一种表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及用途

摘要

本发明公开了一种表达猪胰高血糖素样肽-2基因的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及用途，根据已公开的猪胰高血糖素样肽-2的基因序列及表达载体质粒特点，设计含特异酶切位点的引物；以猪小肠黏膜为材料，通过RT-PCR获得含有猪胰高血糖素样肽-2基因的片段，将其与乳酸菌表达载体质粒pMG36e进行连接，获得重组质粒pMG36e-glp2，通过电转化方法将该重组质粒转入嗜酸乳杆菌内，得到表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌，在乳链菌肽(nisin)的诱导下进行表达，并经SDS-PAGE和Western blot分析证明目的基因得到正确表达。该重组菌用于防治腹泻的发生，改善猪的肠道健康，提高生长性能。

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医技术领域，尤其涉及一种表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌的构建方法及其在促进猪肠道健康中的应用。 

背景技术

在当前，养猪业已成为关系国计民生的重要产业。在养猪生产中，仔猪是生长发育最快、饲料利用率最高、开发潜力最大的一个阶段，仔猪饲养的好坏直接影响猪整个饲养期的生产成绩。然而，仔猪阶段也是生存能力、生理机能最脆弱的阶段，仔猪死亡率通常占整个饲养期死亡率的70%。仔猪成活率低和生长缓慢是目前我国养猪生产中面临的主要问题，提高仔猪饲养成绩是保障养猪业快速发展的关键。 

动物肠道不仅是动物体内最大的消化吸收器官，是所有营养物质最终的吸收场所，同时也是体内最大的免疫器官，仔猪肠道健康发育是快速生长与高成活率的生理基础。新生仔猪由于肠道处于快速发育之中，结构与功能不完善，养分的消化吸收与免疫屏障功能有很大的局限性，难以适应营养与环境的变化，增加了饲养的困难。仔猪哺乳期间，初乳和常乳中都含有高水平的、可促进肠道发育和成熟的生长因子，如谷氨酰胺、表皮生长因子、胰高血糖素样肽-2、类胰岛素生长因子和多胺等，断奶后，这些因子消失，对肠细胞生长、分化及细 胞功能的发育产生不良影响。仔猪断乳后由于受营养、生理、环境和病原微生物等多种应激因素的影响，导致肠道黏膜萎缩、肠道上皮完整性和肠道屏障作用被破坏以及肠道功能紊乱，引起消化不良、腹泻、生长抑制，甚至死亡。据统计，断奶仔猪腹泻率一般在20%～30%，腹泻死亡率占仔猪总死亡率的40％。因此，生产实际中迫切需要采取有效措施促进仔猪肠道健康发育、改善消化吸收与免疫屏障功能。 

猪胰高血糖素样肽-2作为猪乳中含量较高的生长因子之一，它对初生仔猪胃肠道发育有着极其重要影响。 

在肠道，GLP-2以一种依赖营养的方式由肠L内分泌细胞(大多数分布于回肠末端和盲肠)分泌，主要刺激物是机体摄取的营养成分包括葡萄糖、脂肪酸和食物纤维等。Drucker等(1999)报道胃肠道摄人营养物质对GLP-2的影响的最初研究结果表明，长期服用GLP-2对胃肠道有潜在作用，GLP-2能促进新生仔猪小肠的重量、长度和肠绒毛高度的增加并呈剂量依赖效应；GLP-2通过促进肠隐窝细胞的增生，抑制肠上皮细胞和隐窝细胞的凋亡，促进成年小鼠小肠和大肠的湿重增加；GLP-2促进了健康志愿者对营养物质的吸收。总结起来其功能主要包括以下6个方面：①调节胃肠道蠕动等活动；②促进肠道和黏膜的生长；③促进小肠上皮细胞增殖，抑制细胞凋亡；④对肠道疾病的治疗作用；⑤增加小肠血流量，促进营养物质的吸收；⑥维持肠道屏障功能，促进损伤修复。 

早期断奶是缩短母猪生育周期的重要手段，而早期断奶导致的断奶应激是影响早期断奶仔猪生产性能的主要原因，通过在饲料中添 加胰高血糖素样肽-2可以缓解断奶应激。尽管猪胰高血糖素样肽-2凭借其独特的理化特性以及显著的生理作用，作为饲料添加剂具有广阔的发展前景，但是目前生产的猪胰高血糖素样肽-2都是从乳产品中获得或利用大肠杆菌表达系统表达所得，这两种途径都具有一定的局限性，从乳中分离猪胰高血糖素样肽-2的量有限，很难满足市场需要，而利用大肠杆菌表达系统表达的猪胰高血糖素样肽-2，由于宿主菌大肠杆菌的局限性不能直接作为饲料添加使用，存在着分离纯化的难题，增加了添加成本，很难满足市场需要，  

鉴于此本发明以公认安全的微生物嗜酸乳杆菌为载体菌，构建能够表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌，并以此重组嗜酸乳杆菌作为饲料添加剂。该载体菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素的毒性成分，并具有促进动物消化道益生菌的生长，抑制有害菌的繁殖，改善肠道环境，增强动物免疫功能等多种作用，已作为益生菌饲料添加剂应用于畜禽生产中。而所表达的猪胰高血糖素样肽-2可以刺激损伤肠道上皮的修复，达到预防腹泻的目的。因此开发仔猪用表达肠黏膜胰高血糖素样肽-2的重组益生菌，在饲料业与养猪业中具有广阔的应用前景。目前国内在该领域的研究尚属空白。 

发明内容

本发明的目的是针对目前仔猪断奶应激导致的肠道损伤而不能有效修复，现有技术不足而无法解决的现状，提供一种重组嗜酸乳杆菌的 构建方法及用途，研发一种能够促进仔猪肠道粘膜损伤修复的重组嗜酸乳杆菌。本发明的重组嗜酸乳杆菌既具有嗜酸乳杆菌对肠道微生态环境的维护功能，又可以发挥重组胰高血糖素样肽-2对猪肠道损伤的修复功能，达到治疗仔猪因各种因素导致的肠道损伤继而引起的腹泻，增加仔猪的存活率，解决生猪养殖过程中的瓶颈问题。本发明的目的可通过下述技术方案来实现： 

（1）猪胰高血糖素样肽-2基因的获得：提取猪小肠黏膜RNA，经过RT-PCR得到cDNA，以此cDNA为模板，设计合成含有Xma I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分别具有猪glp2基因（Gene ID：NM_214324.1）的序列，采用PCR方法扩增猪glp2基因片段。将所扩增的glp2目的基因片段与克隆载体pMD18-T载体连接，得到重组质粒，转入大肠杆菌DH5a中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，并通过酶切鉴定和测序分析验证，验证正确的质粒命名为pMD18T-glp2，重组质粒序列测定表明该质粒具有猪glp2的基因序列。 

（2）重组表达质粒pMG36e-glp2的构建：将乳酸菌表达载体pMG36e和克隆质粒pMD18T-glp2用限制性内切酶Xma I和Xba I进行双酶切，纯化回收双酶切的线性化的pMG36e载体片段和glp2目的基因片段，并将线性化的载体片段和目的基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，通过红霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，提取重组质粒，酶切鉴定正确后，命名为pMG36e-glp2，其具有猪glp2的基因序列。 

（3）重组嗜酸乳杆菌的构建：采用电转化方法将重组质粒 pMG36e-glp2转化入嗜酸乳杆菌NZ6092感受态细胞中，利用红霉素抗性进行筛选，得到重组菌，命名为：NZ6092-glp2。 

（4）猪胰高血糖素样肽-2在嗜酸乳杆菌中的诱导表达：将所构建的重组嗜酸乳杆菌NZ6092-glp2接种于含有100ug/mL红霉素的MRS液体培养基中，进行诱导表达，摸索其诱导表达条件，并对表达产物进行及SDS-page和Western Blot分析。得到大小为21Kda左右的蛋白条带。（ 

5）基因重组菌的防腹泻效果：将所构建的基因重组嗜酸乳杆菌饲喂仔猪，观察其防治仔猪腹泻的效果。 

一种表达猪胰高血糖素样肽-2基因的重组益生菌的用途，所述的表达猪胰高血糖素样肽-2基因的重组益生菌通过饮水或饲料中添加，促进猪胃肠道健康,防治仔猪腹泻的发生，提高生长性能。 

本发明所具有的优点是： 

本发明所构建的表达细胞因子glp2的重组益生菌，具有传统益生菌无法比拟的优点。该重组益生菌既有嗜酸乳杆菌的改善肠道环境，促进动物生长的优势；所表达的细胞因子glp2又具有修复肠道损失的功效。可以作为一种新型的饲料添加剂。 

附图说明

图1为猪glp2基因的RT-PCR扩增产物电泳图; 

图2为克隆载体pMD18T-glp2酶切电泳图; 

图3为表达载体pMG36e-glp2酶切电泳图; 

图4为诱导表达的glp2的western-blot分析。 

具体实施方式

实施例 

参见附图1-图4，本发明所述表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌采用以下方法构建：根据已公开的猪胰高血糖素样肽-2（glp2）的基因序列及表达载体质粒的特点，设计含有特异酶切位点的引物；以猪小肠黏膜为材料，提取mRNA，反转录得到cDNA为模板进行PCR扩增，获得含有glp2基因片段，并将其与表达载体质粒pMG36e进行连接，获得重组质粒pMG36e-glp2，通过电转化方法将该重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌感受态细胞内，进行表达。并以所构建的重组猪胰高血糖素样肽-2的嗜酸乳杆菌饲喂动物，观察其防治腹泻的效果。本发明的所需的实验材料及具体实施方式如下： 

一）实验材料 

（1）目的基因序列 

猪胰高血糖素样肽-2(glp2）的基因序列来自于NCBI Genebank中。 

（2）载体 

Nisin诱导性表达载体pMG36e购自湖南瀛润生物科技有限公司。 

pMD18-T克隆载体购自Takara生物科技有限公司。 

（3）菌株 

大肠杆菌DH5a购自Takara生物科技有限公司，受体菌嗜酸乳杆菌NZ6092购自中国农业微生物菌种保藏中心。 

二）实施方案 

1、猪胰高血糖素样肽-2基因的获得 

以报道的猪胰高血糖素样肽-2的基因序列（GeneID：NM_214324.1）为模板，设计合成含有Xma I和Xba I酶切位点的上下游引物P1：5- ACCCGGGGATGAAAACCATTTACTT-3（Xma I，如SEQID NO.2所示）和P2：5- GCTCTAGAGTGAACACGATCTTGAT-3（Xba I，如SEQID NO.3所示）；提取猪小肠上皮细胞RNA，经过反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，通过PCR方法扩增猪glp2基因片段，PCR产物经凝胶电泳检测后，回收PCR产物。将所扩增回收的glp2目的基因片段与克隆载体pMD18-T载体连接后，转入大肠杆菌DH5a中，通过氨苄青霉素抗性筛选，得到重组质粒，重组质粒用Xma I和Xba I双酶切，酶切产物经凝胶电泳检测，酶切鉴定正确后重组质粒命名为pMD18T-glp2。同时将重组质粒送往北京奥克生物科技有限公司进行序列测定。 

2、重组表达载体的pMG36e的构建 

将乳酸菌表达载体pMG36e和克隆质粒pMD18T-glp2用限制性内切酶Xma I和Xba I进行双酶切，酶切产物经凝胶电泳分析后，纯化回收酶切的线性化的pMG36e载体片段和glp2目的基因片段，并将线性化的载体片段和目的基因片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，通过红霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，提取质粒，重组质粒用Xma I和Xba I双酶切，酶切产物经凝胶电泳检测。鉴定正确后的重组质粒，命名为pMG36e-glp2，其具有猪glp2的基因序列。 

3、表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌的构建 

采用电转化方法将重组质粒pMG36e-glp2转化入嗜酸乳杆菌NZ6092感受态细胞中，电击条件为电压2.5KV，电阻400Ω，电容25μF。利用红霉素抗性进行筛选，经过PCR鉴定、酶切鉴定和测序（北京奥科生物科技有限公司）验证后重组菌命名为：NZ6092-glp2。 

4、猪胰高血糖素样肽-2在乳酸乳球菌中的诱导表达及SDS、Western Blot分析 

挑取重组菌NZ6092-glp2接种于含有100μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，30℃静置培养过夜。培养物以3%的比例转接于500mL含红霉素MRS培养液中，培养至OD₆₀₀=0.5～0.6时，加入诱导剂nisin，使其终浓度为5ng/mL，继续培养3-5小时。重组菌裂解后经SDS-PAGE和Western blot分析证明目的基因得到正确表达。重组菌经nisin诱导后，在21Kda左右处出现一特异性蛋白条带，与预期的大小一致。凝胶经薄层扫描分析显示，目的蛋白约占受体菌总蛋白的8.8%。 

三）实验效果 

1、猪胰高血糖素样肽-2(glp2)基因的RT-PCR扩增 

提取猪小肠黏膜RNA，采用RT-PCR方法扩增猪glp2基因片段，PCR产物经凝胶电泳检测，得到大小约为574bp的目的条带,与预期结果相符。结果如图1所示。 

2、克隆质粒pMD18T-glp2的酶切鉴定 

克隆载体用Xma I和Xba I双酶切，酶切产物经凝胶电泳检测，结果显示酶切出大小2800bp左右的载体片段和大小约为574bp的目 的基因片段，酶切结果表明克隆质粒构建正确。鉴定正确后重组质粒命名为pMD18T-glp2。酶切结果如图2所示。 

3、猪胰高血糖素样肽-2glp2的序列测定 

将酶切鉴定正确的克隆载体送往北京奥科生物科技有限公司进行序列测得，结果表明该质粒具有猪glp2的基因序列，序列如SEQ ID NO.1所示。 

4、表达质粒pMG36e-glp2的酶切鉴定 

表达质粒用Xma I和Xba I双酶切，酶切产物经凝胶电泳检测，结果显示酶切出大小3600bp左右的载体片段和大小约为574bp的目的基因片段，酶切结果表明表达质粒构建正确。鉴定正确后重组表达质粒命名为pMG36e-glp2。酶切结果如图3所示。 

5、猪胰高血糖素样肽-2在乳酸乳球菌中的诱导表达及SDS、Western Blot分析 

重组猪GLP2的嗜酸乳杆菌诱导表达后得到大小约为21KDa的目的蛋白，经Western blot分析证明目的基因得到正确表达。结果如图4所示。 

6、表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌的防腹泻效果 

以本发明构建的表达猪胰高血糖素样肽-2的重组嗜酸乳杆菌菌液（含重组嗜酸乳杆菌10亿/kg）与二氧化硅按照体积重量比1:50在37℃下混合制成重组嗜酸乳杆菌饲料添加剂进行断奶仔猪试验。 试验选用6.23±0.17kg 21日龄断奶的杜长大仔猪48头，随机分为两组，每组分三个重复（栏），每栏8头。两组基础日粮一致，试验组添加0.05%的重组嗜酸乳杆菌饲料添加剂，空白对照组未加重组嗜酸乳杆菌饲料添加剂。饲养结果见表1。 

表1  添加表达猪胰高血糖素样肽-2基因的重组益生菌对断奶仔猪生长性能的影响 

注：同行肩标字母不同者表示差异显著（p<0.05）。 

结果表明，应用本发明所述的表达猪胰高血糖素样肽-2基因的重组益生菌，与空白对照组相比，可以显著提高21日龄断奶仔猪日增重21.2%；降低料重比10.4%；降低腹泻率57.6%。