影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物的生测方法

摘要

本发明涉及一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物的生测方法，包括以下步骤：取内腔容积在10至500mm

说明书

技术领域

本发明涉及一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的生测方法，属生物测定技术领域。 

背景技术

研究松材线虫的化学生态学，对了解松萎蔫病的致病机理及过程有着重要的意义。其中，生测手段必不可少。在快速检测昆虫触角对气味的反应方面，触角电位图(Electroantennogram，EAG)是非常重要的生物测定方法(赵新成等, 2004)。气相色谱与触角电位(GC-EAD)连用技术可以通过昆虫触角的化学感器对化合物进行识别，检测其中的活性组分。受限于目前的手段，线虫的信息素的研究手段无法像昆虫的一样，不能直接用仪器检测到线虫对活性组分的神经电脉冲信号。因此只有将待分析的VOCs经GC-MS分析和鉴定出所有的组分的结构，购买所有有可能的化合物或进行合成，再对线虫进行生测(Zhao等, 2007；Kaplan等, 2008；Niu等, 2010)。 

常用松材线虫的生测手段一般采用琼脂平板生测法，以水琼脂平板或木段等为基质，来研究松材线虫的移行。具体的方法如下：在培养皿中倒入2%琼脂水液，待琼脂凝固后，用记号笔在培养皿背面划线，以平板中心为原点，将平板均匀的等分为四个象限。 在第一或第三象限放入处理，一般为真菌小块或样品溶液等；在第二或第四象限放入对照，一般为培养基小块或溶剂等。然后在平板中心滴入线虫液，一段时间后检测线虫的移行情况。Mamiya(Mamiya, 2006)用水琼脂平板为生测材料，研究了木材腐生真菌的活菌丝对松材线虫的作用。赵莉蔺(Zhao等, 2007)以0.8%琼脂平板为基质，对马尾松和松褐天牛的挥发物对线虫的吸引作用进行了研究。龙瑞敏(龙瑞敏, 2007)分别以灭菌的淡水沙和水琼脂平板为基质，研究了松材线虫的移行。谈家金(谈家金等, 2009)在水琼脂平板和木段上研究了松树挥发物对松材线虫的吸引作用。 

上述琼脂平板生测法有两大不足，首先，它对生测样品的量需要量很大，以形成较高浓度梯度，被松材线虫感觉到；其次，采用了线虫在琼脂表面运动的方法进行，由于不同线虫的在自然界生境不同，存活的介质也不同，琼脂表面并不完全适合线虫的运动，特别是绝大多数线虫是在介质中运动，而不是在介质表面运动。因此这些方法影响线虫的运动，继而影响生测的灵敏度和准确性。 

Ishikawa (Ishikawa M, Shuto Y, Watanabe H. β-Myrcene, a Potent Attractant Component of Pine Wood for the Pine Wood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Pesticide Chemistry). Agricultural and biological chemistry, 1986, 50 (7):1863-1866.) 建立了一种生测方法，用于检测供试化合物 (5 mg) 的挥发物对松材线虫的吸引作用。他使用的生测装置是T型玻璃管，内含9 ml 1.5 %的琼脂。该装置的空腔体约为π × r² × h = 3.14 × (5 mm)² × 200 mm = 15700 mm³。且T型管顶部有个虹吸管，用于向外抽气。使用该方法，它对管内的样品的浓度要求很高，即需要的所测化合物的量很大 (毫克mg数量级)。使用该生测方法无法检测到GC分离得到的对松材线虫有生物活性的微量挥发物 (纳克ng数量级的化合物)。 

张田园((张田园, 牛秋红, 应树松, 刘艳, 王敏, 王珍珍, 过雨晴. 细菌Bacillus sp. NS-3和灰葡萄孢对松材线虫的诱引. 南阳师范学院学报, 2011 (06):47-50.)采用“水琼脂平板移行法”和“玻管法”，研究了松材线虫拮抗细菌Bacillus sp. NS-3和灰葡萄孢引诱线虫的能力。其方法为改良的玻管法，参考自Ishikawa的方法。采用玻管并在其上加装了虹吸管，对外抽气。方法中玻管内的空腔体积为π × r² × h = 3.14 × (45 mm)² × 7.5 mm = 47688.75 mm³，该方法同样对生测样品的量需要量很大，有着很高的要求。 

此外，目前的生测方法常结合气相色谱质谱(GC-MS)联用仪进行，将收集的VOCs进行气相色谱质谱(GC-MS)联用仪测定后，将鉴定出来的所有物质进行合成或购买已知的化合物，然后对松材线虫进行生测，最终确定活性组分的结构和含量(Zhao等, 2007；Kaplan等, 2008；Niu等, 2010)。这种方法不仅复杂，而且很可能购买不到所有的化合物，使得不能鉴定出所有的具有生物活性的化合物。 

综上所述，现有生测方法对活性挥发性代谢物质的浓度有明显的限制，它要求活性挥发性代谢物质(VOCs)有一定的量，以形成较高浓度梯度，被松材线虫感觉到。现有采用加装虹吸管的玻管的生测方法，对管内的样品的浓度要求很高，即需要的所测化合物的量很大 (毫克mg数量级)。对于活性挥发性代谢物质(VOCs)微量的样品，或无法测出，或虽然能够检测到一定的生物活性，但统计处理结果差异不显著(p>0.05)。使用现有生测方法无法检测到由GC分离而直接得到的对松材线虫有生物活性的微量挥发物 (纳克ng数量级的化合物)。需要加以改进。 

发明内容

本发明旨在提供一种能测定出微量的影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的方法。 

本发明的技术解决方案如下： 

一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的生测方法，包括以下步骤：

取内腔容积在10至500 mm³的细管，在细管正中间开一用来滴加蒸馏水和线虫液的小口，在细管的一侧放入一个有产生活性挥发性代谢物质(VOCs)微生物的培养基小块，或者含有VOCs的样品溶液的介质，标记为处理端；另一侧放入一个未接种微生物或不含活性挥发性代谢物质(VOCs)的培养基小块，标记为对照端，再将细管两侧封口，用微量进样器从细管中间的小口处滴入线虫液，置于培养箱中培养。分别于10 h，24 h，36 h后分离线虫，28℃下静置24 h后镜检，统计分离到的线虫数并进行数据的统计分析。

上述细管可采用玻璃、金属、无挥发物的塑料等材料制成的细管，优选采用透明硅胶管。 

本发明的优点在于：本发明所采用的“硅胶管法”更加灵敏，很小的空腔体积和封闭的环境确保“硅胶管法”对于微量的挥发物有着非常高的检测灵敏度。 

进一步的技术解决方案为：在管内居中放置适合于线虫运动的介质，以硅胶管中间的小口处为中心居中放置于硅胶管中，在硅胶管中间的小口处缓慢注入蒸馏水，使介质刚好全部湿润。 

在过去已有的生测方法中绝大多数采用了线虫在琼脂表面运动的方法进行，由于不同线虫的在自然界生境不同，存活的介质也不同，琼脂表面并不完全适合线虫的运动，特别是绝大多数线虫是在介质中运动，而不是在介质表面运动。因此这些方法影响线虫的运动，继而影响生测的灵敏度和准确性。本发明采取了对特定线虫使用适合于线虫运动的介质，使得线虫在适合的介质中运动，提高了生测的灵敏度和准确性。 

再进一步的技术解决方案为：所述介质为经灭活的线虫实际生活环境用土壤、木屑，也可以为棉线、滤纸、玻璃毛，优选采用直径为透明硅胶管内径的滤纸棒。 

上述介质是适合于线虫运动的介质，滤纸棒易取得和制作。 

再进一步的技术解决方案为：所述透明硅胶管的内径为1-3 mm，长度为3-5 cm，空腔体积为23.55 mm³-353.25 mm³。 

本技术解决方案使得对由GC收集口收集到的微量的样品可以生测，方法简单易行，可找出纳克量级的具有引诱活性的化合物。实验证明，检测灵敏度比常用的生测方法高出数个数量级，能够检测到小于1 ng对松材线虫具有生物活性的化合物。 

再进一步的技术解决方案为：上述含有VOCs的样品溶液的介质为滤纸、培养基、玻璃毛。 

本发明建立的生测方法（以下简称“硅胶管法”），可结合GC联用，在GC通向检测器柱子上加装分支柱和收集口，并在改变GC色谱柱的分流比的基础上，从GC收集口收集到微量化合物，并以此微量分离的物质能够进行生测，确定其生物活性，最后通过GC-MS鉴定出活性组分的结构。可用于检测微量的VOCs对松材线虫的生物活性；鉴定微生物引诱线虫的活性挥发性代谢物质，以期为线虫引起的病害的生物防治和早期检测诊断提供一定的理论基础。 

附图说明

图1 硅胶管法测定E. vermicola真菌小块*的VOCs吸引松材线虫的效果。 

具体实施方式

以下将结合真菌Esteya vermicola CNU 120806引诱线虫的活性挥发性代谢物质(VOCs)的生测的实实验对本发明做进一步说明。 

实验1  测试真菌E. vermicola的VOCs吸引松材线虫的效果及比较“硅胶管法”和“水琼脂平板法” 对微量物质检测的灵敏度。 

1、试验材料： 

供试真菌：Esteya vermicola CNU 120806 (简称Esteya vermicola)，韩国忠南大学惠赠

供试线虫：松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)

材料与试剂：

透明硅胶管 (内径3 mm，外径6 mm，南京距成化玻有限公司)； 

游标卡尺D15TN (Mitutoyo Corporation)；

快速定性滤纸 (杭州新华纸业有限公司)；

手术刀片 (上海医疗器械有限公司手术器械厂)；

微孔滤膜Ф 0.22 μm (上海市新亚净化器件厂)；

封口膜Parafilm (杭州微生物试剂有限公司)；

培养皿 (南京金庆祥贸易有限公司)；

小圆滤纸片 (r=0.6 cm，自制)；

新鲜玉米粉 (集贸市场购买)；

蔗糖 (国药集团化学试剂有限公司)；

琼脂粉 (国药集团化学试剂有限公司)；

硫酸链霉素 (南京生兴生物技术有限公司)；

青霉素钠 (南京生兴生物技术有限公司)； 

30%双氧水 (南京化学试剂有限公司)；

石油醚 (沸程60-90℃，分析纯，南京化学试剂有限公司)；

无水乙醇 (分析纯，南京化学试剂有限公司)；

无水乙醇 (光谱纯，阿拉丁试剂上海有限公司)；

二氯甲烷 (分析纯，南京化学试剂有限公司)；

α-蒎烯 (92%，南京林业大学化工工程学院)；

β-蒎烯 (92%，南京林业大学化工工程学院)

培养基：

马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)；

水琼脂培养基(2% WA；0.8% WA)；

弱营养玉米粉培养基(LCMA)；

弱营养玉米粉琼脂双抗培养基(双抗LCMA)；

仪器设备：

Thermo Finnpipette可调式移液器 (热电上海仪器有限公司)；

分析天平 FA1104N (上海精密仪器科学有限公司)；

光学显微镜YS2 (日本尼康公司)；

立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-50S11 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；

恒温培养箱MLR - 351 (日本三洋电机公司)；

垂直层流洁净工作台CA-920-2 (上海上净净化设备有限公司)；

恒温水浴锅HH-2数显 (常州国华电器有限公司)；

SZ-93 自动双重纯水蒸馏器 (上海亚荣生化仪器厂)；

冰箱 BCD-215KC F (青岛海尔股份有限公司)；

800型离心沉淀器 (上海手术器械厂)。

2、试验方法。 

2.1培养和分离松材线虫。 

2.2配制马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)、水琼脂培养基(2% WA) 、水琼脂培养基(0.8% WA)、弱营养玉米粉培养基(LCMA)、 弱营养玉米粉琼脂双抗培养基(双抗LCMA)。 

2.3　E. vermicola的纯化： 

E. vermicola的纯化方法如下：在无菌条件下，用接种针刮取菌丝培养于Ф 7.5 cm LCMA平板上，26℃下培养5 d。在新长成的菌落旁滴入10 μl线虫液(约含100条线虫)。2 d后，在光学显微镜下，用细针挑取被真菌孢子侵染的线虫至已灭菌的载玻片上，载玻片上事先滴上3滴3 % H₂O₂和2滴无菌水。将线虫用3 % H₂O₂洗3次，每次10 s，再用无菌水洗2次后，转接到新的Ф 7.5 cm双抗LCMA平板上，以去掉细菌的污染 (李天飞等, 2000)，每个平板接入1条线虫，平板置于26 ℃下培养2 d。

2d后，在光镜下可以观察到，菌丝从被侵染线虫体内长出，营养菌丝匍匐在培养基上，气生菌丝离开培养基向上生长，粘性孢子着生于气生菌丝的瓶形分生孢子梗上。粘性孢子为不规则椭圆形，半月形，向内凹陷，分生孢子内含一个类似内寄生孢子的结构(李天飞等, 2000)。在光镜下，使用细针轻轻刮取气生菌丝，粘性孢子便粘附于针尖，将针头在新的Ф 9 cm PSA平板上轻轻的划线，孢子会随机的散落在平板上。在高倍镜(400倍)下观察，若找到半月形的单个孢子，且附近无菌丝和其他孢子，就用记号笔在平板背面标记。将平板置于26℃下培养1-2 d。在高倍镜(400倍)下观察，若单孢子已正常萌发，用无菌刀片将含有单孢子的培养基切下，转接至含PSA的试管中，于26 ℃下培养8 d。 

纯化的E. vermicola起初菌落边缘呈白色，紧密，外围有些丛毛状，但逐渐颜色变灰绿，最终变深绿色。菌落产深棕色的色素。菌丝长好后，将试管置于4℃下保存。 

2.4制作硅胶管： 

取5 cm长的透明硅胶管 (内径3 mm，外径6 mm)，用手术刀片在硅胶管正中间开一小口，小口用来滴加蒸馏水和线虫液。将快速定性滤纸片制成3 mm的滤纸棒，轻轻塞入硅胶管中，居中放置。用移液枪在硅胶管中间的小口处缓慢注入140 μl蒸馏水，使滤纸棒全部湿润，并吸去滤纸棒中多余的流动水。

2.5 生测用菌块的准备 

在Ф 9 cm PSA平板上接种E. vermicola真菌，于26 ℃下培养8 d。

用无菌刀片在菌落边缘切取数个小块，每个小块上菌丝的面积约0.1 cm²，菌丝量约为0.05 mg，简称真菌小块；在未接种真菌的PSA平板上同样切取相同体积的小块，简称PSA小块，作为对照。 

2.6 生测实验 

含有湿润滤纸棒的硅胶管，一侧放入一个真菌小块，用记号笔标记为处理端；另一侧放入一个PSA小块，标记为对照端。硅胶管两侧用封口膜Parafilm封口。实验重复3次。用微量进样器从硅胶管中间的小口处滴入10 μl线虫液 (约300头线虫)，静置片刻，置于28℃的培养箱中暗培养。

2.7 分离线虫 

分别于10 h，24 h，36 h后分离线虫。从硅胶管中分离线虫的方法如下：

用手术刀片迅速将硅胶管的处理端和对照端(均2 cm长)切下。分别将其中的滤纸棒取出，连同相应的硅胶管和小块，置于贝曼漏斗中分离，28℃下静置24 h后镜检，统计分离到的线虫数。

2.8 结果分析 

同一根硅胶管中，处理端和对照端分离到的线虫数(条)分别记为a和b。处理端比例和对照端比例的计算公式如下： 

处理端比例 (%)  =处理端分离到的线虫数/(处理端和对照端分离到的线虫数总和)×100＝a/(a+b)×100

处理端比例 (%)  =对照端分离到的线虫数/(处理端和对照端分离到的线虫数总和)×100＝a/(a+b)×100

使用SPSS 13.0独立样本t检验，来比较3个重复的处理端比例与对照端比例均值之间的差异，显著性差异以独立样本t检验的双尾检验值(p值)来判断。

如果p>0.05，说明处理端比例与对照端比例之间无显著性差异，即E. vermicola的VOCs对松材线虫无吸引效果； 

p<0.05，且处理端比例>50%，说明处理端比例与对照端比例之间有显著性差异，即E. vermicola菌丝的VOCs对线虫的吸引效果跟对照PSA培养基相比，有显著性差异；

p<0.01，且处理端比例>50%，说明处理端比例与对照端比例之间有极显著性差异，即E. vermicola菌丝的VOCs对线虫有极显著的吸引效果。

3、结果与分析。 

1.2.1 真菌E. vermicola的VOCs吸引松材线虫的效果   

在硅胶管的一端放入E. vermicola真菌小块，标记为处理端；另一端放入PSA小块，标记为对照端。在硅胶管中间的小口处加入线虫液，分别于10 h，24 h，36 h后分离线虫。结果分析以处理端比例和独立样本t检验的双尾检验值(p值)来表示。结果见表1-1和图1 。

从表1-1和图1 可以看出E. vermicola的VOCs对松材线虫有着非常强的吸引效果，该结果与王春燕在水琼脂平板上的生测结果一致(Wang等, 2010)。真菌小块置于硅胶管中10 h后，处理端分离到241.33 ± 76.59头线虫，处理端比例为88.45% ± 0.04 > 50%。独立样本t检验分析，p=0.000<0.01，说明与对照相比，E. vermicola真菌的VOCs有着极显著的吸引效果。随着时间的推移，24 h和36 h分离的结果显示，真菌小块对松材线虫依然保持着很高的吸引效果，处理端比例分别是86.55% ± 0.10和85.16% ± 0.09(p<0.001)。 

在透明硅胶管里，真菌小块的菌丝面积约0.1 cm²，菌丝量约0.05 mg。真菌小块和PSA小块并未直接接触到滤纸棒及其中的线虫，因此，“硅胶管法”检测的是VOCs对线虫的作用。E. vermicola菌丝的VOCs在硅胶管的一侧累积，逐渐在湿润的滤纸棒里形成一定的浓度差，吸引滴加在滤纸棒中间的松材线虫通过滤纸，向真菌小块移动。之前预实验的结果显示，将E. vermicola的菌丝刮成小团，放入硅胶管中，对线虫同样有极显著的吸引效果。24 h后检测，处理端分离到174.00 ± 31.32头线虫，处理端比例为85.02% ± 0.03。p=0.000<0.01。以上结果表明E. vermicola的活体菌丝能够产生引诱松材线虫的挥发性物质。 

表1-1 硅胶管法测定E. vermicola真菌小块*的VOCs吸引松材线虫的效果  

放置时间a (条)b (条)处理端比例对照端比例P值**10h241.33±76.5933.00±20.8888.45%±0.0411.55%±0.040.00024h186.67±47.3727.33±18.8886.55%±0.1013.45%±0.100.00136h90.67±60.3412.00±2.6585.16%±0.0914.84%±0.090.001

注：表中的数据为平均值±标准差，a和b分别表示处理端和对照端分离到的线虫数

*真菌小块的菌丝面积约0.1cm²，菌丝量约0.05mg

**P值为独立样本t检验的双尾检验值。

根据实验结果，将该生测方法的线虫分离时间设定为10 h，因为随着真菌小块放置时间的延长，吸引效果并没有出现明显增长，处理端分离到的线虫数呈下降趋势。10h至36h，处理端分离到的线虫从241.33 ± 76.59头下降为90.67 ± 60.34头。出现该现象的原因可能是，线虫被真菌小块的VOCs吸引，逐渐向真菌移动，随着处理时间的延长，很多线虫会被菌丝上的粘性孢子侵染，其运动性受到影响，难以从贝曼漏斗中分离出来。 

从分离结果上看，也有小部分线虫会向对照端移动，且真菌的VOCs在对照端的浓度较弱，因此PSA培养基的VOCs对线虫是否有吸引作用尚不能确定，会在后续实验中确定。由于每一根硅胶管滴加的供试线虫数不能保证一致，因此分离线虫时，分别统计达到滤纸棒两侧(均1 cm长)的线虫数，并用百分数进行统计检验。 

硅胶管法测定E. vermicola真菌小块*的VOCs吸引松材线虫的效果（*真菌小块的菌丝面积约0.1 cm²，菌丝量约0.05 mg）见图1。 

实验2　两种生测方法灵敏度的比较 

通过观察梯度浓度的样品溶液对松材线虫的吸引效果，来比较“硅胶管法”与 “水琼脂平板法”这两种生测方法灵敏度的差别。

2. 1 梯度浓度的样品溶液的配制 

将α-蒎烯和β-蒎烯按照9:1的质量比(Zhao等, 2007；Zhao等, 2009)，配成梯度溶液。取90 μl α-蒎烯和10 μl β-蒎烯混合，溶解于无水乙醇(光谱纯)中，配制成78 mg/ml的溶液。依次梯度稀释至10 mg/ml，1 mg/ml，10^-1 mg/ml，10^-2 mg/ml，10^-3 mg/ml，10^-4 mg/ml，10^-5 mg/ml等七个浓度的样品溶液。每个浓度下的样品溶液均取5 μl滴加在小滤纸片(r=0.6 cm)上，对照为5 μl的无水乙醇溶剂。分别用两种生测方法生测，检测各浓度下的样品对松材线虫的吸引效果，实验重复3次。

2.2 “硅胶管法”的生测 

生测方法同1.1.2.5，结果分析同1.1.2.4.5。

2.3 “水琼脂平板法”的生测 

0.8%琼脂平板的制作采用现有的方法。用尺子和记号笔在培养皿背面划线，以平板中心为原点，将平板均匀的等分为四个象限。将各个浓度下的5 μl样品用微量进样器滴在小滤纸片(r=0.6 cm)上。静置片刻，待溶剂挥发完，将滤纸片轻轻放在琼脂平板上的第一或第二象限中，滤纸片离培养皿边缘1 cm；对照为5 μl的无水乙醇溶剂，同样滴在小滤纸片上，待溶剂挥发完，与处理相对放置，放在平板的第三或四象限中。立刻将培养皿盖上盖子，用Parafilm封口，28℃下避光静置12 h。12 h后用Ф 1cm的打孔器将滤纸和相应的琼脂块取出，用纱布包好，置于贝曼漏斗中分离，28℃下静置24 h后镜检。滴加样品的滤纸片连同相应Ф 1cm的琼脂块记为处理端。滴加无水乙醇溶剂的滤纸片连同相应Ф 1cm的琼脂块记做对照端。结果分析方法同上。

2.4 结果与分析 

2.4.1 真菌E. vermicola的VOCs吸引松材线虫的效果   

在硅胶管的一端放入E. vermicola真菌小块，标记为处理端；另一端放入PSA小块，标记为对照端。在硅胶管中间的小口处加入线虫液，分别于10 h，24 h，36 h后分离线虫。结果分析以处理端比例和独立样本t检验的双尾检验值(p值)来表示。结果见表1-1和图1 。

从表1-1和图1 可以看出E. vermicola的VOCs对松材线虫有着非常强的吸引效果，该结果与王春燕在水琼脂平板上的生测结果一致(Wang等, 2010)。真菌小块置于硅胶管中10 h后，处理端分离到241.33 ± 76.59头线虫，处理端比例为88.45% ± 0.04 > 50%。独立样本t检验分析，p=0.000<0.01，说明与对照相比，E. vermicola真菌的VOCs有着极显著的吸引效果。随着时间的推移，24 h和36 h分离的结果显示，真菌小块对松材线虫依然保持着很高的吸引效果，处理端比例分别是86.55% ± 0.10和85.16% ± 0.09(p<0.001)。 

在透明硅胶管里，真菌小块的菌丝面积约0.1 cm²，菌丝量约0.05 mg。真菌小块和PSA小块并未直接接触到滤纸棒及其中的线虫，因此，“硅胶管法”检测的是VOCs对线虫的作用。E. vermicola菌丝的VOCs在硅胶管的一侧累积，逐渐在湿润的滤纸棒里形成一定的浓度差，吸引滴加在滤纸棒中间的松材线虫通过滤纸，向真菌小块移动。之前预实验的结果显示，将E. vermicola的菌丝刮成小团，放入硅胶管中，对线虫同样有极显著的吸引效果。24 h后检测，处理端分离到174.00 ± 31.32头线虫，处理端比例为85.02% ± 0.03。p=0.000<0.01。以上结果表明E. vermicola的活体菌丝能够产生引诱松材线虫的挥发性物质。 

表1-1 硅胶管法测定E. vermicola真菌小块*的VOCs吸引松材线虫的效果 

放置时间a (条)b (条)处理端比例对照端比例P值**10h241.33±76.5933.00±20.8888.45%±0.0411.55%±0.040.00024h186.67±47.3727.33±18.8886.55%±0.1013.45%±0.100.00136h90.67±60.3412.00±2.6585.16%±0.0914.84%±0.090.001

注：表中的数据为平均值±标准差，a和b分别表示处理端和对照端分离到的线虫数

*真菌小块的菌丝面积约0.1cm²，菌丝量约0.05mg

**P值为独立样本t检验的双尾检验值。

根据实验结果，将该生测方法的线虫分离时间设定为10 h，因为随着真菌小块放置时间的延长，吸引效果并没有出现明显增长，处理端分离到的线虫数呈下降趋势。10h至36h，处理端分离到的线虫从241.33 ± 76.59头下降为90.67 ± 60.34头。出现该现象的原因可能是，线虫被真菌小块的VOCs吸引，逐渐向真菌移动，随着处理时间的延长，很多线虫会被菌丝上的粘性孢子侵染，其运动性受到影响，难以从贝曼漏斗中分离出来。 

从分离结果上看，也有小部分线虫会向对照端移动，且真菌的VOCs在对照端的浓度较弱，因此PSA培养基的VOCs对线虫是否有吸引作用尚不能确定，会在后续实验中确定。由于每一根硅胶管滴加的供试线虫数不能保证一致，因此分离线虫时，分别统计达到滤纸棒两侧(均1 cm长)的线虫数，并用百分数进行统计检验。 

2.5两种生测方法灵敏度的比较 

已有文献报道，马尾松的挥发物α-蒎烯和β-蒎烯，按照27-90 : 73-10的重量配比混合，对繁殖型松材线虫有着很强的吸引作用(Zhao等, 2007；Zhao等, 2009)。因此，将α-蒎烯和β-蒎烯按照9:1的质量比配成梯度浓度的样品溶液，分别是10 mg/ml，1 mg/ml，10^-1 mg/ml，10^-2 mg/ml，10^-3 mg/ml，10^-4 mg/ml，10^-5 mg/ml七个浓度，每个浓度均取5 μl，滴加在小滤纸片上，分别用两种生测方法(硅胶管法和0.8%琼脂平板法)对松材线虫做生测，通过观察梯度浓度下的样品对线虫的生物活性，来比较两种方法的灵敏度。

生测方法为“0.8%琼脂平板法”，供试的样品浓度为10 mg/ml时，处理与对照之间均有极显著性差异(p=0.000<0.01)，处理端比例为61.51% ± 0.03，而其他的各个浓度(1 mg/ml至10^-4  mg/ml)下的样品，处理与对照之间均无显著性差异。 

结果说明“硅胶管法”对微量物质的检测有着很高的灵敏度，明显高于“水琼脂平板法”，适用于检测微量样品的VOCs。以检测到蒎烯样品的生物活性(p<0.05)为标准，“硅胶管法”检测到的最低浓度为10^-4 mg/ml，样品量为 0.5 ng。而“水琼脂平板法”检测到最低的浓度为10 mg/ml，样品量为50 μg。两种方法能够检测到的样品量相差5个数量级。“硅胶管法”操作简单，生测时间为10 h。硅胶管内空间较小且封闭，因此样品的VOCs在其中得到保留，易于形成较高浓度梯度，被松材线虫感觉到。对于本实验的微量的样品，利用“水琼脂平板法”虽然能够检测到一定的生物活性，但统计处理结果差异不显著(p>0.05)。只有当样品浓度为10 mg/ml，样品量为50 μg时，才表现出明显的生物活性。 

表1-3不同浓度的样品溶液*用硅胶管法生测的结果 

    生测的浓度a (条)b (条)处理端比例对照端比例P值**1>33.00±16.8219.00±8.5461.29%±0.2138.71%±0.210.25710^-1>36.00±6.2414.33±1.5371.39%±0.0128.61%±0.010.00010^-2>25.33±3.7914.00±1.0064.21%±0.0435.79%±0.040.00110^-3>21.67±2.8915.33±1.1558.45%±0.0341.55%±0.030.00210^-4>33.67±10.4125.33±6.0356.64%±0.0343.36%±0.030.00410^-5>9.50±8.647.50±6.2257.48%±0.2345.52%±0.230.292

注：表中的数据为平均值±标准差，a和b分别表示处理端和对照端分离到的线虫数

*样品溶液指α-蒎烯和β-蒎烯按照9:1质量比混合后的梯度溶液，生测的体积均为5 μl

**P值为独立样本t检验的双尾检验值。

表1-4不同浓度的样品溶液*用0.8%琼脂平板法生测的结果 

   生测的浓度a (条)b (条)处理端比例对照端比例P值**10>18.67±6.1111.67±4.0461.51%±0.0338.49%±0.030.0001>14.00±3.0010.67±4.0457.31%±0.1342.69%±0.130.24410^-1>10.67±4.168.00±3.0056.79%±0.0643.21%±0.060.05210^-2>14.00±3.6111.33±3.0655.17%±0.1244.83%±0.120.35610^-3>16.00±8.1911.33±2.3156.27%±0.1343.73%±0.130.31010^-4>16.33±9.2916.67±7.5149.50%±0.1550.50%±0.150.939

注：表中的数据均为平均值±标准差，a和b分别表示处理端和对照端分离到的线虫数

*样品溶液指α-蒎烯和β-蒎烯按照9:1质量比混合后的梯度溶液，生测的体积均为5 μl

**P值为独立样本t检验的双尾检验值。

实验结果显示，“硅胶管法”的检测灵敏度比常用的生测方法高出数个数量级，能够检测到小于1 ng对松材线虫具有生物活性的化合物。该方法适用于检测微量样品的生物活性。 

以下为本发明的多个实施例。 

实施例1：一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的生测方法，包括以下步骤：取内径为1 mm，长度为3cm，空腔体积为23.55 mm³，的透明硅胶管，在透明硅胶管正中间开一用来滴加蒸馏水和线虫液的小口，在管内居中放置直径为透明硅胶管内径的滤纸棒，在硅胶管中间的小口处缓慢注入蒸馏水，使滤纸棒刚好全部湿润，在细管的一侧放入一个一个有产生活性挥发性代谢物质(VOCs)微生物的培养基小块，或者含有VOCs的样品溶液的介质（如滤纸、培养基、玻璃毛），标记为处理端；另一侧放入一个未接种微生物或不含活性挥发性代谢物质(VOCs)的培养基小块，标记为对照端，再将细管两侧封口，用微量进样器从细管中间的小口处滴入线虫液，置于培养箱中培养。分别于10 h，24 h，36 h后分离线虫，28℃下静置24 h后镜检，统计分离到的线虫数并进行数据的统计分析。 

实施例2：一种影响线虫趋向行为的微生物挥发性化合物(VOCs)的生测方法，包括以下步骤：取内径为3 mm，长度为5 cm，空腔体积为353.25 mm³的玻璃管，在玻璃管正中间开一用来滴加蒸馏水和线虫液的小口，在管内居中放置经灭活的线虫实际生活环境用土壤，在硅胶管中间的小口处缓慢注入蒸馏水，使土壤刚好全部湿润，在细管的一侧放入一个一个有产生活性挥发性代谢物质(VOCs)微生物的培养基小块，或者含有VOCs的样品溶液的介质（如滤纸、培养基、玻璃毛），，标记为处理端；另一侧放入一个未接种微生物或不含活性挥发性代谢物质(VOCs)的培养基小块，标记为对照端，再将细管两侧封口，用微量进样器从细管中间的小口处滴入线虫液，置于培养箱中培养。分别于10 h，24 h，36 h后分离线虫，28℃下静置24 h后镜检，统计分离到的线虫数并进行数据的统计分析。