一种干酪乳杆菌发酵液在饲料中的应用

摘要

本发明涉及一种干酪乳杆菌发酵液在饲料中的应用，所述干酪乳杆菌，保藏名称为干酪乳杆菌lyT-7，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010197。将10吨规模发酵获得的干酪乳杆菌发酵液，通过喷雾干燥并经加入脱毒后的油菜饼制成含干酪乳杆菌菌数10

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术和饲料领域，具体涉及一种干酪乳杆菌在饲料中的应用。

背景技术

抗生素被广泛用作饲料添加剂，然而抗生素作为饲料添加剂产生的细菌耐药性和药物残留等问题，会对人类健康造成危害。因此，研究有效的抗生素饲料添加剂替代产品日益受到重视。

抗菌肽分子量小、热稳定性强。一方面，抗菌肽可以耐受饲料制粒时的高温； 另一方面，在规模化发酵生产时经高温浓缩工序，可充分杀灭杂菌体而不导致抗菌肽失活，并且，产品在推广应用后不会出现因工程菌的扩散所导致的环境生态问题。同时，因抗菌肽分子量较小，不易具有免疫原性。鉴于抗菌肽这些优点，对其研究开发已成为目前世界上研究抗生素替代品的前沿性课题。

目前，国内作为添加剂生产应用的主要是蚕抗菌肽AD——酵母制剂。大多数的畜禽试验也是围绕这种抗菌肽进行的。相关文献报道有：1、“抗菌肽制剂代替抗生素在断奶仔猪饲粮中的应用效果”（《中国饲料》2001年第18期13-14页），通过在断奶仔猪的饲料中用抗菌肽代替抗生素，对仔猪的腹泻、生产性能等作了比较。结果表明，抗菌肽在仔猪断奶应激期间抗腹泻效果不比抗生素差。适量的抗菌肽比抗生素促生长的效果要好，但高剂量的抗菌肽则降低了仔猪的生长。2、“抗菌肽与抗生素饲喂肉鸡的效果比较”（《广东饲料》2004年第02期），发现抗菌肽对肉鸡有促进生长和提高免疫力作用。与中草药抗生素相比，在出栏率、平均体重、饲料效率等方面均无显著性差异，且在出栏前4天停喂，抽检无残留。3、“蚕抗菌肽AD-酵母制剂对粤黄鸡肠道消化酶和饲料品质的影响”（《中国家禽》2004年第7期 ）通过饮水方式给粤黄鸡添加抗菌肽的饲养试验结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量。此外，国外有报道称，抗菌肽对饲料防霉也有一定的效果。

到目前为止，仅有少数抗菌肽作为饲料添加剂进行了小规模的实验研究，实验的结果都为正效应；抗菌肽大规模的在饲料业中的应用还屈指可数。

另外，国内干酪乳杆菌行业发展尚处于起步阶段，对菌种的研究及相关发酵剂的研究较少，国内大批量使用的干酪乳杆菌菌种及发酵剂大都来自国外知名厂商，国内干酪乳杆菌行业生产商或销售商销售量比较小，因此干酪乳杆菌行业还有较大的发展空间。且目前国内的学者对干酪乳杆菌产细菌素的生产工艺及其作为饲料添加剂的生产工艺方面还在起步阶段，商业化产品还很有限，因此亟待大规模的开发利用。 

目前有关干酪乳杆菌方面的专利申请如下：申请号：201210277454.4，发明名称“一株干酪乳杆菌及其在饲料中的应用”，该专利涉及一株干酪乳杆菌及其在饲料中的应用，并具体公开了该菌株能发酵产生磷脂酶A2，产酶量高，将该菌株应用于饲料领域，以含植物磷脂的油料作物或其加工副产品为发酵底物，以硫酸铵、氯化钠、玉米淀粉作为能量供体，以该菌株作为发酵菌株，通过固态发酵制备饲料添加剂。但该专利不涉及抗菌肽的利用，也不涉及发酵生产工艺及干酪乳杆菌饲料添加剂的大规模生产工艺。 

申请号：201010277557.1，发明名称“一种干酪乳杆菌细菌素及其在饲料中的应用”，公开了一种干酪乳杆菌细菌素及其在饲料中的应用。具体公开了一株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），保藏名称为干酪乳杆菌lyT-7，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010197，以及生产细菌素的方法，和细菌素粗提物在饲料中的应用。产生的细菌素经硫酸铵盐析、Sephadex G-100 凝胶过滤及RP-HPLC 层析得到。该细菌素对热、酸稳定，可被蛋白酶降解，抑菌谱广。将细菌素添加到饲料中，可抑制细菌的生长，具有作为饲料添加剂应用的良好前景。但是对于具体的应用方法，尤其是涉及到该菌株的发酵生产工艺、油菜饼脱毒工艺以及干酪乳杆菌饲料添加剂的大规模生产工艺未有进一步披露，因此更需提供一种干酪乳杆菌饲料添加剂的产业化生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌饲料添加剂的产业化生产工艺，该干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）保藏名称为干酪乳杆菌lyT-7，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010197。本发明利用该菌株能产生具有广谱抗菌性的细菌素（又名抗菌肽），对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及黄曲霉均具有抑制作用的特性，以该菌株作为发酵菌株，通过对该菌株的发酵生产工艺、对油菜饼脱毒工艺、干酪乳杆菌饲料添加剂的大规模生产工艺的建立，从而实现了干酪乳杆菌饲料添加剂的产业化生产。

本发明首先建立了较好的发酵生产工艺；其次，在利用酵母菌和乳酸菌发酵后，不仅能起到脱毒的作用，而且还能提高油菜饼蛋白的含量和油菜饼营养成分的利用率；再次，建立了较好的干酪乳杆菌饲料添加剂的大规模生产工艺，将添加了干酪乳杆菌菌粉的饲料对猪进行饲喂实验，饲喂期间添加组的成活率、抗病能力、增重效果等均优于对照组。

实现本发明目的所采用的技术方案如下：

一种干酪乳杆菌发酵液在饲料中的应用，所述干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）保藏名称为干酪乳杆菌lyT-7，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2010197，其特征在于：将10吨规模发酵获得的干酪乳杆菌发酵液，通过喷雾干燥并经加入脱毒后的油菜饼制成含干酪乳杆菌菌数10⁹活菌/克的饲料添加剂。

所述10吨规模的干酪乳杆菌发酵液生产工艺流程包括：

A、干酪乳杆菌的斜面接种

B、500ml三角瓶培养

C、0.5吨的种子罐发酵

D、10吨大罐发酵48小时

所述发酵液生产工艺中的培养基为：葡萄糖2.21%，蛋白胨2.41%，酵母膏0.64%。

所述三角瓶培养的最适培养温度为30℃，最适起始pH为6.0，最佳接种量为2%，最适摇瓶装量为75ml/100ml。

所述发酵罐中的发酵条件为：最佳接种量5%，在发酵前12h内每隔1h给予间歇搅拌，转数100rpm，维持时间30min，在发酵30小时时进行一次补料，补加0.01%氨水。

所述接种量为在发酵液中的体积百分比。

所述干酪乳杆菌发酵液在饲料中的添加量为7%（g/g）时，抑菌效果最好。 

所述干酪乳杆菌饲料添加剂的生产工艺流程为：

将干酪乳杆菌发酵液于60℃喷雾干燥至含水量在8%以下，获得干菌粉，然后加入脱毒后油菜饼，制得含干酪乳杆菌菌数为10⁹活菌/克的饲料添加剂。

所述干菌粉每克含有的乳杆菌活菌数为10¹¹。

所述10⁹活菌/克的干酪乳杆菌的细菌素含量相当于2.4×10⁵个单位的土霉素/克。

所述干酪乳杆菌饲料添加剂于饲料中的添加量为每吨饲料添加2公斤。

所述脱毒后油菜饼的制备工艺如下：

油菜饼加水，条件：油菜饼:麸皮=9:1（g/g），水料比为1.0:0.7（g/g），起始pH值6.0，用搅拌机配料，在1kg/cm²，110℃蒸汽压下消毒20～30分钟，冷却至35 ℃，在接种铺料机中接入菌种，所述菌种为假丝酵母:干酪乳杆菌=2:1（g/g），总接种量为4.50×107 cfu/g，堆料，物料厚度控制在3公分，发酵室温度控制在32℃，相对湿度为95%，发酵时间3天，用气流干燥机干燥，再用粉碎机把产品粉碎成100目以下的粉末即得。

本发明的有益技术效果：

1、采用保藏名称为干酪乳杆菌lyT-7的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei菌株，能产生具有广谱抗菌性的细菌素又名（抗菌肽），对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及黄曲霉均具有抑制作用，耐酸、碱，耐高温，在pH2至pH11范围内，仍保持良好的抑菌活性，在121℃条件下处理20min仍能保持88.42%的活性，抑菌效果好。

2、在优化后的发酵条件下进行的干酪乳杆菌发酵液生产工艺，发酵产量比优化前提高了225%，同时在10吨发酵罐中进行的10个批次的连续发酵中试生产中，发酵液中的干酪乳杆菌菌数达到1.4×10⁹活菌/ml，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，土霉素作为对照品，测定发酵液中的细菌素效价，测定结果表明，发酵液中的细菌素含量达到相当于3.4×10⁵个单位的土霉素/ml单位的土霉素，发酵效果好。

3、发酵液在60℃下经喷雾干燥后，作为饲料添加剂的干酪乳杆菌菌粉成品中含干酪乳杆菌菌数为10⁹活菌/克，细菌素含量达到相当于2.4×10⁵个单位的土霉素/克，细菌数含量高，作为饲料添加剂应用效果好。

4、采用酵母菌和干酪乳杆菌混合发酵脱毒，具体为假丝酵母:干酪乳杆菌=2:1（g/g），总接种量为4.50×107 cfu/g，脱毒效果明显，脱毒效果可高达60%以上，能将硫甙含量降低至0.15%，达到了国家的硫甙含量控制标准以下，完全可以作为畜禽的饲料蛋白源，安全性好；同时，在利用酵母菌和干酪乳杆菌发酵后，不仅起到了脱毒的作用，而且还提高了油菜饼蛋白的含量和油菜饼营养成分的利用率。

5、通过连续发酵生产证明，菌株生产性能稳定，发酵生产工艺成熟，整个生产过程对环境无污染，为进一步工业化生产提供了基础。将本发明干酪乳杆菌饲料添加剂应用于常规饲料，经饲喂25-30公斤的仔猪试验证明， 与对照组（同样不添加任何抗生素）相比，日增重比对照组提高4%以上，其抗病能力得到有效提高，在三个月的饲喂期间，其发病率为零，而对照组的发病率为8.3%，充分显示了干酪乳杆菌饲料添加剂独特的抗病作用。

附图说明

图1 干酪乳杆菌的生长曲线及产酸曲线

图2 干酪乳杆菌的接种量对抑菌效果的影响

图3 发酵培养基的验证实验效果图

其中，1-6号为按预测表进行的实验，7号为对照实验，相对抑菌效果为100%，实验条件为：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏0.63%

图4 饲料添加剂在常规条件下的抑菌效果

其中，Tc1添加量为按每1000g饲料中分别加入2.5mg细菌素粗提物；C添加量为按每1000g饲料中分别加入5mg细菌素粗提物；Tc3添加量为按每1000g饲料中分别加入10mg细菌素粗提物；CKc为空白对照。

图5 饲料添加剂在强化条件下的抑菌效果，

其中，Tq1添加量为按每1000g饲料中分别加入2.5mg细菌素粗提物；Tq2添加量为按每1000g饲料中分别加入5mg细菌素粗提物；Tq3添加量为按每1000g饲料中分别加入10mg细菌素粗提物；CK为空白对照。

具体实施方式

实施例1 干酪乳杆菌的发酵条件与发酵工艺研究

1.1实验室条件下发酵条件优化

1.1.1 生长曲线的测定

首先对该干酪乳杆菌（T1）的生长曲线及产酸曲线进行了测定，结果如图1。

从图1可以看出干酪乳杆菌T1约从4 h开始进入对数生长期，到36 h进入稳定期，84 h后开始衰亡。从产酸曲线可以看出，在1-4 h的范围内，pH已经出现明显的下降，这说明T1在4 h以前已经开始生长，其延滞期＜4 h。从产酸曲线可以看出，T1的产酸能力比较强，在4 h时pH已经降为4.35，随着菌体的快速生长，pH逐渐下降，到对数生长期结束，pH达到最低点。

1.1.2 单因素实验

1.1.2.1 碳源的影响

以发酵培养基为基础，加入2%不同的碳源代替葡萄糖，30℃下静置培养48h，发酵液离心去除菌体，将CFS的pH调至5.0测抑菌效果，结果见表1。从表1可以看出，以葡萄糖为碳源时干酪乳杆菌素效价最高，玉米淀粉次之，玉米淀粉的抑菌效果较葡萄糖的抑菌效果下降了12.3%。所以，采用葡萄糖为碳源。

注：打孔器直径为7mm

1.1.2.2 氮源的影响

以发酵培养基为基础，以2%葡萄糖为碳源，加入2%的不同氮源。30℃下静置培养48h，将CFS的pH调至5.0测定抑菌效果，结果见表2。

注：打孔器直径为7mm

从表2可以看出，以2%蛋白胨为氮源时抑菌效果最好，以1%的蛋白胨和1%的玉米浆为混合氮源时抑菌效果次之。以1%的蛋白胨和1%的玉米浆为混合氮源时，其抑菌效果较以蛋白胨为唯一氮源时的抑菌效果下降6.7%。

1.1.2.3 初始pH的影响

将发酵培养基用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl分别调至pH4.0-9.0，在30℃静置培养48h，将CFS的pH调至5.0测定抑菌效果，结果表明初始pH6.0时抑菌效果最好。

1.1.2.4 摇瓶装量的影响

在100ml的三角瓶中分别装入10ml、25ml、50ml、75ml和100ml的培养基，调初始pH为6.0，在30℃静置培养48h，将CFS的pH调至5.0测定抑菌效果。最适装量为75ml。摇瓶装量为50ml时，抑菌效率为75ml时的86.8%，摇瓶装量为100ml时，抑菌效率为75ml时的97.2%，说明干酪乳杆菌T1比较耐氧。

1.1.2.5 接种量的影响

在50mL的三角瓶中装入35mL培养基，调pH6.0，以不同接种量接种，30℃下静置培养48 h，将CFS的pH调至5.0测定抑菌效果，结果见图2。从图中可以看出接种量对抑菌效果的影响比较明显：接种量在1%-2%的范围内抑菌效果较好，此后随着接种量的逐渐增大，抑菌效果明显减弱。由图可知最适接种量为2%。

1.1.2.6 培养温度的影响

在50mL的三角瓶中装入35mL培养基，调pH6.0，以2%的接种量接种，在不同培养温度下静置培养48 h，将CFS的pH调至5.0测定抑菌效果。结果显示，最适培养温度为30℃，在30℃-37℃之间，抑菌效果变化不明显，在37℃时，抑菌效果为30℃时的97%。

1.1.3 响应面分析

1.1.3.1试验设计

从单因素实验中发现，碳源和氮源对T1的细菌素产量影响较大，因此选择碳源和氮源，以及作为补充氮源和生长因子的酵母膏做Box-Behnken实验，同时以抑菌圈平均直径为响应值，实验设计表及结果如下：

A，葡萄糖；B，蛋白胨；C，酵母膏；

利用Design Expert软件对上述结果进行分析，得到抑菌圈直径（Y）对葡萄糖浓度（A）、蛋白胨浓度（B）、酵母膏浓度（C）的二次多项回归方程：

Y=+16.82+0.090A+1.06B-0.28C-0.020AB-0.11AC-0.27BC-1.06A²-2.50B²-0.91C²

从方程的方差分析表4可知，实验所选用模型P值为0.001，极显著（P﹤0.05）。决定系数R²=0.9825，说明此模型能预测其响应值，本实验R²为0.9601，说明响应值的变化有96.01%来源于所选变量，该方程拟合情况较好。

R²=0.9825；校正R²=0.9601

1.1.3.2响应面分析图分析

根据回归方程可以做出不同因子的响应面分析图，从响应面分析图上可以看出，葡萄糖浓度、蛋白胨浓度和酵母膏浓度这三个因素对抑菌效果的影响中，蛋白胨浓度对抑菌效果的影响最为明显，葡萄糖浓度的影响次之。

1.1.3.3 验证实验

通过实验辅助软件Design Expert 优化培养配方得到理论的最佳培养配方见下表：

根据预测表的实验设计，进行验证实验，以单因素实验得到的最佳条件为对照，实验结见附图3。 

由实验结果可知，最佳的发酵培养基配方为：葡萄糖浓度为2.21%，蛋白胨浓度为2.41%，酵母膏浓度为0.64%，以此培养基培养T1 48h后得到的发酵液做抑菌实验，抑菌圈平均直径达17.14mm。通过验证实验发现采用响应面分析预测出的实验条件与验证实验证实的条件有较好的拟合性，说明用此方法进行培养条件的分析是可行的。

1.1.4优化前后效果比较

根据恩拉鼎对金黄色葡萄球菌的抑菌标准效价曲线，可以确定T1产细菌素在发酵条件优化前的效价为1171IU/mL，优化后为3812IU/mL。优化前后细菌素产量提高了225%。说明本次发酵条件优化取得了较好的效果，优化后的抑菌效果明显提高。

1.2工业化发酵条件研究

1.2.1 小试条件

选择2升的发酵罐进行小试实验，装料1.7升。以2.2%的葡萄糖为碳源，以2.4%的蛋白胨为氮源，0.6%的酵母膏为生长因子发酵，发酵温度30℃，初始pH6.0，培养时间48h，接种量2%，进行发酵小试，小试发酵结果表明，发酵48小时后，发酵液中的干酪乳杆菌菌数达到4.4×10⁹g/L，以金黄色葡萄球菌作为指示菌，土霉素作为对照品，测得发酵液中细菌素效价达到相当于6.8×10⁵个单位的土霉素/mL。

1.2.2 中试条件

选择10升的发酵罐进行中试实验，装料9升。以2.2%的葡萄糖为碳源，氮源浓度2%，其中蛋白胨和豆粕的比例为1:0.5，0.4%的酵母膏为生长因子进行发酵实验。发酵温度30℃，初始pH6.0，培养时间45h，接种量5%，在发酵前12h内每个1h给予间歇搅拌，转数为100rpm，维持时间为30min，在发酵30小时时进行一次补料，补加0.01%氨水，发酵48小时，发酵液的干酪乳杆菌菌体浓度为4×10⁹个/ml，然后以金黄色葡萄球菌作为指示菌，土霉素作为对照品，测定发酵液中的细菌素效价，结果表明发酵液中的细菌素的效价相当于5.2×10⁵个单位的土霉素/mL。

实施例2  细菌素高产菌株在饲料中添加的应用效果研究

2.1细菌素粗提物添加到饲料中的抗菌效果研究

2.1.1 常规条件下的抑菌效果

按每1000g饲料中分别加入2.5mg，5 mg，10 mg的量加入细菌素粗提物测定在常规条件的抑菌效果，结果发现添加量为10mg时抑菌效果最佳。结果见附图4。

2.1.2 强化条件下的抑菌效果

按每1000g饲料中分别加入2.5mg，5mg，10mg的量加入细菌素粗提物测定在强化条件的抑菌效果，结果发现添加量为10mg时抑菌效果最佳。结果见附图5。 

2.1.3 细菌素粗提物与阳性对照的效果比较

在常规条件及强化条件下，分别测定在不同添加剂量条件下，细菌素粗提物与阳性对照的抑菌效果，结果发现在最低剂量组中T1粗提物的抑菌效果与恩拉鼎相当，而在高剂量组中T1粗提物的抑菌效果略优于恩拉鼎。

2.2发酵液添加到饲料中的抗菌效果研究

测定初始细菌总数，以后每7天测定细菌总数一次。实验结果显示T1发酵液对细菌有明显的抑制作用，保存至3个月时仍然有较强抑菌作用，至20周后细菌总数有所增加。发酵液添加量为7%时抑菌效果最好(与阳性对照抑菌效果相近)，其原因是发酵液添加量少则其中有效成分细菌素量少，抑菌作用不明显，发酵液添加过多，则由于发酵培养基中含有的其他氮源、碳源营养物质为细菌生长提供了条件，细菌总数反而会增长。发酵液的抑菌效果随时间的推移而降低，在第10周左右抑菌效果达到最佳，之后抑菌效果逐步下降。

2.3微生态制剂在饲料中的存活效果

发酵生产的干酪乳杆菌菌液，发酵原液中的乳杆菌活菌数为1.4×10¹⁰，经60℃的真空喷雾干燥，获得的乳杆菌干菌粉（含水量在8%以下），含有10¹¹乳杆菌活菌/克干菌粉，按每吨饲料添加1.5-2公斤的量，添加到饲料中，在每克饲料中，含有10⁵乳杆菌活菌（即20万个乳杆菌活菌/克饲料）。在常温下保存3六个月后，测定饲料中的干酪乳杆菌活菌和细菌素的含量，测定结果表明，饲料中的干酪乳杆菌活菌数为1.6×10⁵/克饲料，细菌素含量没有发生变化，仍然保持在相当于46.8个单位的土霉素/克饲料。

实施例3  干酪乳杆菌饲料添加剂的大规模生产工艺研究

3.1中试条件下批次发酵试验

在10吨的发酵罐中进行连续发酵试生产，连续发酵生产10批次，生产出干酪乳杆菌菌粉近10吨，通过连续发酵生产证明菌株生产性能稳定，发酵生产工艺成熟，发酵48小时，发酵液中的干酪乳杆菌菌体浓度为1.4×10⁹活菌/ml，然后以金黄色葡萄球菌作为指示菌，土霉素作为对照品，测定发酵液中的细菌素效价，测定结果表明，发酵液中的细菌素效价为相当于3.4×10⁵个单位的土霉素/mL。发酵液经喷雾干燥，再加入相应的填充料（脱毒后的油菜饼）制备的干酪乳杆菌菌剂，含干酪乳杆菌10⁹活菌/克,然后以金黄色葡萄球菌作为指示菌，土霉素作为对照品，测定干酪乳杆菌菌剂中的细菌素效价，测定结果表明，干酪乳杆菌菌剂中的细菌素效价相当于2.4×10⁵个单位的土霉素/克。

3.2 干酪乳杆菌菌粉生产工艺研究

将干酪乳杆菌进行规模发酵生产，获得干酪乳杆菌发酵液，然后将干酪乳杆菌发酵液通过喷雾干燥的方法，在60℃下喷雾干燥制成菌粉（含水量8%以下），并加入相应的填充料（脱毒后的油菜饼），测定干酪乳杆菌菌剂中的活菌数为10⁹活菌/克；细菌素含量达到相当于2.4×10⁵个单位的土霉素/克。再按每吨饲料添加2公斤的量，添加到常规饲料中，每克常规饲料中含有2×10⁶干酪乳杆菌活菌（即150-200万个乳杆菌活菌/克常规饲料）。以金黄色葡萄球菌作为指示菌，土霉素作为对照品，测定添加有干酪乳杆菌饲料添加剂的饲料，测定结果表明，饲料中含有相当于480个单位的土霉素/克。

3.3 干酪乳杆菌饲料添加剂饲喂实验

3.3.1 添加干酪乳杆菌菌粉饲喂猪的效果研究

选择25-30公斤左右的断奶仔猪210头，作为饲喂试验，仔猪随机分为2组，A组为每吨饲料添加了2公斤干酪乳干菌饲料添加剂的试验组（150头），B组为常规饲料（不添加任何抗生素）的对照组（60）。饲喂周期为3个月，第一、二个月每天喂5次，第三个月每天饲喂4次。饲喂期间观察取食情况、适口性、生活习性、生长情况、增重情况，发病情况等，结果表明在饲喂期间A、B两组在取食、适口性、生活习性等方面无显著差异，在日增重方面，A组比B组日增重提高了4.2%.，在猪的疾病发病率方面，饲喂试验期间，A组的疾病发病率为零（即无一例发病），而B组的疾病发病率为8.3%（有5头猪发病）。因此，饲喂试验结果表明，添加有干酪乳杆菌饲料添加剂的饲料，在不添加任何抗生素的情况下，饲喂猪以后，完全可以抵抗猪的各种疾病的感染。

实施例4

4.1 脱毒微生物的培养

4.1.1 酵母菌的培养

使用麦芽汁液体培养基：将麦芽糖化液（购于新都啤酒厂）用4～6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，即将一个鸡蛋白加水约20ml，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。将滤液稀释到5～6波美度，pH约6.4。121℃灭菌20分钟。将假丝酵母接种于麦芽汁液体培养基，灭菌、接种，摇床（150r/min）28 ℃培养3天。

4.1.2 干酪乳杆菌的培养：使用MRS液体培养基：

蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母膏5g；K₂HPO₄·3H₂O 2g；乙酸钠5g；葡萄糖20g；吐温801g；柠檬酸二铵 2g；MgSO₄·7H₂O 0.58g；MnSO₄·4H₂O 0.25g；加蒸馏水 1000mL；pH6.2-6.4，121℃，15min灭菌备用。

将干酪乳杆菌接种于MRS液体培养基，灭菌、接种，静置培养，30 ℃，2～3天。

4.2 油菜饼微生物脱毒

4.2.1 单一菌种发酵

将液体发酵培养3天的假丝酵母和干酪乳杆菌，分别接种于发酵培养基（油菜饼：麸皮=9:1，水料比：1.0:0.7，起始pH值6.0）进行固体发酵，按接种量的不同分为四个实验组，即接种量分别为2.25×10⁷ cfu/g，4.50×10⁷ cfu/g，6.75×10⁷ cfu/g，9.00×10⁷ cfu/g。发酵条件：32 ℃，含水率：30%，分别培养7d。

4.2.2 酵母菌和干酪乳杆菌混合发酵

将假丝酵母和干酪乳杆菌按一定比例（假丝酵母:干酪乳杆菌= 1:2；酵母菌：干酪乳杆菌= 2:1；假丝酵母：干酪乳杆菌= 1:1）混合后接种于发酵培养基进行固体发酵（总接种量约为4.50×10⁷ cfu/g）。发酵条件同上。

3天以后即出现明显的脱毒效果，但之后的脱毒效果没有明显改善，故发酵脱毒时间以3-5天为宜。接种量太低不利于脱毒。混合菌种比单一菌种脱毒效果好。假丝酵母和干酪乳杆菌不同混合方式脱毒率比较结果显示，假丝酵母:干酪乳杆菌=2:1/1:1＞酵母:乳酸=1:2＞单一菌种发酵。脱毒效果最好的可高达60%，能将硫甙含量降低至0.15%。

从研究结果可以看出，酵母发酵后不仅能起到脱毒的作用，还能提高油菜饼蛋白的含量，发酵5天后油菜饼蛋白含量可增长5%以上。而乳酸的发酵又能提高油菜饼营养成分的利用率。另外，微生物发酵还能大大地改善油菜饼的口感，微生物利用自身代谢作用，可以产生香味物质或香味的前体物质，提高油菜饼脱毒后的香味。

4.3工业化发酵生产工艺的建立

通过接种量、混合发酵菌种接种比例、培养基成分、加水量、发酵pH值、发酵周期等试验，建立了油菜饼微生物脱毒的工业化生产工艺：使用培养基加水（油菜饼：麸皮=9:1，水料比：1.0:0.7，起始pH值6.0），用搅拌机配料、在1kg/cm²，110℃蒸汽压下消毒20～30分钟，冷却至35℃，在接种铺料机中接入菌种（假丝酵母:干酪乳杆菌=2:1，总接种量约为4.50×10⁷ cfu/g），堆料，物料厚度控制在3公分，发酵室温度控制在32℃，相对湿度为95%，发酵时间3天，用气流干燥机干燥，再用粉碎机把产品粉碎成100目以下的粉末。

实施例5  干酪乳杆菌饲料添加剂的饲喂效果

将干酪乳杆菌饲料添加剂添加到常规饲料中，每吨饲料按2公斤的添加量进行添加，另外不添加任何抗生素，添加干酪乳杆菌饲料添加剂后，经测定，含105个干酪乳杆菌活菌/克饲料，含有的细菌素相当于74个单位的土霉素。经饲喂25-30公斤的仔猪试验证明，与对照组（同样不添加任何抗生素）相比，日增重比对照组提供4%以上，抗病能力大大提高，在三个月的饲喂期间，其发病率为零，而对照组的发病率为8.3%。充分显示了干酪乳杆菌饲料添加剂独特的抗病作用。