一株生防内生放线菌——盐屋链霉菌

摘要

本发明涉及微生物技术领域，本发明所述的枸骨内生菌是从浙江杭州采集的枸骨植物活体中采用内生菌微生物分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)，定名为盐屋链霉菌107。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC No.6984。本发明最显著的特征是该菌株液体发酵能够产生对植物真菌病害病原菌如黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)和水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)等有抑制作用的活性代谢产物，是农业上重要的微生物资源。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及生防内生放线菌——盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)的培养及其代谢产物的应用。 

背景技术

植物体内都存在大量的内生菌，内生菌最早发现于牧草，后来又在木本植物、草本植物、禾本植物、苔藓、地衣、海藻等植物中被发现。迄今的研究表明，植物内生菌可增强宿主的抗病性、提高植物的生产力、抗逆抗虫等。发挥这些作用是由于内生菌在植物体内繁殖和生长，并在体内产生有生物活性的次生代谢产物。因此，内生菌可能成为生物防治中有潜力的生物控制剂，在生态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。近年来植物内生菌已引起了微生物学家、生态学家、植物保护学家的广泛兴趣，逐渐成为国内外研究的热点。目前微生物源农药的研究和开发在我国十分活跃，但微生物资源及其应用潜力尚没有得到充分的发挥，而植物内生菌即是这样一类有待开发的新兴微生物资源。 

目前对植物病害的防治，主要采用化学农药杀灭病原菌，但化学农药对人畜的毒副作用和残留问题至今仍难以有效的解决。利用内生菌产生的抗病原真菌的活性物质进行植物病原真菌病害的生物防治，则具有周期短、易于研究、便于生产和低毒等优点。 

本发明从枸骨中分离到一株生防内生放线菌，并对该菌株发酵代谢产物进行了抑菌作用研究。该发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。 

发明内容

本发明的目的是针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的不足，提供一株从枸骨中分离筛选出的内生放线菌——盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)；本发明的另一目的是提供利用该菌株代谢产物防治植物真菌病害的方法。 

本发明盐屋链霉菌的分离、筛选与鉴定： 

是于2012年7月在浙江杭州采集的枸骨茎中，经分离、纯化、培养、发酵和活性测定 等步骤获得并保存；经微生物分类学鉴定为盐屋链霉菌(Streptomyces sioyaensis)，定名为盐屋链霉菌107。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC No.6984。 

盐屋链霉菌107，显微形态特征：孢子丝直、螺旋形，孢子长圆或椭圆形。 

本发明所述的盐屋链霉菌107，经发酵提取可获得对部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代谢产物。 

本发明目的通过以下技术方案来实现： 

一种防治水稻纹枯病、黄瓜立枯病、番茄灰霉病、黄瓜枯萎病或西瓜枯萎病等植物真菌病害微生物代谢产物的制备方法，按以下步骤进行： 

(1)菌种的活化培养：将分离保存的盐屋链霉菌107菌种移至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面平板上，在28℃±1℃条件下培养至试管斜面长满孢子，供接种用； 

(2)发酵培养：发酵培养液为每1000mL中含有黄豆饼粉20g，玉米粉15g，麸皮10g，蛋白胨5g，(NH₄)₂SO₄5g，CaCO₃5g，MgSO₄10g，每300mL三角瓶装发酵培养液60mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取一铂金环盐屋链霉菌107孢子接种，在28℃±1℃条件下，摇床转速180转/分钟，发酵培养128h； 

(3)发酵物提取：发酵完毕，离心收集发酵上清液，用常规有机溶剂萃取经真空浓缩后获得浸膏，用于抑菌活性测定。 

本发明的有益效果： 

一是本发明从植物枸骨茎中分离筛选出代谢物对部分植物真菌病害病原菌具有较强抑制作用的盐屋链霉菌107，这为农业上防治植物真菌病害病原菌提供了一株微生物菌株； 

二是本发明提供了利用盐屋链霉菌107发酵获得活性代谢产物的方法；该代谢产物可应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。 

具体实施方式

实施例1：(盐屋链霉菌107的分离与筛选) 

本发明于2012年7月在浙江杭州采集枸骨茎，经表面消毒、内生菌分离、培养、发酵、活性测定以及对抑制植物真菌病害病原菌活性菌株的筛选等步骤，从中获得盐屋链霉菌107，保存。 

盐屋链霉菌107抑菌活性测定：取经0.22μm膜过滤的发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)或黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen)或黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)或西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)或番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等供试菌菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 

测定结果表明：盐屋链霉菌107代谢产物对水稻纹枯病菌、黄瓜立枯病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制率分别为91.5％、88.5％、82.5％、86.4和86.1％。 

实施例2：(盐屋链霉菌107发酵代谢产物的制备方法) 

按以下步骤进行： 

(1)菌种的活化培养：将分离保存的盐屋链霉菌107菌种移至马铃薯葡萄糖PDA固体平板上，在28℃±1℃条件下培养至试管斜面长满孢子，供接种用； 

(2)发酵培养：发酵培养液为每1000mL中含有黄豆饼粉20g，玉米粉15g，麸皮10g，蛋白胨5g，(NH₄)₂SO₄5g，CaCO₃5g，MgSO₄10g，每300mL三角瓶装发酵培养液60mL；配制后121℃灭菌20min，待冷却至40℃在无菌条件下挑取一铂金环盐屋链霉菌107孢子接种，在28℃±1℃条件下，摇床转速180转/分钟，发酵培养128h； 

(3)发酵物提取：发酵完毕后离心收集发酵液，加入等体积乙酸乙酯萃取，取下层，再用等体积正丁醇萃取，取上层，在真空条件下浓缩至浸膏，得正丁醇萃取物，供抑菌活性测定。 

以下实施例3、4中所述的盐屋链霉菌107代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量/体积百分比。 

实施例3：(盐屋链霉菌107代谢产物对水稻纹枯病菌、黄瓜立枯病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制作用) 

(1)准确称取盐屋链霉菌107代谢产物0.20g，并加入10mL体积的无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置成浓度为20g/L的母液； 

(2)抑菌活性测定：取上述母液分别稀释成浓度为2g/L和1g/L的溶液，取各浓度溶液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀(盐屋链霉菌107代谢产物终浓度为200mg/L和100mg/L)，冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的水稻纹枯病菌或黄瓜立枯病菌或番茄灰霉病菌或黄瓜枯萎病菌或西瓜枯萎病菌的菌饼，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养36h，以常规化学药剂和无菌水处理作为 对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 

试验例：(本发明产品与常规农药防治效果对比试验) 

试验结果见表1。从表1看出，盐屋链霉菌107代谢产物抑制效果较常规化学药剂相仿或略优，且安全。 

表1盐屋链霉菌107代谢产物对供试病原真菌的抑制效果 

“-”表示未试验。