透明质酸的脱乙酰基水解酶、由脱乙酰基水解酶脱乙酰化的透明质酸及其衍生物

摘要

本发明涉及透明质酸的脱乙酰基水解酶，由该酶脱乙酰化的透明质酸及其衍生物。本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物具有如下特征：在活体中延迟初始分解率；最小限度地减小分子量和粘度；由于具有比未脱乙酰化的透明质酸的凝胶化温度低的凝胶化温度从而促进凝胶化；以及几乎不受培养基中脱乙酰化的透明质酸及其衍生物的浓度的增长影响的人骨髓间充质干细胞的存活率。因此，本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物作为生物成分是有用的，诸如细胞、基因、药物等的传递系统，或组织工程的支架等。

说明书

技术领域

本发明涉及透明质酸的脱乙酰基水解酶，以及使用该脱乙酰基水解 酶制备的脱乙酰化的透明质酸或其衍生物。

背景技术

透明质酸属于糖胺聚糖（GAGs），如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、 硫酸皮肤素及肝素，并且透明质酸是重复单元的多阴离子天然线型聚合 物，每个重复单元由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸组成。透明质 酸存在于眼睛、胎盘、关节的滑液润滑剂、皮肤，以及鸡冠中。根据体 内存在的位置，其分子量的范围为在10³至10⁷道尔顿的内。此外，透明 质酸是细胞外基质的主要成分，并作为支架在包括表皮和真皮的皮肤的 所有层中起重要作用。透明质酸还存在于滑液、脐带，以及所有高等动 物的血液中，并且几乎50%的身体体内的透明质酸位于皮肤、呼吸道， 以及肠道中。透明质酸是糖胺聚糖中唯一的非硫酸化的。由于透明质酸 的充足的负电荷，其可结合阳离子，并吸收大量的水，在天然细胞外基 质中充当渗透性缓冲液并形成水凝胶。因此，透明质酸可作为细胞外基 质中的其它成分的极好的替代物，并且由于其极好的保水性，透明质酸 为组织和关节提供细胞外基质水合的内稳态，且通过物理力负责抵抗压 缩。此外，透明质酸参与组织之间的渗透性调节，并在关节摩擦中诱导 润滑作用，且作为载体给关节的无血管区域提供营养物，或从关节的无 血管区域中去除废物。

因此，利用透明质酸的高吸水性和高粘度，天然存在的透明质酸自 身或其衍生物（Glenn D.Prestwich,Jing-wen Kuo,Chemically-Modified  HA for Therapy and Regenerative Medicine,Current Pharmaceutical  Biotechnology,9(4),242-245(2008)）已被应用于化妆品中或医学上中用 于眼睛（E.A.Balazs,M.I.Freeman,R.Kloti,G.Meyer-Schwickerath,F. Regnault,and D.B.Sweeney,"Hyaluronic acid and replacement of vitreous  and aqueous humor",Mod.Probl.Ophthalmol.,10,3~21(1972)）。另外， 发现透明质酸应用于不同的组织再生和组织工程领域，包括软骨和骨骼 的再生（A.H.Isdale,L.D.Hordon,H.A.Bird,和V.Wright, "Intra-articular hyaluronate(Healon):A dose-ranging study in rheumatoid  arthritis and osteoarthritis",J.Drug Dev.,4,93~99(1991).M.Kawabata,M. Igarashi,R.Mikami,S.Ninomiya,和H.Oda,"Clinical evaluations of  SLM-10(sodium hyaluronate injection)in patients with osteoarthritis of the  knee",Yakuri to Chiryo,21,257~283(1993)）、皮肤和软组织的再生，以 及压抑组织的换肤术和整形手术，例如直接向体内注射透明质酸。

尽管作为医学生物材料，透明质酸十分适用，但是由于其在体内的 半衰期短，所以在许多使用上受到限制。实际上，透明质酸在体内很容 易降解，半衰期比胶原更短。在不分泌淋巴液的骨骼和软骨中，透明质 酸很可能通过同时与胶原和蛋白聚糖原位代谢性降解来发生降解。在皮 肤和关节中，20~30%的透明质酸很可能通过局部新陈代谢降解，且其余 的透明质酸通过淋巴途径去除。透明质酸的组织半衰期为半天到2天或3 天（J.R.E.Fraser,T.C.Laurent,和U.B.G.Laurent,Hyaluronan:its nature, distribution,functions,and turnover,J.Intern.Med.,242(1),27-33(1997)）。 特别地，当将透明质酸植入到正常关节时，据报道透明质酸的半衰期少 于1天（T.C.Laurent,和J.R.E.Fraser,Hyaluronan,FASEB J.,6, 2397-2404(1992)）。在眼睛中，透明质酸的半衰期延伸至70天，在眼 睛中透明质酸不与其它糖胺聚糖结合（U.B.G.Laurent,和R.K.Reed, Turnover of hyaluronan in the tissue,Adv.Drug Delivery Rev.,7,237-56 (1991)）。

尽管透明质酸作为医学生物材料具有极高的潜能，但是由于在体内 的迅速降解并且半衰期短，以及天然聚合物自身的机械性能低，目前透 明质酸的使用受到限制。用于整形手术时，透明质酸凝胶必须在体内长 时间保持需要的机械强度，并且由于其半衰期短，通常需要由具有 2,000~3,000kDa的超高分子量的透明质酸制备。

此外，需要对透明质酸进行化学改性，并将其开发成保持透明质酸 结构，但在体内不会迅速降解的衍生物，从而使透明质酸适用于各种临 床目的的生物材料。已经尝试对透明质酸进行许多化学改性。例如，交 联透明质酸，制备成烷基和苄基酯衍生物，或使用偶联剂改性。回顾到 目前为止的研究报告已证明，通过化学改性开发的透明质酸衍生物适合 作为医学用聚合物，该聚合物具有适用于靶组织、器官以及药物递送系 统中的机械和化学性能。根据制药学功能，其中一些衍生物显示保持透 明质酸固有的生物学功能。然而，通过化学改性很难合成具有1.5x10⁶道 尔顿分子量或更高分子量的透明质酸衍生物，因为这样的高分子量聚合 物有可能经受分子间缠结(Y.S.Soh,"Hyaluronic acid:properties and  application",Polymer(Korea),12,(1988))。

针对上述问题，已经提出各种解决方案。例如，可以制备低分子量 的透明质酸，或使用肼脱乙酰化N-乙酰-D-葡萄糖胺部分后，将获得的具 有有机胺基的透明质酸进行化学改性（V.Crescenzi,A.Francescangeli,D. Renier,D.Bellini,New cross-linked and sulfated derivatives of partially  deacetylated hyaluronan:Synthesis and preliminary characterization, Biopolymers,Vol.64,86-94(2002).S.Oerther,A-C Maurin,E.Payan,P. Hubert,F.Lapicque,N.Presle,J.Dexheimer,P.Netter,和F.Lapicque, High Interaction alginate-hyaluronate associations by hyaluronate  deacetylation for the preparation of efficient biomaterials,Biopolymer,54, 273-281(2000)）。另外，将位于β-葡萄糖醛酸的第6位的被认为是透明 质酸酶的靶位点的羧基进行化学性替换从而制备不溶于水的透明质酸凝 胶（Oh EJ,Kang SW,Kim BS,Jiang G,Cho IH,Hahn SK.,Control of the  molecular degradation of hyaluronic acid hydrogels for tissue augmentation. J Biomed Mater Res A.,86(3):685-93(2008)Hahn SK,Park JK,Tomimatsu  T,Shimoboji T.,Synthesis and degradation test of hyaluronic acid  hydrogels.Int J Biol Macromol.,40(4),374-80(2007).）。进一步地，据报 道，不仅可以对重复单元的乙醇基（-OH）进行化学改性，而且还可以通 过破坏糖环结构进行化学改性，并且使用羧酸基上的负电荷进行物理改 性（V.Crescenzi,A.Francescangeli,D.Renier,D.Bellini,New hyaluronan  chemical derivatives.Regioselectively C(6)oxidized products, Macromolecules,34,6367~6372(2001)）。然而，化学脱乙酰化以及使用 偶联剂的化学改性产生具有显著减小的分子量的透明质酸，其导致透明 质酸固有的机械性能弱化（S.Oerther,A-C Maurin,E.Payan,P.Hubert,F. Lapicque,N.Presle,J.Dexheimer,P.Netter,和F.Lapicque,High  Interaction alginate-hyaluronate associations by hyaluronate deacetylation  for the preparation of efficient biomaterials,Biopolymer,54, 273-281(2000)）。此外，脱乙酰化或改性可能引起用于离子交联的多价 金属的分离以及引入的官能团的解离，并且连同降解的透明质酸一起非 常易于产生细胞毒性。另外，降低机械强度的透明质酸大大地限制了其 在医学和工业领域中作为生物材料的应用，并且不能制备成各种类型的 生物材料。特别地，当水凝胶、片材、薄膜、小珠、或纳米纤维作为组 织工程支架应用于再生医学时，一定要保持它们的强度和形态直到引入 周围的细胞到支架为止，从而迅速地构建组织。否则，它们的形态将容 易瓦解，同时功效及周围组织的移植率显著下降。因此，为了保持透明 质酸的必要的骨架，以用作组织工程支架以及作为细胞、蛋白质、金属 和药物的载体，以及作为涂层剂，透明质酸的生物降解性和分子量必须 是可调节的。

另一方面，对N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的脱乙酰基水解酶进行研究， 主要研究了壳多糖脱乙酰基水解酶（CDA:E,C,3.5.1.41），其催化壳多糖 至壳聚糖的转化。在1936年，Watanabe报告指出动物组织中存在N-乙 酰-D-葡萄糖胺的可能性，并且在1957年·S.Roseman首先从大肠杆菌菌 株K-12的提取物中分离出该酶。随后，成功地从鲁氏毛霉的提取物，以 及蜡状芽孢杆菌的提取物；真菌，诸如菜豆炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌及 葡枝根霉；昆虫物种；甲壳动物；以及原生动物兔脑炎原虫中分离出壳 多糖脱乙酰基水解酶。另外，已报告出从鲁氏毛霉、蓝色犁头霉，及构 巢曲霉中分离并纯化壳多糖脱乙酰基水解酶的研究结果。从卵形孢球托 霉和酿酒酵母中成功地分离出钴-活化的壳多糖脱乙酰基水解酶 （Cda2P），并且从兔脑炎原虫、金龟子绿僵菌、及大肠杆菌和米根霉的 培养基中成功地分离出壳多糖脱乙酰基水解酶。近年来，已报告从短帚 霉、被孢霉属真菌DY-52、卷柄根霉，以及霍乱弧菌中分离出壳多糖脱 乙酰基水解酶，但是其纯化结果尚未确定。

另外，自从发现真菌的壳多糖脱乙酰酶和根瘤菌结瘤蛋白质（NodB 蛋白质）之间存在结构相似性，分析了来自真菌，诸如鲁氏毛霉、菜豆 炭疽病菌、酿酒酵母、卵形孢球托霉以及黑根霉中的壳多糖脱乙酰酶的 序列，但尚未公布。

如前所述，对多糖的脱乙酰基水解酶的研究是围绕壳多糖脱乙酰基 水解酶进行的，其能够对一系列连续的N-乙酰-D-葡萄糖胺残留物具有催 化作用，但不能与单糖N-乙酰-D-葡萄糖胺反应。这样的壳多糖脱乙酰基 水解酶不会对肽聚糖N-乙酰化肝素和N-乙酰基半乳糖胺显示酶活性 （Araki,Y.&Ito,E.(1975).A pathway of chitosan formation in Mucor  rouxii,Eur.J.Biochem.,55,71-78(1975)），并且也不会催化透明质酸的 N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的脱乙酰化（Martinou A,Kafetzopoulos D, Bouriotis V.,Chitin deacetylation by enzymatic means:monitoring of  deacetylation process,Carbohyd.Res.,273,235-242(1995)）。如此，已报 告指出除了对壳多糖和壳聚糖的N-乙酰基-D-葡萄糖胺具有酶活性以外， 壳多糖脱乙酰基水解酶不具有酶活性。也就是说，没有在以前的任何文 件中报道过对透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的乙酰基具有选择性 的脱乙酰酶。

因此，需要研究和开发能够选择性地脱乙酰化透明质酸的N-乙酰-D- 葡萄糖胺部分的脱乙酰基水解酶。

发明内容

技术问题

本发明人研究了对透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺的乙酰基具有选 择性的脱乙酰基水解酶，成功地从微生物中分离并纯化了透明质酸脱乙 酰酶，并发现脱乙酰酶在制备脱乙酰化的透明质酸及其衍生物中是有用 的，并且脱乙酰化的透明质酸及其衍生物在体内降解速度缓慢，最小限 度的减少分子量和粘度，具有低胶凝点从而促进凝胶化，并且对人骨髓 间充质干细胞的细胞活性没有影响，由此完成本发明。

技术方案

本发明的一个目的在于提供从微生物中分离并纯化的透明质酸的脱 乙酰基水解酶，其能够催化透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺部分上的乙酰 基的选择性水解。

本发明的另一个目的在于提供脱乙酰化的透明质酸或其衍生物，该 透明质酸或其衍生物通过使用本发明的透明质酸的脱乙酰基水解酶制 备。

有益效果

根据本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物移植到体内后在初始 时期不容易降解，并显示出显著地降低分子量和粘度，胶凝点低于未脱 乙酰化的透明质酸，从而促进凝胶化。此外，脱乙酰化的透明质酸及其 衍生物甚至在高浓度下几乎不对人骨髓间充质干细胞的细胞活性产生任 何负面影响。因此，根据本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物能够 用作生物材料，诸如细胞、基因和药物的载体，以及组织工程支架。

附图说明

图1是从构巢曲霉中分离并纯化的透明质酸脱乙酰酶对壳多糖低聚 物五-N-乙酰壳六糖的活性的色谱图。

图2示出了通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析透明 质酸脱乙酰酶的分离及纯化的图示[泳道1：标志物（标准分子量），泳 道2：30%硫酸铵组分，泳道3：Q-琼脂糖组分（未结合），泳道4：苯 基-琼脂糖组分，泳道5：聚丙烯酰胺葡聚糖组分]。

图3示出了从短帚霉中分离并纯化的脱乙酰酶的水性HPLC色谱图。

图4示出了通过SDS-PAGE分析的从短帚霉中分离的脱乙酰酶的图 示。

图5示出了通过双向电泳系统分析的从短帚霉中分离并纯化的脱乙 酰酶的pI值。

图6示出了未脱乙酰化的和通过透明质酸酶脱乙酰化的透明质酸的 降解率的图示。

图7是表示通过凝胶电泳测量的以酶法和化学方法脱乙酰化的透明 质酸的分子量的图示。

图8是表示以酶法和化学方法脱乙酰化的透明质酸的粘度的流变图。

图9是表示根据与β-磷酸缩水甘油酯相互作用的以酶法和化学方法 脱乙酰化的透明质酸的粘弹性图。

图10示出了脱乙酰化的透明质酸对壳聚糖/β-磷酸缩水甘油酯的凝 胶化的影响[(a)不存在脱乙酰化的透明质酸，(b)存在脱乙酰化的透明质 酸]。

图11示出了人骨髓间充质干细胞的显微图像，该人骨髓间充质干细 胞示出了随着未脱乙酰化的透明质酸和脱乙酰化的透明质酸的浓度变化 的形态变化。

图12示出了随着未脱乙酰化的和脱乙酰化的透明质酸的浓度以及培 养时间改变的人骨髓间充质干细胞的细胞活性的图示。

具体实施方式

根据本发明的一方面，本发明提供了透明质酸的脱乙酰基水解酶， 其能够催化透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺上的乙酰基的选择性水解。

根据本发明的另一方面，本发明提供了通过脱乙酰基水解酶脱乙酰 化的透明质酸及其衍生物。

以下，对本发明进行详细说明。

本发明的脱乙酰基水解酶从微生物中分离并纯化，且对透明质酸的 N-乙酰-D-葡萄糖胺部分上的乙酰基进行选择性地水解。

微生物的例子包括构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、短帚霉 （Scopulariopsis brevicaulis）、鲁氏毛霉（Mucor rouxii）、蜡状芽孢杆 菌（Bacillus cereus）、黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum lagenarium）、匍 枝根霉（Rhizopus stolonifer）、蓝色犁头霉（Absidia coerulea）、卵形孢 球托霉（Gongronella butleri）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 兔脑炎原虫（Encephalitozoon cuniculi）、金龟子绿僵菌（Metarhizium  anisopliae）、肺炎链球菌（Streptococus pneumoniae）、被孢霉属真菌 DY-52（Mortierella sp.DY-52）、卷柄根霉（Rhizopus circinans），以及 霍乱弧菌（Vibrio cholerae），但并不限制于此。在一个实施方案中，本 发明的脱乙酰基水解酶从构巢曲霉和短帚霉中分离并纯化，并分析了从 构巢曲霉中分离并纯化的脱乙酰基水解酶的核苷酸序列，并表示为SEQ  ID NO：1。

另外，本发明涉及使用透明质酸的脱乙酰基水解酶制备脱乙酰化的 透明质酸及其衍生物。详细地，将透明质酸或其衍生物溶于pH3.0~9.0 的缓冲液或蒸馏水，并在10~70℃，优选在30~60°C与透明质酸的脱乙 酰基水解酶一起培养0.001~24小时，更优选培养1~10小时，最优选培 养3~6小时，接着，向反应混合物中加入乙醇以沉淀脱乙酰化的透明质 酸或其衍生物。关于这点，乙醇的量为反应混合物重量的2~10倍，且优 选为约4~7倍。随后，使用乙醇洗涤脱乙酰化的透明质酸或其衍生物的 沉淀物，将其溶于蒸馏水，并在冷冻干燥前使用蒸馏水透析。

通过酶法脱乙酰化的透明质酸比化学法脱乙酰化的透明质酸具有更 高的脱乙酰化程度证明了与化学方法相比，本发明的脱乙酰基水解酶能 够更有效地从透明质酸中去除乙酰基。

发现通过透明质酸酶本发明的脱乙酰化的透明质酸在体内的初始降 解速度延迟，并且最小限度的减小分子量和粘度，从而能制备具有高分 子量和高粘度的脱乙酰化的透明质酸。

另外，本发明的脱乙酰化的透明质酸的胶凝点低于未脱乙酰化的透 明质酸，即完整的透明质酸，这表明通过阴离子的β-磷酸缩水甘油酯和 脱乙酰化的透明质酸的阳离子的游离胺基之间的相互静电作用促进脱乙 酰化的透明质酸的凝胶化。

根据本发明的脱乙酰化的透明质酸的浓度，观察到人骨髓间充质干 细胞的形态没有显著地变化，并且人骨髓间充质干细胞的活性基本上没 有受培养基中脱乙酰化的透明质酸浓度的增长的影响。

如上所述，根据本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物在体内初 始降解速度延迟，最小限度的减小分子量和粘度，且具有低于未脱乙酰 化的透明质酸的胶凝点以易于胶凝化，并且尽管其在细胞培养基中的浓 度增加但对人骨髓间充质干细胞的细胞活性几乎没有影响。因此，根据 本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物能够用作生物材料，适用于细 胞、基因和药物的载体，或组织工程支架。

通过以下实施例更好地理解本发明，该实施例仅在于说明，并不限 制本发明。

实施例1：从构巢曲霉中分离并纯化透明质酸脱乙酰酶

1、构巢曲霉的培养

首先，将构巢曲霉在液体培养基[（葡萄糖5g，酵母提取物2g，蛋 白胨5g，NaCl5g）或（1%葡萄糖，0.15%酵母提取物，0.15%酪蛋白 水解产物，1x维生素溶液，1x最低盐溶液，0.5%壳多糖），总体积为 1L]或在平板培养基[3%蔗糖，0.2%NaNO₃，1%K₂HPO₄,0.05%KCl, 0.05% MgSO₄]中在5~40°C下培养4~2,400小时。然后在液体培养基 [（NaNO₃ 2g，K₂HPO₄ 1g，KCl0.5g，MgSO₄ 0.5g，蛋白胨1g，壳多 糖0~10g）或（1%葡萄糖，0.15%酵母提取物，0.15%酪蛋白水解产物， 1x维生素溶液，1x最低盐溶液，0.5%壳多糖）]或在平板培养基[3%蔗 糖，0.2%NaNO₃，1%K₂HPO₄，0.05%KCl，0.05%MgSO₄]中在5~40°C 下，以1~1,000rpm震荡培养4~200小时。所述维生素溶液包含15.2% NaNO₃，2.6%MgSO₄，15.2%K₂HPO₄，2.6%KCl，0.04%ZnCl₂，0.4% (NH₄)₂Mo₇O₂₄，0.001%MnCl₂，0.03%CuSO₄，以及0.001%FeSO₄，并 且每500mL的所述最低盐溶液中包含核黄素50mg、对氨基苯甲酸250 mg、盐酸吡哆醇250mg、生物素2mg、抗坏血酸250mg、叶酸250mg、 硫胺素250mg以及烟酸50mg。

对于细胞内酶蛋白，通过超声波处理破坏真菌菌丝，然后以 1,000~100,000xg离心分离1~500分钟。使用0~100%梯度的硫酸铵处理 上清液0.1~48小时。以1,000~100,000xg离心分离0~500分钟后，使用 0~100%梯度的硫酸铵处理上清液0.1~48小时。以1,000~50,000xg离心分 离1~500分钟，获得作为沉淀物的酶。对于细胞外酶蛋白，使用0~100% 硫酸铵（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA）使6L的细胞培养液 饱和。以1,000~100,000xg离心分离0~500分钟之后，使用0~100%硫酸 铵使上清液饱和。然后，以1,000~100,000xg离心分离0~500分钟，获得 作为沉淀物的酶。

收集获得的构巢曲霉沉淀物，并悬浮在Tris-HCl缓冲液中（pH7.5）， 使用0~100%硫酸铵（50mM Tris-HCl，pH7.5）过夜透析悬浮液。

2、根据硫酸铵浓度的来自构巢曲霉培养物的沉淀物的酶的脱乙酰化 活性

通过测定由五-N-乙酰壳六糖的酶解产生的醋酸根离子水平分析根 据硫酸铵浓度的来自构巢曲霉培养物的沉淀物的酶的脱乙酰化活性。关 于这点，使用酶偶联法，通过测量从糖中分离的游离醋酸盐离子的水平 来检测脱乙酰化的程度。

在醋酸试剂盒（ENZYTEC^TM）中，如以下反应流程所示，通过脱乙 酰酶的酶促作用释放醋酸根离子，并且在ACS、CS和MDH的存在条件 下与共存的化学计量的NADH的产物连续反应。在吸光度340nm下用 消光系数e₃₄₀=6.31mM^-1cm^-1对NADH进行定量分析。

醋酸盐+ATP+CoA---ACS→乙酰基-CoA+AMP+PPi

乙酰基-CoA+草酰乙酸盐+H₂O---CS→柠檬酸盐+CoA

L-苹果酸盐+NAD⁺←L-MDH→草酰乙酸盐+NADH+H⁺

作为对照，将包含在醋酸试剂盒中的330μL的TEA（三乙醇胺） 缓冲液，67μL的ATP/CoA/NAD溶液，4μL的MDH/CS溶液，7μL的 ACS溶液按顺序连续地加入到1.5mL e-管中，并且使用蒸馏水填充该管 使其总体积达到1mL。在25°C下培养30分钟后，将反应物转移到96- 孔板中，并利用酶标仪（M2,Molecular Devices,USA）在 340nm下测量吸光度。

当使用五-乙酰壳六糖作为基质进行测量时，根据硫酸铵浓度的来自 构巢曲霉培养物的沉淀物的脱乙酰化活性总结在以下表1中。

表1

硫酸铵浓度（%） 0% 1~30% 31~50% 51~70% 71~100% 产生的醋酸盐浓度（A₃₄₀） 0.285 0.852 0.711 0.321 0.314

从表1的数据可知，在硫酸铵浓度为1~50%的组分下检测到来自构 巢曲霉培养物的沉淀物的良好的脱乙酰化活性。因此，使用1~50%硫酸 铵对从构巢曲霉培养物的沉淀物中分离的透明质酸脱乙酰酶进行饱和。

3、从构巢曲霉培养物中分离并纯化透明质酸脱乙酰酶

通过保持在4°C冷藏室中的葡聚糖凝胶G-100柱（Sigma），或结合 Q-琼脂糖柱的苯基-琼脂糖CL-4B柱，对使用1~50%硫酸铵饱和的来自 构巢曲霉培养物的沉淀物进行分馏。将样品加载到用于疏水性相互作用 的苯基-琼脂糖CL-4B（2.5x6cm,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO, USA）柱上，并使用0~1.0M硫酸铵洗脱。然后，通过Q-琼脂糖柱（2.5x 4cm,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA）的阴离子交换层析将洗脱 液分馏。溶解高活性的0.01~5M组分以形成(NH₄₎₂SO₄ 80%饱和溶液， 进行浓缩，并在50mM Tris-HCl，pH7.5中过夜透析，从而分离透明质 酸脱乙酰酶。选择性地，将来自1~50%硫酸铵饱和溶液的蛋白质沉淀物 溶解于50mM Tris-HCl,pH7.5中，并且加载到葡聚糖凝胶G-100柱 （Sigma）（1.6x60cm）上。使用Tris-HCl50mM，pH7.5作为洗脱液 进行洗脱。获得的组分中，使用0~100%硫酸铵处理透明质酸脱乙酰酶 组分0.1~48小时。以1,000~100,000xg离心分离1~500分钟并进行浓缩， 获得纯的透明质酸脱乙酰酶。使用壳多糖低聚物五-N-乙酰壳六糖分析所 述分离并纯化的透明质酸脱乙酰酶的酶活性。

结果在图1中示出。

如图1所示，在包含0.5M NaCl的25mM Tris-HCl(pH7.5)中检测到 透明质酸脱乙酰酶活性。

4、透明质酸脱乙酰酶的鉴定（SDS-PAGE）

使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定从构巢曲霉中分 离并纯化的透明质酸脱乙酰酶。为此，制备10%变性的聚丙烯酰胺凝胶， 并且将纯化的透明质酸脱乙酰酶与标志物（SeeBlue Plus2Prestained  Standard,invitrogen,Carlsbad,CA）一起加载到凝胶中，在120V下电泳。 电泳结束后，使该凝胶在考马斯亮蓝R-250中染色30分钟，并浸没在脱 色液（50%甲醇、10%醋酸）中。

结果在图2中示出。

在图2中可以看出，从构巢曲霉中分离并纯化的透明质酸脱乙酰酶 具有约28kDa的分子量。

5、透明质酸脱乙酰酶基因的核苷酸序列

使用埃德曼降解法分析透明质酸脱乙酰酶的氨基酸序列。由此从酶 蛋白的一部分获得的氨基酸序列用于从已知的数据库中搜索透明质酸脱 乙酰酶的全长氨基酸序列。此外，从全长氨基酸序列中推测透明质酸脱 乙酰酶的核苷酸序列，并将其表示为SEQ ID NO：1。

实施例2：从短帚霉中分离并纯化透明质酸脱乙酰酶

除了使用短帚霉代替构巢曲霉（ATCC36009）以外，按照与实施例 1相同的方式分离并纯化来自短帚霉的透明质酸脱乙酰酶。

通过水性色谱法使用具有Annexin V和BioBasic SEC-120（3007.8 mm）的HPLC Waters M515和Waters486检测器，测定从短帚霉中分离 的透明质酸脱乙酰酶的平均分子量。将Shodex标准P-82作为标准样 品，以1mL/分钟的速度注射100μL的0.1M磷酸缓冲盐水（pH7.4）。 在280nm下测量吸光度。此外，通过10%SDS-PAGE鉴定由短帚霉中 分离的透明质酸脱乙酰酶。进一步地，在双向电泳系统中使用18cm宽分 布IPG胶条（pH3-10）进行等电点聚焦，以检测透明质酸脱乙酰酶的pI 值。

图3和图4分别示出了通过高效液相色谱法HPLC）和SDS-PAGE 分析从短帚霉中分离的脱乙酰酶的结果。图5示出了通过双向电泳系统 检测的酶的pI值。

在图3和图4中可看出，通过高效液相色谱法（HPLC）测量的从短 帚霉中分离的脱乙酰酶具有约55kDa的平均分子量。该结果与10% SDS-PAGE的结果一致。

此外，如图5所示，从短帚霉中分离的脱乙酰酶的pI值为3.0~3.5。

实验实施例1：透明质酸脱乙酰酶的反应性比较

在每个1.5mL e-管中加入50μL的在实施例2中分离并纯化的透明 质酸脱乙酰酶，并且加入20μL的10mM透明质酸（Fluka,#53747,Mw 1,400kDa）和不同pH值的缓冲液（pH5.5、pH7、pH8.5）直到总体积 为200μL。培养4小时后，根据pH和反应温度检测脱乙酰化的程度（室 温、40°C和60°C）。

作为对照，将包含在醋酸试剂盒中的330μL的TEA溶液，67μL的 ATP/CoA/NAD溶液，4μL的MDH/CS溶液，以及7μL的ACS溶液按 顺序连续地加入到1.5mL e-管中，并且使用蒸馏水填充每个管使其总体 积达到1mL。在25°C下反应30分钟后，将反应混合物转移至96-孔板 中，并利用酶标仪（M2,Molecular Devices,USA）在340nm 下检测吸光度。将醋酸钠作为标准样品，建立校正曲线并将其用于检测 产生的游离醋酸根的水平。

在以下表2中总结了根据反应条件（pH、温度）的透明质酸脱乙酰 酶的活性。

表2

从表2的数据可以看出，微生物的透明质酸脱乙酰酶的酶活性在弱 碱性pH条件下随着温度的升高而增强。

实施例3：脱乙酰化的透明质酸的制备

将27.5mL（0.1g）的透明质酸（0.363%）溶解于55mL的0.1M Tris-HCl缓冲液（pH8.5）中，并向其中加入68.75mL的实施例1的透 明质酸脱乙酰酶，然后加入96.25mL的蒸馏水和27.5mL的1M KCl。 将总体积为275mL的混合物在40°C反应4小时，然后按1：4的比例 与99%乙醇（Merck,#1.00983.1011）混合，以沉淀脱乙酰化的透明质酸。 使用99%乙醇洗涤沉淀物，并将其溶解于蒸馏水中，且使用蒸馏水进行 透析。透析24小时后，将透析物冻干以获得脱乙酰化的透明质酸粉末。

实施例4：脱乙酰化的透明质酸的制备

将浓度为100μL/mL的实施例2中制备的透明质酸脱乙酰酶加入到 溶解于50mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）的0.3%透明质酸（Fluka,#53747, Mw1,400kDa）溶液中，且在55°C恒温水槽中培养3小时，接着在100°C 下在加热板中加热2分钟。将反应混合物按1：5的比例与99%乙醇 （Merck,#1.00983.1011）混合以沉淀脱乙酰化的透明质酸。使用99%乙 醇洗涤沉淀物，并溶解于蒸馏水中，且用蒸馏水透析。透析24小时后， 将透析物冻干以获得脱乙酰化的透明质酸粉末。

比较实施例1：以化学方法制备脱乙酰化的透明质酸

将0.12g的透明质酸加入到6mL的水合肼中。将产生的2%（w/v） 混合物与0.06g的硫酸肼混合，并在55°C震荡反应72小时。反应结束 后，将10mL的冷冻乙醇加入到反应混合物中以产生沉淀物。使用乙醇 多次洗涤该沉淀物，并在真空中干燥24小时。将干燥的样品溶解于2mL 的5%醋酸溶液中，并与1.2mL的水性0.5M碘酸（HIO₃）混合，且在 4°C放置1小时或更长时间。然后，将0.35mL的水性57%HI加入到 反应溶液中，随后将其剧烈搅拌以产生深紫色溶液。将产生的溶液与3mL 的乙酸乙酯一起放置于分液漏斗中，并剧烈震荡几分钟，接着回收水层。 重复该分离过程直到水层的颜色完全消失。使用0.2M NaOH将回收的水 层的pH调整到7.0~7.5。添加乙醇以形成沉淀物，然后将沉淀物溶解于 蒸馏水中，并用蒸馏水透析。进行冻干以获得以化学方法脱乙酰化的透 明质酸粉末。

实验实施例2：测量透明质酸的脱乙酰化程度

由比色法测定脱乙酰化的透明质酸的脱乙酰化程度，该方法使用N- 乙酰-D-葡萄糖胺作为标准样品构建使用TNBS定量游离胺的校正曲线。 详细地，将在每个实施例3和4以及对比实施例1中制备的2~4mg的脱 乙酰化的透明质酸溶解于1.0mL的4%NaHCO₃溶液中（pH9.0），并 与1.0mL的0.05%TNBS（2,4,6-三硝基苯磺酸）混合。在40°C反应2小 时后，加入3.0mL的6M HCl。在60°C下反应90分钟，反应后将反应 混合物在室温充分放置，然后与5mL的蒸馏水混合。测量在345nm下 的吸光度以确定游离胺的水平。

结果在以下表3中总结。

表3

脱乙酰化的透明质酸 脱乙酰化的程度 实施例3 4.22 实施例4 10.6 比较实施例1 1.43

在表3中可看出，由脱乙酰酶脱乙酰化的透明质酸的脱乙酰化程度 高于以化学方法脱乙酰化的透明质酸。因此，使用酶解法能比化学方法 更有效地制备脱乙酰化的透明质酸。

实验实施例3：脱乙酰化的透明质酸的生物降解性分析

按照如下方式检测根据脱乙酰化程度的透明质酸的生物降解性。首 先，将在实施例4中制备的脱乙酰化的透明质酸溶解于柠檬酸盐缓冲液 （pH4.5），并尽可能迅速地将0.5%透明质酸与2单位/mL脱乙酰酶混 合。将混合物放置于流变仪的板上，在1Pa.s的剪应力下，在37°C测量 从1分钟到30分钟期间的粘度。

图6示出了脱乙酰酶降解脱乙酰化的透明质酸和未脱乙酰化的透明 质酸的速率。

在脱乙酰酶的存在条件下，如图6所示，脱乙酰化的透明质酸和未 脱乙酰化的透明质酸之间，在1到5分钟的初始期间的粘度的斜率存在 差异，这表明在体内的脱乙酰化的透明质酸的初始降解速率受延迟。

实验实施例4：通过凝胶电泳测量脱乙酰化的透明质酸的分子量

通过凝胶电泳测量以酶法或化学方法脱乙酰化的透明质酸的分子 量。在蛋白质电泳试剂盒的凝胶板中制备约2cm厚的，12%丙烯酰胺凝 胶[30%丙烯酰胺3.85mL、蒸馏水6.15mL、3%过硫酸铵0.5mL、TEMED 0.01mL]。分别地，将1.2%丙烯酰胺溶液（40mM Tris-醋酸盐2.425mL、 丙烯酰胺0.114g、双丙烯酰胺0.006g、6.4%β-二甲基氨基丙腈）预先 加热至60°C，并与0.75mL的3%过硫酸铵混合，且立即与2%琼脂糖溶 液混合。去除正丁醇后，将琼脂糖-丙烯酰胺混合物迅速地注入到凝胶板 的丙烯酰胺凝胶上并插入孔板定型梳子（well formers）。凝胶在约4~8°C 下完全凝固。将在实施例4中或比较实施例1中制备的未脱乙酰化的透 明质酸或脱乙酰化的透明质酸以1mg/mL的浓度溶解于40mM Tris-醋酸 盐缓冲液中（pH6.8），按1：4（v/v）的比例与染液（20%蔗糖，0.001% 溴苯酚）混合，并使用Hamilton注射器向每孔加载20μL的容量。在60 V下进行电泳，当染色液进入凝胶后将电压升高到120V。电泳结束后， 小心地从凝胶板上分离凝胶，并用染色剂染色，该染色剂通过将200mg 的甲苯胺蓝溶解至100mL的0.1M醋酸制备。20分钟后，在3%醋酸 （v/v）中使凝胶脱盐90分钟，并用水洗涤。

结果在图7中示出。

如图7所示，以酶法脱乙酰化的透明质酸（实施例4）与以化学方法 脱乙酰化的透明质酸（比较实施例1）相比，较小地降低了分子量，这表 明通过脱乙酰酶处理的透明质酸能在体内保持高分子量。

实验实施例5：脱乙酰化的透明质酸的粘度变化

按照以下方式检测以酶法或化学方法脱乙酰化的透明质酸的粘度。 首先，将在实施例4中制备的以酶法脱乙酰化的透明质酸（EnHyA）， 在比较实施例1中制备的以化学方法脱乙酰化的透明质酸（Chem-HyA）， 以及未脱乙酰化的透明质酸（HyA），分别溶解于蒸馏水中以获得3%的 溶液，将其转移至流变仪板。在1Pa.s的剪应力下，在37°C测量粘度。

结果在图8中示出。

从图8的流变图中可看出，以酶法脱乙酰化的透明质酸（实施例4） 与以化学方法脱乙酰化的透明质酸（比较实施例1）相比，明显地较小降 低了粘度，这表明使用脱乙酰酶能够制备出具有高粘度的脱乙酰化的透 明质酸。

实验实施例6：测量由于脱乙酰化的透明质酸和β-磷酸缩水甘油酯 的相互作用的粘弹性

将具有阳离子的游离胺基的脱乙酰化的透明质酸与阴离子的β-磷酸 缩水甘油酯混合，并且根据温度测量混合物的粘弹性以根据脱乙酰化比 较凝胶化，由此确定脱乙酰化的透明质酸作为水凝胶的适用性。为此， 水溶性45%β-磷酸缩水甘油酯溶液以1：1（v/v）的比例与包含0.7%未 脱乙酰化的透明质酸或在实施例4中制备的包含0.7%的脱乙酰化的透明 质酸水溶液均匀地混合。为了在形成水溶液期间避免未脱乙酰化的或脱 乙酰化的透明质酸的降解，并为了最小化在与水溶性β-磷酸缩水甘油酯 溶液混合期间有可能产生的凝胶化，在4°C下进行实验。将混合溶液转 移至流变仪板上，并在10Pa.s的剪应力条件下，在1Hz频率的振荡模 式，当温度每分钟上升1°C时测量粘弹性。弹性模量超过粘度模量时的 温度为胶凝点。

结果在图9中示出。

如图9所示，测量的脱乙酰化的透明质酸的胶凝点为约49.7°C，且 未脱乙酰化的透明质酸的胶凝点为约52.8°C，脱乙酰化的透明质酸的胶 凝点与未脱乙酰化的透明质酸相比减小了约3.1°C，这表明具有阳离子的 游离胺基的脱乙酰化的透明质酸通过与阴离子的β-葡萄糖醛酸的静电相 互作用更易于凝胶化。因此，本发明的脱乙酰化的透明质酸能够用作细 胞、基因以及药物的载体，或组织工程支架。

实验实施例7：脱乙酰化的透明质酸对壳聚糖/β-磷酸缩水甘油酯的 凝胶化的影响

在实验实施例6中，观察到脱乙酰化的透明质酸通过与β-磷酸缩水 甘油酯的静电相互作用促进了凝胶化。因此，为了检测脱乙酰化的透明 质酸对壳聚糖的凝胶化的影响进行如下实验，已知壳聚糖通过与β-磷酸 缩水甘油酯的相互作用凝胶化。

水溶性45%β-磷酸缩水甘油酯溶液以0.4：1（v/v）的比例，在水溶 液中与包含2.0%壳聚糖（脱乙酰化程度80%，Mw700kD，Fluka） 或实施例4中制备的2.0%脱乙酰化的透明质酸的水溶液均匀混合，并使 用流变仪测量粘弹性。关于这点，为了最小化在与β-磷酸缩水甘油酯溶 液的混合期间有可能产生的凝胶化，将反应混合物保持在4°C。将混合溶 液转移至流变仪板上，并在10Pa.s的剪应力条件下，在1Hz频率的振 荡模式，当温度每分钟上升1°C时测量粘弹性。

结果在图10中示出。

如图10所示，在缺乏脱乙酰化的透明质酸的条件下，在约42.2°C 下发生凝胶化(a)，在本发明的脱乙酰化的透明质酸的存在条件下，在约 33.1°C下发生凝胶化(b)。因此，本发明的脱乙酰化的透明质酸加速壳聚 糖的凝胶化。

实验实施例8：脱乙酰化的透明质酸的细胞相容性。

按如下方式分析本发明的脱乙酰化的透明质酸的细胞相容性。

将人骨髓间充质干细胞（hMSCs；源于骨髓，Lonza Walkersville,Inc., P=5）以3×10³细胞/100μL/孔的密度播种于96-孔板上，每个孔包含50μL 的MSCGM Bullet Kit培养基（产品编号：PT-3001,Lonza,Walkersville, MD USA），并且在5%CO₂培养箱中，在95%的相对湿度的条件下，在 37°C下进行培养，以允许细胞粘附于支架。培养24小时后，将包含浓度 为0.3%、0.6%、或0.9%的未脱乙酰化的透明质酸溶液或包含浓度为 0.3%、0.6%或0.9%的在实施例4中制备的脱乙酰化的透明质酸溶液加 入到每个孔中。培养细胞，每隔2天使用包含相同浓度的透明质酸的新 鲜培养基进行替换旧培养基。培养3天及6天后，从每个孔中去除培养 基，并向每个孔中加入500μL的细胞计数试剂盒-8染料[(2-(2-甲氧基-4- 硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑，单钠盐)， DOJINDO，日本]和培养基（1:9v/v）的混合物，接着在5%CO₂培养箱 中在37°C培养3小时。

在使用酶标仪（Molecular Devices,USA）在405nm测量吸光度之前， 将由于细胞计数试剂盒-8染料出现橙色的细胞培养物按照100μL/孔的 量加入到96-孔板中，从而根据透明质酸的浓度和培养时间分析人骨髓间 充质干细胞的增殖（n=4）。根据以下数学公式1计算细胞活性。在显微 镜下监控根据未脱乙酰化的或脱乙酰化的透明质酸的浓度的人骨髓间充 质干细胞的形态变化。

[数学公式1]

细胞活性(%)=[样品吸光度/对照的吸光度]×100

图11示出了根据未脱乙酰化的或脱乙酰化的透明质酸浓度的人骨髓 间充质干细胞的形态的显微图像。图12示出了根据未脱乙酰化的或脱乙 酰化的透明质酸浓度以及培养时间的人骨髓间充质干细胞的增殖。

如图11所示，在脱乙酰化的透明质酸和未脱乙酰化的透明质酸之间 不存在人骨髓间充质干细胞形态的显著性差异（24-孔板，P=5，1.8×10⁴细胞/mL/孔），这表明脱乙酰化的透明质酸是细胞相容的。

另外，如图12所示，人骨髓间充质干细胞的细胞活性随着未脱乙酰 化的透明质酸的浓度的增长而降低，该结果与Taichi Ito等表明的间皮细 胞在高浓度的透明质酸及化学当量的透明质酸下，其细胞存活率减小的 实验结果一致（Ito T,Fraser IP,Yeo Y,Highley CB,Bellas E,Kohane DS., Anti-inflammatory function of an in situ cross-linkable conjugate hydrogel  of hyaluronic acid and dexamethasone.Biomaterials.2007 Apr;28(10):1778-86）。然而，发现本发明的脱乙酰化的透明质酸对人骨 髓间充质干细胞的细胞活性几乎没有负面影响。因此，本发明的脱乙酰 化的透明质酸可以用作生物材料。

工业适用性

如上所述，根据本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物能够有效 地应用为生物材料，诸如细胞、基因及药物的载体，或组织工程支架。

序列自由文本

SEQ.ID.NO：1

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acacacatca tgctggagga agtgtacgaa cgagggttgc agcctacaac tgtcggaggt

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<110>    韩国原子力医学院

 

<120>    透明质酸的脱乙酰基水解酶、由脱乙酰基水解酶脱乙酰化的透明质酸及其衍生物

 

<130>    FP12KR1757

 

<160>    1

 

<170>    KopatentIn 1.71

 

<210>    1

<211>    750

<212>    DNA

<213>    人工序列

 

<220>

<223>    从构巢曲霉分离的透明质酸的脱乙酰基水解酶的基因序列

 

 

<400>    1

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