGGTX

C_eltA_AD_T     NH2-CX-HEGL-XAAGAGAAGGAGAAAGAGTCTCTATGTGX

X为对-TINA，NH2-CX为氨基修饰的环己烷间隔基，HEGL为C18六乙 二醇间隔基。

采用V形微量滴定板（NUNC，商品目录号249952）进行Luminex试验。 将三种珠各0.2μL与PCR产物、Triton X-100（在100μL反应体积中最后浓度 为0.03%）和无菌水混合成80μL的最终体积。以两倍稀释系列稀释PCR产物， 从1.0μLPCR产物开始。在95℃，在AccuBlock^TM上将板培育5分钟，再立 刻转移到冰中进行2分钟。添加冷杂交缓冲液至总体积为100μL，最后缓冲液 由10mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、200mM NaCl和pH为6.5的0.03%Triton X-100 组成。在45℃，以900rpm的搅拌速度（来自ThermoScientific的 iEMSIncubator/shaker^TM）将所述板培育15分钟。用10mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、 200mMNaCl、pH为6.5的0.03%Triton X-100洗涤所述板三次，再添加检测缓 冲液。所述检测缓冲液由5μg/mL链霉亲和素-R-PE（优质级S-21388， Invitrogen）、100μg/mL牛血清蛋白组分V（K39619718921，默克）、10mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、200mM NaCl、pH为6.5的0.03%Triton X-100组成。在 45℃，以900rpm的搅拌速度将所述板培育10分钟，并用10mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄、200mM NaCl、pH为6.5的0.03%Triton X-100洗涤所述 板三次，再在Luminex200^TM系统上进行分析，每个珠计算至少300次。

结果：

图1比较了通过DNA寡核苷酸和对-TINA修饰的DNA寡核苷酸捕获对 eltA和rrs PCR产物进行的检测。对于两个PCR，对-TINA修饰的捕获寡核苷 酸提高了Luminex检测方法的灵敏度。捕获变性的eltA PCR产物不如捕获BFO 修饰的rrs PCR产物灵敏。在这两个试验之间许多因素不同。检测rrs PCR产 物，我们在35℃使用14-mer捕获寡核苷酸进行30分钟，并且一价阳离子浓 度为420mM；而检测eltA PCR产物，使用27-mer捕获寡核苷酸，一价阳离 子浓度为210mM并在95℃进行了5分钟变性，转移到冰中进行2分钟（以 抑制重退火），并在45℃培养15分钟（由于重退火可能在15分钟之后完成）。 对于这两个试验都测试了与另外两个捕获寡核苷酸的交叉反应，并且对于这两 个试验都没有检测到交叉反应。

结论：

在本实验中，BFO修饰的PCR产物的检测倾向不太严格的检测条件（较 高的一价阳离子浓度和较低温度）和较高的目标浓度（考虑Nanodrop^TM DNA 测量结果和PCR片段长度），但另一方面，变性的PCR产物的检测严重倾向 几乎为检测BFO修饰的PCR产物的捕获寡核苷酸的两倍长的捕获寡核苷酸。 考虑这些因素，我们得出以下结论：与变性的PCR产物的检测相比，检测BFO 修饰的PCR产物的灵敏度显著提高了。

实施例2

我们想要表明：邻-TINA，如同来自实施例1的对-TINA一样，终止（stops） DNA聚合酶，从而邻-TINA改善了PCR反应。我们比较了包含PCR反应中 的引物的邻-TINA和包含终止DNA聚合酶的C3间隔基的引物对。所使用的 引物对如下所示。

引物∶ipaH oT mix v2oT

引物：ipaH C3mix

Z如第10页上所述，其中R为芘乙炔基，R在苯的邻位上被取代。

DEC082F和DEC083R引物是DNA Technology制造的，DEC066F是 EuroFins MWG Operon制造的。寡核苷酸溶解于ddH₂O中形成100μM浓度。 PCR反应在细菌裂解液（包含模板基因的细菌群在水中煮沸15分钟，1μl的 煮沸的裂解液用作各PCR反应中的模板）中完成。用在这个实验中的菌株为 大肠杆菌（包含ipaH基因的fr1368）。在SensoQuest Labcycler上，在25μl 的总体积中进行PCR反应。PCR反应的组分的最终浓度为：1×Euro Optima 缓冲液（10.4mM Tris-HCl、56.8mM Trizma-碱、16.1mM(NH)₄SO₄、0.01%吐 温80、30mM NaCl）、2mM dATP、dGTP、dCTP和0.66mM dTTP和1.33mM dUTP、2.5mM MgCl₂、0.08%BSA、1×SYBR绿I、0.25U Uracil DNA糖基化 酶（来自Fermantas公司）和1U KAPA2G Robust HS DNA聚合酶（来自 KAPA-Biosystems公司）。使用了4种不同的引物浓度：50nM、100nM、200nM 和400nM。采用60到80℃的退火梯度测试PCR反应。PCR程序如下所示。

PCR程序Euro Optima Mastermix：

30个循环：

板配置和精确的退火梯度如下所示。

在琼脂糖凝胶上测试PCR产物来进行对比。在所述凝胶上测试5μl各种 PCR产物。具有Gel Red染料的2.5%的琼脂糖凝胶在130伏（恒定）电压下 进行20分钟。第1道中包含1μl分子标记（GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder （Fermentas公司，SM0323））。第2-12道包含来自第2-12柱的PCR产物。每 种凝胶在相同的浓度包含2种PCR反应。包含PCR反应的邻-TINA总是最先 加载（第1排），随后是C3间隔基PCR反应（第2排）。

结果：

图4A显示了50nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。邻-TINA PCR反应和C3间隔基PCR反应都从61.8℃分别 进行到了70.9℃和67.3℃，这表明邻-TINAPCR反应在引物浓度为50nM时比 C3间隔基反应进行地更好。

图4B显示了100nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。邻-TINA PCR反应和C3间隔基PCR反应都从61.8℃分别 进行到了72.7℃和69.1℃，这表明邻-TINA PCR反应在引物浓度为100nM时 比C3间隔基反应进行地更好。

图5A显示了200nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。邻-TINA PCR反应和C3间隔基PCR反应都从61.8℃分别 进行到了80.0℃和70.9℃，这表明邻-TINA PCR反应在引物浓度为200nM时 比C3间隔基反应进行地更好。尽管邻-TINA的最后一次PCR反应仅生成了弱 条带。

图5B显示了400nM时退火梯度上邻-TINA（第1排）和C3间隔基PCR （第2排）产物。邻-TINA PCR反应和C3间隔基PCR反应都从61.8℃分别 进行到了80.0℃和72.7℃，这表明邻-TINA PCR反应在引物浓度为400nM时 比C3间隔基反应进行地更好。

总结包含邻-TINA和C3间隔基引物的PCR结果：邻-TINA引物通常比包 含引物的C3间隔基进行地更好。在所有的测试浓度下，邻-TINA引物比C3 间隔基引物在更高的退火温度下进行。这意味着邻-TINA引物能在较低浓度使 用并且与包含引物的C3间隔基进行地一样好，或者包含引物的邻-TINA可在 较高的退火温度使用并且与C3间隔基引物进行地一样好。这使得多重PCR具 有很大的优势，因为可降低引物浓度和升高退火温度得到更好的结果。

接下来的步骤是表明CliffHanger引物中的邻-TINA可终止DNA聚合酶， 从而生成单链悬突。为了测试邻-TINA终止DNA聚合酶的能力，我们对涂覆 有单链寡核苷酸的Luminex珠进行了PCR产物的捕获研究。如果邻-TINA具 有终止DNA聚合酶和生成单链悬突的能力，那么至少能和C3间隔基片段一 样好地在Luminex珠上捕获邻-TINA片段。

与我们使用5μlPCR产物的琼脂糖凝胶分析相比，对于Luminex捕获测试， 我们使用了1μl纯化的PCR片段。我们从400nM实验中选择了4个退火温度， 由此PCR产物被纯化（见下文）。

  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 °C 60.0 61.8 63.6 65.5 67.3 69.1 70.9 72.7 74.5 76.4 78.2 80.0 G   x     x     x     x   H   x     x     x     x  

用MN Nucleospin Extract II试剂盒（Macherey-Nagel）按照规程纯化PCR 片段。为保持实验中的跟踪和追踪，用与初始体积相同的体积洗提纯化的PCR 产物。

Luminex捕获分析是这样进行的：1μl纯化的PCR产物稀释6次，每次稀 释3倍，生成稀释液系列（1；0.3333；0.1111；0.0370；0.0123；0.0041；0.0014μl）。 在HB-缓冲液（最终浓度为20mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄+400mM NaCl+0.03% Triton x-100，pH为6.94）中在具有捕获寡核苷酸的luminex珠（每孔0.2μl） 的存在下分析PCR产物。所述捕获混合物在51℃和900rpm下培养30分钟。 培养后，用洗涤缓冲液（稀释4次后的HB-缓冲液）洗涤反应3次。在最后一 次洗涤后，将检测混合物添加到反应中，该检测混合物由100μg/ml牛血清蛋 白组分V（默克）和洗涤缓冲液中5μg/ml的链霉亲和素-R-藻红蛋白（Sigma 公司）组成。在51℃和900rpm下培养检测混合物15分钟，随后用洗涤缓冲 液洗涤3次。对Luminex仪器设定程序以在90秒内计算每孔300个珠。

结果

捕获分析的结果（图6）表明：可捕获邻-TINAPCR产物，这就意味着邻 -TINA可终止DNA聚合酶从而生成单链悬突。Luminex结果反映了来自琼脂 糖凝胶分析的结果。邻-TINA PCR产物似乎在琼脂糖凝胶上比C3间隔基产物 具有更高的浓度，并且在Luminex分析中，邻-TINA还比C3间隔基产物生成 了更高的MFI。这表明邻-TINA终止DNA聚合酶至少与C3间隔基一样好。 MFI与琼脂糖凝胶上的PCR产物的条带的强度有关。Luminex试验似乎也比 琼脂糖凝胶更灵敏，因为我们可检测到低至0.0014μl的PCR产品（稀释曲线 具有良好的线性）。在琼脂糖凝胶上，2种引物之间的差异为约3℃，而Luminex 分析中它们的差异为约6℃，这表明Luminex仪器更灵敏并且比琼脂糖凝胶能 更好地进行鉴别。最终结论

我们已经表明：与C3间隔基相比，邻-TINA改善了PCR反应而且它还能 终止DNA聚合酶，至少与C3间隔基一样好。