减少或防止微藻贴壁的方法及微藻养殖方法

摘要

本发明提供一种利用消泡剂减少或防止微藻贴壁的方法及微藻养殖方法。具体地，在微藻培养过程中，通过向微藻培养液中加入适量的有机硅消泡剂能够有效地减少或防止微藻贴壁，并且对微藻的生长没有不利影响。

说明书

技术领域

本发明提供一种利用消泡剂减少或防止微藻贴壁的方法以及一种微 藻养殖方法。具体地，在微藻培养过程中，通过向微藻培养液中加入适量 的有机硅能够有效地减少或防止微藻贴壁，并且对微藻的生长没有不利影 响。本发明的方法克服了微藻培养过程由于微藻贴壁带来的缺点。

背景技术

微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生长最为迅速的一种 低等植物，作为生物圈中第一生产力的重要组成部分，是水生态系统中水 产动物整个生长过程的唯一饵料或饵料生物的饵料。同时，微藻种类繁多， 现已知的已有20000多种，其多样性、复杂性和特异性决定了其潜在的营 养和医学价值，人类可能从中开发出大量结构特异的高附加值活性物质。

现阶段，人类获取微藻资源最主要的方式是规模化人工培养生产微藻。 然而，在微藻培养过程中，因重力、曝气不均和微藻本身生理特性等，培 养装置内壁或与藻液接触的物件上常常会出现贴壁现象。“贴壁”是指在 微生物(例如，细菌、真菌、微藻、细胞等)培养过程中，出现的生物污 垢贴在培养装置内壁上的现象。微藻细胞一旦发生贴壁，产生恶性循环并 形成以下不利影响，使微藻培养效果不断下降，甚至导致整个培养体系崩 溃：首先，微藻发生贴壁到培养装置内壁后，导致培养装置材料表面粗糙， 增大了流体阻力，降低了藻液流速，使得藻细胞更容易发生贴壁现象；其 次，微藻贴壁后，对于光生物反应器来说，不同程度的影响了反应器的光 透性，阻碍了光进入到光生物反应器内部，因此内部微藻所吸收的光不足， 微藻细胞光合效率下降；第三，贴壁的微藻细胞始终处于强光，光线过饱 和而发生光损伤，甚至发生细胞死亡。另外，如果贴壁细胞死亡后，藻体 发生腐烂，也影响微藻产品质量。在以往的微藻生产工艺中，贴壁发生后 的处理方式主要是收获微藻后，进行培养装置的清洗，如专利 CN102000679A管道光生物反应器管内壁的清理方法。这样虽然解决了贴 壁的问题，但这样的方式增加了人力、物力，也就增加了生产成本。所以， 如何防止或减少贴壁降低生产成本，提高微藻培养效率和微藻产品质量在 微藻的培养过程中就显得十分重要，然而到目前为止，国内外还没有能够 有效防止微藻培养过程中贴壁的方法。

贴壁与接触物质的表面能大小有很大关系，表面能越大越容易引起贴 壁，如微藻细胞分泌的糖类物质，就是表面能很大的物质。为了防止贴壁， 可以从改变接触面的表面能入手，在微藻培养中，接触的是反应器内表面 和藻液，所以可以从改变反应器内表面和藻液表面能出发。

而在专利CN102040909A，主要是要解决船舶表面粘微藻的问题，没 有解决透光率的问题。

有机硅是指含有Si-O键、且至少有一个有机基是直接与硅原子相连 的化合物。由于有机硅独特的结构，兼备了无机材料与有机材料的性能， 具有表面张力低、粘温系数小、压缩性高、气体渗透性高等基本性质，并 具有耐高低温、电气绝缘、耐氧化稳定性、耐候性、难燃、憎水、耐腐蚀、 无毒无味以及生理惰性等优异特性。其中因其分子间的作用力比碳氢化 合物要弱得多，因此，比同分子量的碳氢化合物粘度低，表面张力弱， 表面能小，成膜能力强。这种低表面张力和低表面能使它具有疏水、 消泡、泡沫稳定、防粘、润滑、上光等各项优异性能，并获得多方面 应用。

目前，利用硅降低表面附着力的方法主要是制备一种有机硅防污 材料，将其涂在物体表面，例如，涂在玻璃表面，从而提高表面的光 滑度和疏水性，减少微藻的贴壁。

例如，申请号为201010531312.7的发明专利申请(申请公布号 CN 102040909A，申请日为2010年10月23日)公开了一种低弹性 模量有机硅防污材料的制备方法，其中提到制备一种含有有机硅(乙 烯基封端的聚二甲基硅氧烷和含氢硅油)的防污材料，将该材料涂在 玻璃表面可以提高微藻的脱附率，也就是提高了表面防微藻贴壁的能 力。

另外，文献1：Surface modification approach to control biofouling， (Marine and Industrial Biofouling Springer Series on Biofilms，2009，Volume 4，I，135-163，DOI：10.1007/978-3-540-69796-1_7)，文中提到解决生物污染 问题的主要方法有三种：(1)机械方式除去生物污染物；(2)用灭活或杀 死生物膜的方式，如使用抗生素、杀虫剂、化学清洁剂等；(3)表面改性， 这种改性通常会改变表面的化学成分和形态，表面形貌和粗糙度，亲水性 /疏水平衡，以及表面能和极性。

然而，在微藻培养中，如果这样做的话，涂在反应器内表面的有机硅 防污材料就会挡住太阳光光线，不利于微藻生长；并且，涂在反应器内表 面上的有机硅材料易受到外界的因素(如机械划伤)损坏，如果损坏，也 就失效了，再涂有机硅的话，其工艺复杂。其次，涂在内表面的有机硅材 料易因老化而失效。

发明内容

本发明提供一种全新的减少或防止微藻养殖过程贴壁发生的方法，具 体是在微藻培养液中添加适量的消泡剂，从而有效减少或防止微藻的贴 壁。在微藻培养过程中使用本发明的方法可以延缓培养装置的清洗，减少 清洗的次数，降低微藻生产成本。

可以用于本发明的方法中的消泡剂包括但不限于含硅表面活性剂，例 如，有机硅，所述有机硅包括硅油型和硅醚混合型。

利用本发明的方法，因为是直接在微藻培养液中添加有机硅，对反应 器的透光率不会有影响；其次，因为是在配制培养基时与培养基成分一起 添加到培养基中或直接添加在微藻培养液中的方式进行有机硅消泡剂添 加，所以操作工艺简单。

可以用于本发明的方法的有机硅的类型为市售的有机硅消泡剂，具体 为有机硅消泡剂，结构为一种不同聚合度链状结构的聚有机硅氧烷乳化 液，包括硅油型和硅醚混合型。

本发明的方法还可以在微藻培养过程中，向培养液中添加终浓度为 5-200ppm，优选5-150ppm，更优选5-100ppm，进一步优选5-50ppm的有机 硅消泡剂。

需要说明的是，在本发明中，有机硅消泡剂终浓度单位ppm示的是体 积的百万分之一，除非另外指明，本发明中所有ppm均表示体积的百万分 之一，例如：有机硅消泡剂终浓度5ppm表示在体积为1000升的培养液中 加入有机硅消泡剂的量为5毫升。具体而言，所述有机硅消泡剂的终浓度： 指有机硅占培养藻液体积的浓度，所述培养藻液体积包含培养基体积和藻 种体积。

有机硅消泡剂添加的方式可以在微藻开始培养时加入，方法分为在配 制微藻培养基时与培养基成分一起直接加入到培养基中或在接好藻种后 直接向微藻培养液中添加。本领域技术人员应该理解，有机硅消泡剂可以 在微藻发生贴壁前的任意时间进行添加，例如，如果微藻贴壁发生的时间 是微藻开始培养后的第7天，那么可以在前6天的任意时间进行添加。

可以使用本发明的方法减少微藻贴壁的的藻类包括海水藻和淡水藻， 优选眼点拟微绿球藻、金藻、小球藻、雨生红球藻、硅藻等。

在一个实施方案中，按终浓度为5-200ppm计算需要的有机硅量，在配 制培养基时，将有机硅直接加入到培养基中，混匀，然后接入藻种。

在另一个实施方案中，直接向已经配好的微藻培养液中，添加有机 硅消泡剂到终浓度为5-200ppm，例如，5-150ppm，5-100ppm，5-50ppm， 5-30ppm，优选15ppm，20ppm，或30ppm。

另外，本发明还提供一种微藻养殖方法，其包括配制微藻培养基， 将所述培养基加入到光生物反应器中，接入藻种，在微藻培养条件下培养， 其特征在于，微藻培养液中包含消泡剂。其中所述消泡剂为含硅表面活性 剂，优选为有机硅，添加有机硅的终浓度为5-200ppm，优选5-150ppm， 更优选5-100ppm，进一步优选5-50ppm，其中ppm表示体积的百万分之 一。并且，所述消泡剂在配制微藻培养基时与培养基成分一起直接添加到 所述微藻培养基中，或者在接入藻种后添加到所述微藻培养液中，或者在 微藻发生贴壁前的任意时间添加到所述微藻培养液中。

本发明的微藻养殖方法还包括向微藻培养液中通入CO₂∶空气为1％ (体积比)的混合气体，温度控制在10-35℃，pH值控制在6.8-8.5。

本发明的微藻养殖方法适用于海水藻和淡水藻，优选眼点拟微绿球 藻、金藻、小球藻、雨生红球藻、硅藻。

本发明的方法能够有效减少或防止微藻在培养过程中贴附到培养装 置的内壁上，所述微藻包括，但不限于，例如小球藻、雨生红球藻、眼点 拟微绿球藻、金藻、硅藻等藻类，其中所用的培养装置包括，但不限于， 塑料光生物反应器、玻璃光生物反应器、有机玻璃光生物反应器以及跑道 池反应器。同时，该方法操作方便，不会影响反应器的透光率。

本发明能有效防止或减少微藻培养过程中的贴壁，从而减少培养装置 的清洗次数(清洗培养装置需要水、化学物、人力等成本)，降低微藻生 产成本；本发明在减少或防止微藻贴壁的同时，因为不是将有机硅涂在培 养装置上，不会对培养装置的透光率产生影响；本发明操作过程简单，用 少量的有机硅消泡剂(5-200ppm)就能达到很好的效果，原料成本低廉。 实验表明：微藻培养液中添加了30ppm有机硅消泡剂可以延长培养装置的 清洗时间。并且，使用本发明的方法微藻培养液的泡沫减少，不易污染培 养装置的内壁和外壁(在藻液流出时)。因微藻贴壁减少时死细胞也相应 减少，由此带来死细胞分泌的毒害物也减少，保持了细胞的活性。

附图简述

图1添加有机硅消泡剂防贴壁实验中微藻生长曲线图；

图2为有机硅消泡剂防微藻贴壁实验的微藻生长曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只 是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

本发明使用的有机硅消泡剂，中文标准名称为有机硅消泡剂，国家标 准编号为GB/T 26527-2011，无具体的分子式和分子量，只要是按照国家 标准制备的都可以，例如，但不限于，上海箭宇化工有限公司的JY-801型 有机硅消泡剂、天津市伊美克精细化工厂的S型高效有机硅消泡剂等。

本发明人在具体的实施方案中使用的有机硅消泡剂购自上海箭宇化 工有限公司。

实施例1添加有机硅消泡剂防贴壁实验

本实施例的实验目的是考察微藻培养中添加有机硅消泡剂防微藻贴 壁的效果以及对微藻生长的影响。

1)培养基配制：按照表1的海水培养基配方配制80L培养基。

表1海水培养基配方

其中，①Fe-EDTA溶液：2.76g FeCl₃.6H₂O溶解在1000mL 0.05M Na2EDTA溶液中。

②微量元素溶液组成如下：

2)将配好的培养基按相同体积20L加入到4个相同规格(长30cm、宽10cm、 高120cm)的PVC塑料光生物反应器中，然后每个反应器中接入10L的OD₇₅₀为6的眼点拟微绿球藻藻种，最终的培养总体积为30L。

3)向上述4个光生物反应器中按照0ppm、50ppm、0ppm、50ppm的终浓度 的量分别加入购自上海箭宇化工有限公司的JY-801型有机硅消泡剂，通入 CO₂∶空气为1％(体积比)的比例的混合气体培养，培养期间温度控制在 10-35℃之间，pH控制在6.8-8.5之间。培养7天后，抽出2/3体积的藻液，留 下1/3体积的藻液，再添加步骤1)中配制的海水培养基到之前的总体积(即， 30L)，并按上述浓度加入有机硅消泡剂再培养7天，如此循环，共培养3 个周期，在培养期间观察各反应器的贴壁情况。

4)各反应器贴壁情况：在培养第5天时，加入有机硅消泡剂浓度为0ppm的 塑料光生物反应器上部内壁已有部分发生贴壁，加入有机硅消泡剂浓度为 50ppm的塑料光生物反应器内壁未见贴壁；在培养第21天时，加入有机硅 消泡剂浓度为0ppm的塑料光生物反应器上部内壁已出现大量贴壁，加入有 机硅消泡剂浓度为50ppm的塑料光生物反应器内壁没有或少量贴壁。

5)同时，通过测量微藻生长的OD₇₅₀值来监测藻的生长情况，其生长曲线 见图1。从图1中可以看出在第1个周期(第1-7天)时，各浓度下的微藻生 长情况无多大差别，由此可见有机硅消泡剂对微藻生长没有影响；在第2 个周期(第7-14天)时，微藻生长情况出现差别，其中50ppm下的藻生长 速度比0ppm下的藻生长速度快；在第3个周期(第14-21天)时，藻的生长 速度差别越来越大，50ppm的微藻生长速度远远高于0ppm的微藻生长速 度。分析其原因是因贴壁物质遮挡了一部分的光线，减少了藻对光的吸收， 从而影响了藻的生长。添加50ppm的有机硅消泡剂对眼点拟微绿球藻的生 长没有影响，且可以防止或减少微藻贴壁。

实施例2不同浓度有机硅消泡剂防贴壁实验

1)培养基配制：按照上述表1的海水培养基配方配制120L培养基。

2)将配好的培养基按相同体积20L加入到6个相同规格(长30cm、宽10cm、 高120cm)的PVC塑料光生物反应器中，然后每个反应器中接入10L的OD₇₅₀为6的眼点拟微绿球藻藻种，最终的培养总体积为30L。

3)向上述6组光生物反应器中按照0、5、10、15、20、30ppm的终浓度的 量分别加入购自上海箭宇化工有限公司的JY-801型有机硅消泡剂，通入 CO₂∶空气为1％(体积比)的比例的混合气体培养，培养期间温度控制在 10-35℃之间，pH控制在6.8-8.5之间。培养7天后，抽出2/3体积的藻液，留 下1/3体积的藻液，再添加步骤1)中配制的海水培养基到之前的总体积(即， 30L)，并按上述浓度加入有机硅再培养7天，如此循环，共培养3个周期， 在培养期间观察各反应器的贴壁情况。

4)各反应器贴壁情况：在培养第5天时，加入有机硅消泡剂浓度为0ppm 的反应器上部内壁已有部分发生贴壁，其他组反应器内壁未见贴壁；在培 养第14天时，加入有机硅消泡剂浓度为为0、5、10ppm的塑料光生物反应 器上已有少量贴壁，其他组反应器内壁未见贴壁；在培养第3个周期即21 天时，0、5、10、15、20ppm的反应器上均见贴壁发生，贴壁较多的是0、 5、10ppm的反应器，15、20ppm的反应器上有少量贴壁，30ppm的反应器 未发生贴壁。

5)同时，通过测量微藻生长的OD₇₅₀值来监测藻的生长情况，其生长曲线 见图2。从图2中可以看出在第1个周期(第1-7天)时，各浓度下的微藻生 长情况无差别；在第2个周期(第7-14天)时，微藻生长情况出现差别，其 中15、20、30ppm下的藻生长速度比0、5、10ppm下的藻生长速度快；在 第3个周期(第14-21天)时，藻的生长速度差别越来越大，其生长速度由 快到慢依次是：30ppm＞20ppm＞15ppm＞10ppm＞5ppm＞0ppm(有机硅消泡 剂终浓度)。对贴壁物质显微镜观察，发现贴壁物质为死细胞和细胞破碎 物质。从图2中，可以看出在添加有机硅消泡剂后，不会减缓微藻的生长。

6)从步骤4)和5)中可以看出，有机硅消泡剂终浓度为0、5、10ppm的反 应器上部内壁在培养到第3周期时出现了大量贴壁，其藻的生长速度在第3 周期时也受到了影响，分析其原因是因贴壁物质遮挡了一部分的光线，减 少了藻对光的吸收，从而影响了藻的生长。另外，大量的死细胞和破碎细 胞物质会影响到藻产品的质量。至此，发生贴壁的0、5、10ppm组反应器 需要清洗后才能使用，而贴壁少和未发生贴壁的15、20、30ppm组反应器 还可以继续使用。

实施例318米长、1.2米高、0.1米宽的PVC塑料袋式光生物反应器(微藻 培养体积1440L)养殖试验

1)培养基配制：按上述表1的海水培养基配方配制养殖眼点拟微绿球藻的 1008L海水培养基，计算终浓度(以微藻培养体积1440L)为20ppm的购自 上海箭宇化工有限公司的JY-801型有机硅消泡剂，其计算的量为28.8ml， 将28.8ml的有机硅加入到培养基中，并搅拌混匀。

2)将培养基接入到塑料袋式光生物反应器中，然后接入432L的OD₇₅₀为5 的眼点拟微绿球藻藻种，进行培养，培养期间通入CO₂∶空气为1％(体积 比)的比例的混合气体，温度控制在10-35℃之间，pH控制在6.8-8.5之间。

3)微藻采收：在微藻培养5天后，采收藻液体积的70％，留下30％作为藻 种继续使用。

4)按照步骤1)配制含有机硅培养基1008L，并加入到上述光生物反应器 中继续培养。如此反复，共培养了35天，均未发生贴壁。

实施例49米长、1.2米高、0.06米宽的玻璃板式光生物反应器(微藻培养 体积540L)养殖试验

1)培养基配制：按上述表1的海水培养基配方配制养殖眼点拟微绿球藻的 432L海水培养基，将终浓度(以微藻培养体积540L)为15ppm的购自天津 市伊美克精细化工厂的S型高效有机硅消泡剂加入到培养基中，并搅拌混 匀。

2)将培养基接入到塑料袋式光生物反应器中，然后接入108L的OD₇₅₀为6 的眼点拟微绿球藻藻种，进行培养，培养期间通入CO₂∶空气为1体积％的 比例的混合气体，温度控制在10-35℃之间，pH控制在6.8-8.5之间。

3)微藻采收：在微藻培养8天后，采收藻液体积的80％，留下20％作为藻 种继续使用。

4)按照步骤1)配制含有机硅培养基432L，并加入到上述光生物反应器中 继续培养。如此反复，共培养了45天，均未发生贴壁。

实施例56米长、1.2米高、0.06米宽的PVC塑料袋式光生物反应器(微藻 培养体积360L)养殖试验

1)培养基配制：按表2配制180L BG11培养基配方养殖小球藻，计算终浓 度(以微藻培养体积360L)为30ppm的有机硅消泡剂(购自天津市伊美克 精细化工厂的S型高效有机硅消泡剂)量为10.8ml，将10.8ml的有机硅消泡 剂加入到培养基中，并搅拌混匀。

2)将培养基接入到塑料袋式光生物反应器中，然后接入180L的OD₇₅₀为3 的小球藻藻种，进行培养，培养期间通入CO₂∶空气为1％(体积比)的比例 的混合气体，温度控制在10-35℃之间，pH控制在6.8-8.5之间。

3)微藻采收：在微藻培养6天后，采收藻液体积的50％，留下藻液体积的 50％作为藻种继续使用。

4)按照步骤1)配制含有机硅培养基180L，并加入到上述光生物反应器中 继续培养。如此反复，共培养45天，均未发生贴壁。

表2BG11培养基配方

其中，微量元素母液的成份组成如下：

  成份   每升用量   H₃BO₃  2.86g   MnCl₂.H₂O   1.81g   ZnSO₄.7H₂O   0.222g   CuSO₄.5H₂O   0.079g   Na₂MoO₄.2H₂O   0.390g   Co(NO₃)₂.6H₂O   0.049g

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地 显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权 利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式 和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。