二(喹唑啉-4-基)二硒醚化合物的抗癌生物活性

摘要

本发明公开了一种抗肿瘤药物二(喹唑啉-4-基)二硒醚或其药学上可接受的盐，是由下列结构式表示的化合物。本发明介绍了以4-氯代喹唑啉、二硒化钠或二硒化钾或二硒化锂为原料，以无水乙醇为溶剂反应合成二(喹唑啉-4-基)二硒醚。本发明化合物或其药学上可接受的盐对治疗和预防各种良性或恶性肿瘤，特别是非小细胞肺癌和乳腺癌乳腺癌细胞有优异的增殖抑制效果，表现出良好的抗癌活性。

说明书

技术领域

本发明属于有机硒含氮杂环喹唑啉类药物，具体来说是抗肿瘤药物二(喹唑啉-4-基)二硒醚的抗癌生物活性。

背景技术

近年来大量研究资料表明，喹唑啉类化合物表现出良好的生物活性，特别是在抑制EGF受体及其酪氨酸激酶磷酸化方面尤为突出。每年有大量的文献、专利、论文等报道。在医药方面，如商品化的Iressa（ZD1839）、Tarceva（OSI-774）、PD153035、PD169414等对EGFR产生抑制作用，进而表现出抗癌活性，还具有抗疟、抗肿瘤和抗HIV活性。喹唑啉类小分子化合物能高选择性地与EGFR结合，并且是强效的酪氨酸激酶抑制剂，临床研究显示这类药物能使细胞停留在G₁期。农药方面，特别是喹唑啉肟醚类化合物具有抗烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）及其它植物病菌的活性。喹唑啉类化合物具有如此广泛的生物活性，引起了医药研究人员和化学工作者的极大兴趣。

硒是人体必须的微量元素，是多种酶的构成成分，在人体中起到抵御疾病、延缓衰老、增强机体免疫功能，从而达到平衡机体内环境的作用。硒具有广泛的生物学功能，是红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，可参与辅酶A和辅酶Q的合成，是体内抵抗有毒物质的保护剂，能促进淋巴细胞产生抗体，还是一种诱导剂可促使癌变早期紊乱的基因调节正常化。自上世纪70年代科学家发现硒具有抗肿瘤作用以来，其后的研究证实硒是乳腺癌、肝癌、皮肤癌、结肠癌和胃癌等的强有力抑制剂(Wei W Q, Abnet C C, Qiao Y L, et al. Am. J. Clin. Nutr., 2004, 79 (1), 80-85; Kellen E, Zeegers M, Buntinx F. Int. J. Urol., 2006, 13 (9), 11802-11804; Wu X-W, Yu Z-K. Tetrahedron Lett., 2010, 51 (11), 1500-1503)。硒化合物通过多种机制多靶点产生抗癌作用，有机硒同无机硒相比，具有生物利用度高、生物活性强、毒性低、环境污染小等特点。近年来合成的有机硒类化合物，如硒化壳聚糖、含硒蛋白、硒多糖、硒化蛋氨酸、硒化卡拉胶、硒化茶多酚等硒的小分子或生物大分子化合物在抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗衰老及提高机体免疫力等生物活性方面明显高于未经硒化的相应化合物。目前正在进行临床研究的代表性药物，如作为抗炎、抗氧化药物依布硒林(Ebselen)(Schewe T. Gen. Pharmacol-Vasc. S., 1995, 26 (6), 1153-1169; Azad G K, Balkrishna S J, Sathish N, et al. Biochem. Pharmacol., 2012, 83 (2), 296-303)和高效抗病毒、抗肿瘤药物硒唑呋喃(selenazofurin)(Franchetti P, Cappellacci L, Grifantini M, et al. Inosine Monophosphate Dehydrogenase, Chapter 11, pp 212–230, ACS Symposium Series, Vol. 839, 2003-03-03.; Sidwell R W, Huffman J H, Call E W, et al. Anti. Res., 1986, 6 (6), 343-353)。利用硒独特的化学和生物学性质来开发新的治疗药物已越来越引起科学家们的关注，合成生物活性高且毒性低的有机硒化合物仍旧是目前药物研究的一大热点(Ninomiya M, Garud D R, Koketsu M, et al. Coordin. Chem. Rev., 2011, 255 (23-24), 2968-2990; Plano D, Ibá?ez E, Palop J A, et al. Struct. Chem., 2011, 22 (6), 1233-1240; Terazawa R, Garud D R, Hamada N, et al. Bioorg. Med. Chem., 2010, 18 (19), 7001-7008; Bijian K, Zhang Z-W, Xu B, et al. Eur. J. Med. Chem., 2012, 48, 143-152)。

化学家对含有Se-Se 键的有机硒化合物表现出浓厚的兴趣，首先是因为这类化合物在有机合成的选择性方面具有高度专一性；再者，在一些重要的生物过程中，这类化合物是一种很重要的中间体。二硒醚类化合物一直是活性药物的研究热点之一，Fischer 等发现双 (邻氨甲酰基苯基) 二硒化物具有显著的抗氧化活性，并优于Ebselen（Fischer H, Dereu N, Kuhl P, et al. DE 3513071, 1986）。Wilson等发现二芳基二硒化物同样具有模拟GSH-Px的活性，并且发现在硒原子邻位引入铵盐基团，活性大大提高(Wilson S R, Zucker P A, Huang R R C, et al. J. Am. Chem. Soc., 1989, 111 (15) : 5936-5939.)。Galet等发现一些二芳基二硒化物在10^-5 mol/L浓度下对LTB₄及PGE₂合成的抑制率均高于50%，这表明这些化合物为5-脂氧酶和环氧酶双重抑制剂。当邻位氨基烷基化后对5-脂氧酶的抑制作用丧失，而当邻位氨基酰化后，则选择性抑制5-脂氧酶（Galet V, Bernier J L, Henichart J P, et al. J. Med. Chem., 1994, 37 (18): 2903-2911）。柯卫军等合成了二[ 22硝基24, 52(152冠25)苯基]二硒化合物，即含有活泼的基团NH₂，又含有活泼的Se-Se键，是有机合成中的重要的中间体，又是特殊的重要的配体（柯卫军，刘秀芳，徐汉生. 化学通报, 1998, (10): 27-28）。陈卫民等设计并合成了3,3’-(二硒双甲叉)双(5-羟基-6-甲基-4-吡啶甲醇)，以SRB法测试了子宫颈癌(Hela)和肝癌(Bel-7402)细胞株的抑制活性，在药剂浓度为10μmol/L时抑制率分别为72.23%和77.79%，表现出一定的抗肿瘤活性（陈卫民，曾陇梅，徐继红，等. 解放军药学学报，1999, 15(3): 14-17.）。Bhasin等设计并合成了一系列2,2’-二吡啶二硒醚类化合物，并进行了合成方法学的研究，制备了部分化合物的单晶（Bhasin K K, Singh J. J. Orgmetal. Chem., 2002, 658: 71-76）。Wang等应用相转移催化剂PEG-400一步法设计并合成了一系列取代二苯基二硒醚类化合物，拓展了二芳基二硒醚类化合物的合成方法（Wang  J X, Wang C H, Cui W F, et al. J.Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1994, 2341-2343）。美国专利US20020197304公开了一类6-8个碳的二烷基二硒醚类化合物，具有良好的抗癌活性（US20020197304，2002-12-26）。中国专利CN 102627614公开了一类二喹唑啉二硒醚类化合物的制备方法及抗癌活性，活性测试表明部分化合物对乳腺癌细胞MDA-MB-435有增殖抑制效果，表现出良好的抗癌活性（刘刚，刘春萍，徐胜广. CN 102627614, 2012-08-08）。此专利中不包括本专利申请的化合物二（喹唑啉-4-基）二硒醚。中国化学会第28届学术年会第6分会场摘要集中刘刚等人以邻氨基苯甲酸或取代邻氨基苯甲酸为起始原料，依次经过与甲酰胺无溶剂反应闭环、与三氯氧磷或氯化亚砜氯化、与二硒化钾反应二硒化合成了一系列喹唑啉二硒醚类化合物，目标化合物的活性测试在进行中（刘刚，马文泉，王兵，等. 中国化学会第28届学术年会第6分会场摘要集，2012.04.14）。

本专利申请所涉及的化合物二（喹唑啉-4-基）二硒醚为已知化合物，CAS号为87356-36-3，以4-氯喹唑啉为原料与硒氢化钠在四氢呋喃和乙醇混合溶剂中反应12小时得到，产率为50%，没有涉及活性测试 (Harjit S., Nageshwar M. Indian J. Chem. Sect. B. 1983, 22(4): 328-330)。

本发明研究发现化合物二（喹唑啉-4-基）二硒醚具有优良的抗癌活性，可能是由于喹唑啉环和二硒醚双重作用和不同作用位点的结果，在化合物降解过程中会产生硒醇或硒酚，也具有抗癌活性，使得活性提高或进一步维持。活性测试表明，在较低浓度下即可优于商品化的对照药剂，效果优异。

发明内容

一种用于抗肿瘤的药物，其特征是这种药物是二喹唑啉二硒醚类化合物，分子结构式如式（I）所示：

（I）。

以上所述的一种用于抗肿瘤的药物，可为一种药物组合物，其特征在于包含有效量的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，其用途是作为治疗和预防各种良性或恶性肿瘤，其中所述肿瘤包括前列腺癌、白血病、皮肤癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、淋巴癌、鼻咽癌、口腔癌、食管癌、大肠癌、结直肠癌，其中特别是指非小细胞肺癌和乳腺癌。

所述药物组合物，含有作为活性成分的至少式（I）化合物本身或其与一种或多种可药用的惰性无毒赋形剂或载体的混合物。

以上所述的一种用于抗肿瘤的药物，可为一种药物组合物，其特征在于包含有效量的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，其中所述药学上可接受的盐包括无机酸的盐，例如氢卤酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、硝酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，或者有机酸的盐，例如乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、草酸一氢盐、膦酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、苯甲酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、枸椽酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、咖啡酸盐、烟酸盐和2-氯烟酸盐。

本发明内容中，卤原子可为氟、氯、溴、碘原子。

本发明内容中，氢卤酸盐可为氢氟酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐原子。

以上所述的二（喹唑啉-4-基）二硒醚的制备方法，其特征在于以4-氯喹唑啉、二硒化钠或二硒化钾或二硒化锂为原料，以无水乙醇为溶剂反应合成：在制备好的二硒化钠或二硒化钾或二硒化锂的溶液中，回流温度下分批加入4-氯喹唑啉，回流反应过夜，冷却，用冰乙酸调体系pH值为5，反应液脱溶，用DMF-H₂O（V_DMF：V_H2O=2.5：1）重结晶，得橙红色固体0.46g，m.p.: 260-262℃，产率为44.2%。合成化学反应方程式如下：

。

附图说明

图1二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下作用A549 细胞48 h各周期分布流式细胞分析直方图。

具体实施方式

下面的实施示例将更好的说明本发明，但需要强调的是本发明决不仅限于这几个实施示例所表示的内容。

以下实施例显示了本发明的不同侧面，所给出的数据包括具体操作和反应条件及产物，产物纯度通过红外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、¹H-¹H COSY谱和质谱确证了其结构。

实施例1、二(喹唑啉-4-基)二硒醚的合成。

在装有回流冷凝管、温度计的三口烧瓶中，向制备好的0.51g (2.5mmol) Na₂Se₂的乙醇溶液中分批加入0.83g (5.0mmol) 4-氯喹唑啉，约1小时加完，继续回流反应17小时，冷却，用冰乙酸调体系pH值为5，反应液脱溶，用DMF-H₂O（V_DMF：V_H2O=2.5：1）重结晶，得橙红色固体0.46g，m.p.: 260-262℃，产率为44.2%。IR (KBr) v: 3140.8, 3055.6 (v_Ar-H), 1617.2-1466.4 (quinazoline skeleton vibration), 838.2 (δ_Ar-H) cm^-1. ¹H NMR (DMSO-d₆, 600 MHz) δ: 8.61 (t, J=7.8Hz, 2H, quinazoline H-7), 8.21 (t, J=7.8Hz, 2H, quinazoline H-6), 7.99 (d, J=8.4Hz, 2H, quinazoline H-5), 7.76 (d, J=8.4Hz, 2H, quinazoline H-8), 7.66 (s, 2H, quinazoline H-2). ¹³C NMR (DMSO-d₆, 150 MHz) δ: 127.6 (quinazoline C-5), 129.5 (quinazoline C-6), 132.4 (quinazoline C-8), 136.3 (quinazoline C-7), 143.9 (quinazoline C-10), 144.7 (quinazoline C-9), 154.2 (quinazoline C-2), 162.8 (quinazoline C-4). EIMS: m/z 120.2 , 163.3 , 207.4 ，274.8，327.7 ,417.9 , 420.0。¹H-¹H COSY谱分析得知，喹唑啉环上5-位氢与6-位氢相关，7-位氢与8-位氢相关。

实施例2、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖抑制测定。

试验方法：将药物用DMSO溶解配制成各个浓度，每浓度重复三次；将MDA-MB-435细胞消化后制成悬浮液4×10⁴个/ mL，取10 mL加至一大培养皿中，待24小时贴壁后，加药处理；24小时后随机取2皿拍照，记录细胞状态；吸出原培养基换含药培养基（10％FBS 1640）处理72小时；加1.5 mL胰酶，消化4分钟后加原含药培养基终止消化，打匀，计数细胞数目，取平均值，计算抑制率。

试验结果：经测试，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为10μmol/L时对MDA-MB-435细胞增殖抑制率达到99.69±0.18%，比阳性对照药物奥沙利铂效果好得多，表现出极高的抗癌活性。P₁=0（注：P₁为同一化合物不同浓度对MDA-MB-435抑制率差异性分析，P₁＜0.05为显著性差异）；P₂=0（注：P₂为不同化合物在设定浓度下对MDA-MB-435抑制率与阴性对照组（DMSO）抑制率差异性分析，P₂＜0.05为显著性差异）。

实施例3、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人乳腺癌细胞MDA-MB-435作用12、36、72小时的形态学影响。

试验方法：将测试细胞分组分别用DMSO（阴性对照）、奥沙利铂（阳性对照）、式（I）化合物药剂处理后，置于96孔板中，在药剂浓度为1μmol/L、10μmol/L下，药剂作用12小时、36小时、72小时，使用倒置显微镜100倍放大观测细胞形态的变化。

试验结果：从形态学的观察可以看出，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为10μmol/L时对MDA-MB-435细胞，在作用12、36、72小时后，细胞形态发生明显变化，比阳性对照药物奥沙利铂的变化还要显著，表现出极高的抗癌活性。

实施例4、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人乳腺癌细胞MDA-MB-435作用36小时的细胞毒作用。

试验方法：用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将MDA-MB-435细胞调整到每孔4.8 × 10⁴测试细胞（共1.6 mL），加入到96孔板中，每孔加100 μL，3个效应细胞自然释放对照孔不加MDA-MB-435细胞，只加100μL培养液。向各孔加100 μL效应细胞，自然释放孔不加效应细胞只加100μL培养液，最大释放孔中加100 μL 1％ NP40。每个实验置三个复孔。置37℃5％ CO₂的二氧化碳培养箱中培养24小时。离心培养板200×g 10分钟。每孔吸出150 μL上清液，对应加入另一块96孔酶联检测板中。向第二块板每孔依次加20 μL 0.4mol/L乳酸溶液、20 μL 4mmol/L 2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑，20 μL反应液（含0.03％ BSA，2.7U/ml硫辛酰胺脱氢酶，4.5mmol/L氢化型辅酶I（NAD^＋），1.2％蔗糖的PBS），室温中放置20分钟。在酶联检测仪上测定各孔的光密度（OD值），检测波长570nm。LDH稀释法测定细胞毒作用的计算公式如下：

细胞毒（％）＝[（OD实验组－OD总自然释放）/（OD最大释放组－OD总自然释放）]×100％。

试验结果：二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下对MDA-MB-435作用36小时的细胞毒作用见表1。可以看出，二(喹唑啉-4-基)二硒醚虽然与自然释放相比毒性较大，但是与完全释放相比较在一定的浓度下毒性仍然很小。

表1 二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下对MDA-MB-435作用36小时的细胞毒作用。

注：P₁为化合物不同浓度对MDA-MB-435细胞毒作用与自然释放组（DMSO）差异性分析；P₂化合物在设定浓度下对MDA-MB-435细胞毒作用与完全释放组（1/100）差异性分析；P＜0.05为显著性差异。

实施例5、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人宫颈癌细胞Hela的增殖抑制测定。

试验方法同实施例2中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为Hela细胞。

试验结果：经测试，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为1μmol/L时对Hela细胞增殖抑制率达到23.13±2.07%，药剂浓度为10μmol/L时对Hela细胞增殖抑制率达到94.24±2.1%，比阳性对照药物奥沙利铂（1μmol/L浓度时抑制率为-0.45±6.35%；10μmol/L浓度时抑制率为35.63±4.71%）效果好得多，表现出极高的抗癌活性。P₂=0.17（1μmol/L）；P₂=0（10μmol/L）（注：P₂为不同化合物在设定浓度下对Hela抑制率与阴性对照组（DMSO）抑制率差异性分析，P₂＜0.05为显著性差异）。

实施例6、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人宫颈癌细胞Hela作用72小时的形态学影响。

试验方法同实施例3中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为Hela细胞，作用时间为72小时。

试验结果：从形态学的观察可以看出，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为1μmol/L和10μmol/L时对Hela细胞，在作用72小时后，细胞形态发生明显变化，比阳性对照药物奥沙利铂的变化还要显著，特别是在低浓度1μmol/L条件下表现出极高的抗癌活性。

实施例7、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人宫颈癌细胞Hela作用24小时的细胞毒作用。

试验方法同实施例4中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为Hela细胞，作用时间为24小时。

试验结果：二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下对Hela作用24小时的细胞毒作用见表2。可以看出，阳性对照药剂羟基喜树碱和紫杉醇对目标细胞毒性均较大，而二(喹唑啉-4-基)二硒醚对目标肿瘤有细胞毒性小。而前期的实验已经表明二(喹唑啉-4-基)二硒醚对目标细胞抑制率很高，这说明这种抑制活性不是通过细胞毒作用实现，结合形态观察可能是通过抑制细胞增殖和诱导凋亡实现的，所以此化合物极有可能成为潜在的抗肿瘤药物候选开发靶标化合物。

表2 二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下对Hela作用24小时的细胞毒作用。

注：P₁为化合物不同浓度对Hela细胞毒作用与自然释放组（DMSO）差异性分析；P₂化合物在设定浓度下对Hela细胞毒作用与完全释放组（1/100）差异性分析；P＜0.05为显著性差异。

实施例8、二(喹唑啉-4-基)二硒醚在不同浓度下对人宫颈癌细胞Hela作用24小时的形态学影响。

试验方法同实施例3中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为Hela细胞，作用时间为24小时。

试验结果：从形态学的观察可以看出，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度从1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L依次升高到40μmol/L时，对Hela细胞作用24小时后，细胞形态发生明显变化，比阳性对照药物羟基喜树碱的变化要显著，和阳性对照药物紫杉醇有一定的可比性，整体表现出极高的抗癌活性。

实施例9、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人宫颈癌细胞Siha的增殖抑制测定。

试验方法同实施例2中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为Siha细胞。

试验结果：经测试，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为1μmol/L时对Siha细胞增殖抑制率达到24.37±10.4%，药剂浓度为10μmol/L时对Siha细胞增殖抑制率达到92.63±1.38%，比阳性对照药物奥沙利铂（1μmol/L浓度时抑制率为28.05±4.28%；10μmol/L浓度时抑制率为61.51±2.99%）效果好得多，表现出极高的抗癌活性。P₂=0.024（1μmol/L）；P₂=0（10μmol/L）（注：P₂为不同化合物在设定浓度下对Siha抑制率与阴性对照组（DMSO）抑制率差异性分析，P₂＜0.05为显著性差异）。

实施例10、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人宫颈癌细胞Siha作用96小时的形态学影响。

试验方法同实施例3中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为Siha细胞，作用时间为96小时。

试验结果：从形态学的观察可以看出，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为1μmol/L和10μmol/L时对Siha细胞，在作用96小时后，细胞形态发生明显变化，比阳性对照药物奥沙利铂的变化还要显著，特别是在浓度10μmol/L条件下表现出极高的抗癌活性。

实施例11、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人肺癌细胞A549的增殖抑制测定。

试验方法同实施例2中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为A549细胞。

试验结果：经测试，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为1μmol/L时对A549细胞增殖抑制率达到40.39±3.59%，药剂浓度为10μmol/L时对A549细胞增殖抑制率达到98.32±0.57%，比阳性对照药物奥沙利铂（1μmol/L浓度时抑制率为16.48±3.46%；10μmol/L浓度时抑制率为39.76±2.71%）效果好得多，与阳性对照药物表柔比星（1μmol/L浓度时抑制率为50.95±1.79%；10μmol/L浓度时抑制率为100±0.21%）效果差不多，表现出极高的抗癌活性。P₂=0（1μmol/L）；P₂=0（10μmol/L）（注：P₂为不同化合物在设定浓度下对A549抑制率与阴性对照组（DMSO）抑制率差异性分析，P₂＜0.05为显著性差异）。二(喹唑啉-4-基)二硒醚在低浓度下（1μmol/L）抑制率比阳性对照药剂紫杉醇要差，但在较高浓度下（10μmol/L）抑制率与阳性对照药剂紫杉醇相当。二(喹唑啉-4-基)二硒醚在低浓度下（1μmol/L）抑制率比阳性对照药剂羟基喜树碱要差一些，但在较高浓度下（10μmol/L）抑制率比阳性对照药剂羟基喜树碱要高。

实施例12、二(喹唑啉-4-基)二硒醚对人肺癌细胞A549作用96小时的形态学影响。

试验方法同实施例3中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为A549细胞，作用时间为96小时。

试验结果：从形态学的观察可以看出，二(喹唑啉-4-基)二硒醚药剂浓度为1μmol/L和10μmol/L时对A549细胞，在作用96小时后，细胞形态发生明显变化，比阳性对照药物奥沙利铂的变化要显著，比其它的阳性对照药物表柔比星、羟基喜树碱和紫杉醇有不同的细胞形态变化。

实施例13、二(喹唑啉-4-基)二硒醚在不同时间和浓度下对人肺癌细胞A549的增殖抑制测定。

试验方法同实施例2中的试验方法，仅将MDA-MB-435细胞换为A549细胞。

表3 二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下对 A549 细胞在24-96小时内的体外抑制活性和 IC₅₀。

注：* DMSO为阴性对照，P <0.01。

试验结果：从表3可以看出，当式（I）化合物浓度大于5μmol/L，作用时间大于72小时后，药物对靶标细胞A549表现出显著的体外抑制活性，且各浓度点随着作用时间延长，抑制活性显著提高，而以后各浓度点间的抑制活性变化不大，这说明该化合物对靶标细胞的抑制活性主要表现为时间依赖型，且这个起效点为5μmol/L；另外式（I）化合物对A549作用48小时，药剂浓度大于10μmol/L以后的各剂量表现出对靶标细胞的抑制活性，这更进一步说明药物药效主要为时间依赖型。通过对各时间段IC₅₀的测定分析，发现随着药物作用时间的延长，IC₅₀值逐渐减小，说明该药物对靶标细胞抑制活性表现出时间依赖型。随着式（I）化合物药剂浓度的提高，它对靶标细胞A549的抑制作用增强；随着作用时间的延长，式（I）化合物各点的抑制活性也相应提高，表明式（I）化合物对A549的抑制模式为时间和浓度依赖型。

实施例14、二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下作用A549 细胞48 h各周期分布流式细胞分析。

试验方法应用通用的流式细胞分析检测方法。

试验结果：分析图1结果可知，随着药物浓度的提高至20μmol/L 浓度，G₂/M期细胞比例大幅下降，从正常细胞的40%下降到12%，而同时G₁或S 期细胞在小于20μmol/L浓度的样品组变化不明显，从正常比例的53.8%下降到40.8%，伴随此变化的是，当药物浓度达到10μmol/L，亚二倍体峰不断增大，整个峰型变化是向左平移；当药物浓度达到40μmol/L，亚二倍体细胞比例从正常的5.8%上升到89.4%；G₁或S 期细胞、G₂/M期细胞比例分别从正常的53.8%、40%下降到8.9%和2.2%，这说明药物抑制了细胞增殖，并最终使细胞走向凋亡，且该药物主要是使细胞周期停留G₁或S 期。这个结果初步解释了前期药物体外对该细胞的浓度和时间抑制活性实验的结果，推断该药物可能通过抑制细胞增殖，使细胞进入G₁/G₀期。

图1 二(喹唑啉-4-基)二硒醚在设定浓度下作用A549 细胞48 h各周期分布流式细胞分析直方图。