假黄单胞菌及其在降解烟碱类杀虫剂吡虫啉中的应用

摘要

本发明公开了一种降解烟碱类杀虫剂吡虫啉的假黄单胞菌

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648及其应用于烟碱类杀虫剂吡虫啉的降解及其羟基化。 

背景技术

吡虫啉（Imidacloprid，IMI）是一种高效安全、高选择性的含氮杂环类杀虫剂，其作用于昆虫烟碱乙酰胆碱受体，具有触杀、胃毒和内吸活性。IMI已广泛用于刺吸式口器害虫如蚜虫和叶蝉及鞘翅目害虫防治，用于建筑防治白蚁和防治猫和狗等宠物身上的跳蚤等。目前，IMI已在全球120个国家登记，在140多种作物上使用。自20世纪90年代以来,IMI已成为我国主要农药品种,主要用于防治水稻褐飞虱、蚜虫等害虫。 

越来越多的报道显示，IMI在土壤中有残留，其降解半衰期超过100d。同时，随着害虫对IMI抗性的增加，IMI的使用剂量呈现不断增加的趋势，因而IMI的环境的风险性也在不断增加。IMI通过以下3条途径在环境中降解：(1)氧化咪唑环烷环，生成5-羟基吡虫啉(5-hydroxyl IMI)，然后脱水转变成烯式吡虫啉（olefin IMI）；(2)还原硝基基团为亚硝基吡虫啉(nitrosimine IMI)，水解nitrosimine基团变成胍基吡虫啉(guanidine IMI)，然后进一步氧化生成羰基吡虫啉(urea IMI)；(3)氧化断裂吡虫啉亚甲基桥途径，生成6-氯烟酸。由于olefin IMI对桃蚜与棉蚜的杀虫效果是IMI的16倍，因而IMI羟基化途径受到研究者的广泛关注，IMI经由5-hydroxy IMI和olefin IMI途径代谢，甚至可提高IMI的对蚕豆蚜的生物活性（Liu et al.2011）。 

微生物降解法是有机污染物降解的最有效的方法之一。申请人筛选到一株可降解IMI的假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica，该菌株已由申请人提交并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC6648。Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648菌株降解IMI的主要途径为羟基化IMI生成5-hydroxy IMI。在静息细胞转化液中添加糖或有机酸可加速IMI的降解和促进IMI的羟基化。申请人也曾申请嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788羟基化IMI的发明专利（专利号：ZL200310106283.X）。与Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788相比，Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648具有更高的IMI的降解和羟基化能力。 

发明内容

本发明的目的是提供一种可降解烟碱类杀虫剂IMI的细菌菌株及其在IMI生物降解和羟基化中的应用，本发明示意图如图1所示。 

本发明所提供的菌株为一种假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC6648。 

本发明所提供的假黄单胞菌CGMCC6648具降解烟碱类杀虫剂IMI的能力；其降解IMI过程中，产生主要代谢产物5-hydroxy IMI；产物的液相色评质谱联用分析如图2所示。 

本发明所提供的假黄单胞菌CGMCC6648降解IMI的方法为：将假黄单胞菌CGMCC6648在营养培养液中振荡培养24h，离心收集和洗涤菌体；将菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，并加入10mmol/L的糖或有机酸盐以及500mg/L吡虫啉，上述悬浮液分装于体积为50ml的离心管中，每根离心管中分装1-10ml悬浮液；上述悬浮液于220rpm的摇床中30℃振荡培养。培养48h，假黄单胞菌CGMCC6648可降解1-43%的IMI，并生成0.015-0.67mmol/L的5-hydroxy IMI。 

在假黄单胞菌CGMCC6648静息细胞的悬浮液中添加糖或有机酸盐，能有效地促进假黄单胞菌CGMCC6648降解IMI及其羟基化活性（图4、图6）。 

附图说明

图1假黄单胞菌CGMCC6648代谢IMI的羟基化途径。 

图2假黄单胞菌CGMCC6648代谢IMI的产物质谱图。 

图3假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中未添加糖和有机酸的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图4假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L葡萄糖的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图5嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC1.1788在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L葡萄糖的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图6假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L乳糖的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图7假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L丙酮酸钠的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图8假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L琥珀酸钠的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图9假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L苹果酸钠的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图10假黄单胞菌CGMCC6648在1ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L葡萄糖的条件下代谢IMI的HPLC图。 

图11假黄单胞菌CGMCC6648在10ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L葡萄糖的条件下代谢IMI的HPLC图。 

具体实施方式

实例一：可生物降解IMI的菌株分离筛选、鉴定和生物学特性 

1、菌株分离 

从江苏省南京市仙林地区采集土壤，取2g土壤加入含5颗玻璃珠的18mL无菌水中，振荡10min，静置5min后，取1ml悬液加入19ml含200mg/LIMI的矿物盐培养基中。矿物盐培养基的组成为：1.36g/LKH₂PO₄，2.13gL Na₂HPO₄，0.5gL MgSO₄·7H₂O和10ml/L金属离子液，pH7.5。金属离子液组成为：0.40gL CaCl₂·2H₂O,0.30g/L H₃BO₃,0.04gL CuSO₄·5H₂O,0.10g/L KI,0.20g/L FeSO₄·7H₂O，0.40g/LMnSO₄·7H₂O，0.20g/LNaMoO₄·2H₂O和10.0mL/L浓盐酸。样品于30℃、转速为220rpm的摇床中培养一个月。取100μl样品稀释到10^-3和10^-4后，涂布LB平板。LB培养基组成为（g/L）：蛋白胨10、酵母膏5、NaCl10，pH7.2。从LB平板挑取形态不同的单菌落划线至LB平板上，30℃培养3-6天后，再次进行菌种平板划线纯化。总共获得9株形态各异的细菌。 

2、菌株降解IMI能力的测定 

接种上述纯化菌种至含20mL LB液体培养基的100mL三角瓶中，30℃培养24h后离心收集细胞。细胞悬浮于含200mg/L IMI的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中（pH7.5），安捷伦1200型HPLC仪分析检测IMI含量变化。HPLC条件为：流动相为25%乙腈和75%的去离子水，流速为1ml/min；HPLC柱为安捷伦HC-C18反相柱（4.6×250mm，5μm），柱温为30℃；检测波长为269nm。在上述条件下，命名为Z-9的菌株具有可将IMI转化为一种极性更大的产物，该产物的HPLC保留时间与5-羟基吡虫啉（5-hydroxy IMI）相同，液相色谱质谱联用分析仪检测该产物的分子量为271(m+H272)，与5-hydroxy IMI分子量一致（图2）。上述结果表明Z-9菌株可羟基化IMI生成5-hydroxy IMI。 

3、Z-9菌株的鉴定及生物学特性 

在LB固体培养基上，Z-9菌落呈米黄色、半透明、光滑、有粘液、凸起、边缘规整。革兰氏阴性。显微镜观察，Z-9菌体呈椭圆状，大小为0.5-0.7×1.3-1.5μm。无鞭毛，无芽孢。 

采用16S rRNA基因序列分析进行Z-9菌株的分类学鉴定。从含LB固体培养基上用无菌牙签挑取Z-9单菌落接种于装有20mLLB液体培养基的100mL三角瓶中，于30℃、220rpm的摇床中培养16h。发酵液于13000rpm离心5min后收集菌体，采用TaKaRa公司的MiniBEST细菌基因组提取试剂盒提取Z-9菌株的基因组DNA。采用16S rRNA基因扩增通用引物K1和K2扩增Z-9菌株的16S rRNA基因。K1引物序列为：5′-AACTGAAGAGTTTGATCC-3′（SEQ ID No：1），K2引物序列为：5′-TAGGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3′（SEQ ID No：2）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR扩增条件为：94℃预变性5min后，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸10min。所得序列由生工生物工程（上海）有限公司测序后，得到的部分16S rRNA基因序列（SEQ ID No：3）在美国国家生物技术信息中心的Genbank数据库中进行blast搜索。比对结果表明Z-9 菌株与假黄单胞菌属Pseudoxanthomonas indica亲缘关系最近，相似性达到100%。Z-9菌株于2012年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，（北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分类命名为假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica，保藏编号为CGMCC6648。 

实施例二： 

将-80°C保藏的Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648划线于LB固体培养基上，于30°C培养箱中培养。挑取单菌落，接种于含25mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养24h。以1%的接种量接入含100mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，30℃，220rpm下振荡培养12h，当OD₆₀₀值达到5时，取10ml菌液于4℃，8000rpm离心5min，收集菌体。菌体用磷酸盐缓冲液（0.2mol/LNa₂HPO₄/KH₂PO₄，pH7.5）洗涤两次后，悬浮于用10mL含500mgL的IMI磷酸盐缓冲液。取2ml上述转化反应液，分装在三个50ml的离心管里，每管各装2ml，于30℃，220rpm摇床振荡培养48h。HPLC分析(图3)IMI的降解量和5-hydroxy IMI的生成量，结果显示IMI减少了0.09mmol/L，同时生成0.02mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为5.4%。 

实施例三： 

与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了100mmol/L的葡萄糖，HPLC分析（图4）结果显示，IMI减少了0.66mmol/L，同时生成0.59mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为43.6%。上述结果表明葡萄糖可极大地促进IMI的降解和5-hydroxy IMI的生成。 

在相同的培养和转化条件下，以嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788替代假黄单胞菌属CGMCC6648，HPLC分析（图5）结果显示IMI减少了0.48mmol/L，同时生成了0.40mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为28.2%。上述结果表明，Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648具有比嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC1.1788高得多的IMI降解和羟基化能力。 

实施例四： 

与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了100mmol/L的乳糖，HPLC分析（图6）结果显示，结果显示IMI减少了0.77mmol/L，同时生成0.67mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为43.1%。上述结果表明乳糖可极大地促进IMI的降解和5-hydroxy IMI的生成。 

实施例五： 

与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了100mmol/L的丙酮酸钠，HPLC分析（图7），结果显示IMI减少了0.62mmol/L，同时生成0.61mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为35.8%。上述结果表明丙酮酸盐也能加速IMI的降解和5-hydroxy IMI的生成。 

实施例六： 

与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了100mmol/L的琥珀酸钠，HPLC分析（图8），结果显示IMI减少了0.174mmol/L，同时生成0.048mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为10.39%。 

实施例七： 

与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了100mmol/L的苹果酸钠，HPLC分析（图9），结果显示IMI减少了0.39mmol/L，同时生成0.16mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为23.0%。 

实施例八： 

与实例三基本相同，只是转化液的体积由2ml缩小为1ml。HPLC分析（图10），结果显示IMI减少了0.71mmol/L，同时生成0.67mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率为43.5%。 

实施例九： 

与实例三基本相同，只是转化液的体积由2ml增加为10ml。HPLC分析（图11）结果显示，结果显示IMI减少了0.016mmol/L，同时生成0.015mmol/L的5-hydroxy IMI，IMI的降解率仅为1.0%。上述结果表明通气量影响5-hydroxy IMI的生成和IMI的降解。