一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体，所述抗体按如下方法制备：基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列，合成蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域多肽；将多肽与载体偶联、缀合或融合，制备抗原肽复合物；将抗原肽复合物注入母鸡体内进行免疫，连续收集鸡蛋；从收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体，即获得所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体；本发明所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体产率高、成本低；所得到的抗体安全性高、稳定性好、过敏性不良反应小；可以做成口服制剂或注射剂；可用于具有血循毒性蛇毒咬伤治疗，尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬伤治疗。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种血循型蛇毒鸡卵黄抗体（Immunoglobulin-yolk，IgY ）及制备方法与应用。具体而言，是基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白 酶活性基序多肽免疫，制备抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法。

（二）背景技术

长久以来，毒蛇咬伤给人们的生产生活带来了严重危害，据世界卫生 组织网站公布的数字显示：全世界每年被蛇咬伤的人数有250多万人， 导致死亡人数高达12.5万人。我国每年毒蛇咬伤患者达10多万人次， 其中约73％为中青年，死亡率为5％～10％，蛇伤致残丧失劳动能力者 占25％～30％。可见毒蛇是危害人类健康的一个重要生物安全隐患， 必须采取相关措施，降低或消除相关风险。

注射抗蛇毒血清是目前世界公认的最有效的治疗方法，但蛇毒本身成 分复杂，含有数百种功能各异的蛋白质，用全毒免疫产生的抗蛇毒血 清不仅含有能中和毒素成分的抗体，也含有大量针对蛇毒中其他非毒 素成分的抗体。这不仅使得抗血清的临床使用剂量大大增加，增加了 过敏反应概率，也浪费了宝贵的血清资源（Wagstaff S C, Laing  G D, Theakston R D, et al. Bioinformatics and mul tiepitope DNA immunization to design rational snake a ntivenom. PLoS Med, 2006, 3:184.）。如果能够将蛇毒中的主 要毒性致死成分分离、纯化，制备单克隆抗体，则其中和相应蛇毒蛋 白能力将极大提高，抗体用量减少，不良反应也可相应减少，而且其 抗体生产成本也将极大降低，质量也可得到稳定控制。检索相关文献 ，已有不少有关蛇毒蛋白单克隆抗体的成功制备（尹惠琼. 利用噬菌 体展示文库技术制备抗蛇毒ScFv抗体. 云南大学,2004硕士论文.;  李丽红等. 眼镜王蛇毒单克隆抗体的制备. 细胞与分子免疫学杂志 ,2009,25(3):236-238.等）但绝大部分仅局 限于毒蛇分类鉴定和基础理论研究上；这极可能是由于蛇毒毒性成分 的多样性（贾艳等. 蛇毒的毒性成分及其应用研究.蛇志,2004,16(2 ):23-32.），因此至今几乎没有一种单克隆抗体能够完全中和某种蛇 毒毒性。

尖吻蝮蛇( Deinagkistrodon acutus)是我国常见的毒蛇，属于蝰科 蝮亚科，又名五步蛇（浙江），棋盘蛇（福建），百步蛇（台湾）， 主要栖息于越南北部，老挝和中国南部地区，其毒液主要为血循毒（ Li QB, Yu QS, Huang GW, et al. Hemostatic disturban ces observed in patients with snakebite in south Chi na. Toxicon. 2000, 38(10):1355-1366. Chen CC, Yang CM , Hu FR, et al. Penetrating ocular injury caused by  venomous snakebite. Am. J. Ophthalmol. 2005, 140(3):  44- 546.）。患者被咬伤后，伤口局部红肿、疼痛剧烈，流血不止 ，肿胀迅速，毒素向肢体上端蔓延，常有水泡、淤斑出现。中毒严重 者还会出现血压下降、心律失常、少尿、无尿，最后因循环衰竭而导 致死亡。研究表明，蛇毒金属蛋白酶（Wagstaff S C, Laing G  D, Theakston R D, et al. Bioinformatics and multiepi tope DNA immunization to design rational snake antive nom. PLoS Med, 2006, 3:184）是引起出血、致死等症状的主要 物质，它们有的干扰伤口血液的凝结和血栓的形成，有的则降解胞外 基质或基底膜，可占总蛇毒蛋白的60%以上，是蛇毒蛋白中的主要成分 ；能够有效中和这些金属蛋白酶，则基本可以有效缓解五步蛇毒对机 体的损伤。

研究表明，蛇毒金属蛋酶和哺乳动物基质金属蛋白酶一样，它们都是 金属锌蛋白，有一个锌结合域HEXXHXXGXXH。自1950年以来，已有150 多种蛋白酶（其中有100多种毒金属蛋白酶）从蛇毒中纯化出来，其中 有超过40种（20多种是金属蛋白酶）的氨基酸全序列被测定。根据已 报道的蛇毒金属蛋白酶的cDNA序列和蛋白质的结构，将蛇毒金属蛋白 酶分成 4 类：其中PI类仅含金属蛋白酶域（metalloproteinase  domain），分子量 20～30kDa；PII类含金属蛋白酶域和去整合素域 （disintegrin  domain），分子量 30～50kDa；PIII类含金属蛋白酶域、去整合素域 和富半胱氨酸域（cysteine-rich domain），分子量 50～80kDa； PIV类在PIII类基础上多了二硫键连接的类C型凝集素域（C-type le ctin domain）（Cynthia Tallant, Aniebrys Marrero, F.Xav ier Gomis-Rüth. Matrix metalloproteinases: Fold and f unction of their catalytic domains. Biochimica et Bio physica Acta, 2010, 1803:20-28）。

金属蛋白酶域是四类蛇毒金属酶类的共有部分。对比分析各蛇毒金属 蛋白酶域结果表明，HEXXHXXGXXH序列是酶活性中心的高度保守序列。 为此，理论上而言，将该保守序列作为抗原肽免疫动物可以得到针对 该类抗原位点的特异性抗血清，而该抗血清极可能均能够与上述各类 蛇毒金属蛋白发生交叉反应，起到中和蛇毒毒性作用。而由于免疫动 物所用抗原肽的单一性，其制备所得抗血清抗体成分相对单一，可减 少抗血清用量，减少不良反应；同时，基于这一抗原肽，可以进一步 筛选建立有效的单克隆抗体制剂。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域 序列作为抗原肽，免疫母鸡制备抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法 ；该方法抗体产率高、成本低；所得到的抗体安全性高、稳定性好、 过敏性不良反应小；可以做成口服制剂和注射剂；可用于具有血循毒 性蛇毒咬伤治疗，尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬伤治疗。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体，所述抗体按如下方法制备 ：

（1）基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列，合成蛇毒锌 离子金属蛋白酶活性结构域多肽；所述多肽的氨基酸序列为CX_nHEXXH XXGXXHX_n或X_nHEXXHXXGXXHX_nC，其中X为除半胱氨 酸以外的任何氨基酸，n是包括零的任何正整数；

（2）将步骤（1）中的多肽与载体偶联、缀合或融合，制备抗原肽复 合物；

（3）母鸡免疫：将步骤（2）中的抗原肽复合物注入母鸡体内进行免 疫，连续收集鸡蛋；

（4）从步骤（3）收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体，即获得所述 抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体。

进一步，优选所述n是0~20之间的任何正整数。

进一步，所述载体包括蛋白或脂类。更优选所述载体为： 钥孔血蓝 蛋白（keyhole Limpet Hemocyanin） 、人血清白蛋白（Human  Serum Albumin）、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）、牛 甲状腺球蛋白（Bovine Thyroglobulin）、鸡卵白蛋白（Ovalbumin ）及其他γ球蛋白等蛋白载体；另有重组载体可以为多聚赖氨酸（Po ly-L-Lysine）、二软脂酰赖氨酸（Dipalmitoyl-Lysine）、多聚谷氨 酸（Poly-γ-Glutamic acid）及其他多聚混合氨基酸等。

进一步，步骤（3）按如下方法进行：将步骤（2）中制备的抗原肽复 合物与等体积福氏完全佐剂（Freund's complete adjuvant）在室 温下混合乳化，然后于母鸡皮下多点注射进行首次免疫，首次免疫抗 原肽复合物的用量为0.1~3 mg/只（优选1mg/只），首次免疫1~2周后 进行第一次加强免疫，抗原肽复合物的用量为0.1~3 mg/只（优选0. 5mg/只），首次免疫2~4周后进行第二次加强免疫，抗原肽复合物的用 量为0.1~3 mg/只（优选0.5mg/只），后续每间隔3~4周免疫一次，抗 原肽复合物的用量为0.1~3 mg/只（优选0.5mg/只），并于初次免疫 3周后开始连续收集鸡蛋。首次免疫之后的每次加强免疫或免疫均用步 骤（2）中制备的抗原肽复合物与等体积福氏不完全佐剂在室温下混合 乳化后于母鸡皮下进行多点注射。

本发明步骤（4）所述从收集的鸡蛋中提取鸡卵黄抗体的方法及分离纯 化方法为本领域公知技术，可以采用硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法 、柱层析法及相关商品化试剂盒等纯化方法。

本发明还涉及一种所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体在制备抗血循型蛇毒 药物中的应用。

所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体可对血循型毒蛇咬伤进行治疗，可以通 过口服或注射给药，优选为注射给药。抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体用量 优选4~10 mg/kg体重。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所述抗血循型 蛇毒鸡卵黄抗体产率高、成本低；所得到的抗体安全性高、稳定性好 、过敏性不良反应小；可以做成口服制剂或注射剂；可用于具有血循 毒性蛇毒咬伤治疗，尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬伤治疗。

（四）附图说明

图1：M15多肽HPLC图；

图2：M15多肽质谱图；

图3：IgY样品SDS-PAGE电泳图；

图4：小鼠皮下出血毒性实验结果：A为五步蛇蛇毒皮下出血毒性实验 结果；B为蝮蛇蛇毒皮下出血实验结果；图中0是指蛇毒加免疫前的Ig Y 50μg注射点，D1是指蛇毒加免疫后的IgY50μg注射点，D2是指蛇 毒加免疫后的IgY 25μg注射点，D3是指蛇毒加免疫后的IgY 10μg 注射点， D4是指蛇毒加免疫后的IgY 5μg注射点，D5是指蛇毒加免 疫后的IgY 2.5μg注射点。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《Making and  Using Antibodies: A Practical Handbook》（CRC Press，Fl orida，2006）、《抗体制备与使用实验指南》（科学出版社，北京， 2010年）等手册以及本文所引用的参考文献中所列的方法来实施。另 外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市 场上购买。

实施例1：基于蛇毒锌离子金属蛋白酶活性基序的新型抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体制备

1、多肽的合成及偶联 

通过对多种蛇毒金属蛋白酶（如，Acutolysin A、Acutolysin F、 Acutolysin E、Aculysin 2、Metalloprotease H1、Metalloprot ease H2、Metalloprotease H3、Metalloprotease H4和Metallop rotease H5）催化结构域氨基酸序列进行对比分析，确定合成以下多 肽序列（M15）：CAHEMAHNLGVRHDE，并提交杭州聚成生物技术有限公 司合成多肽，HPLC和MS鉴定结果如图1、2所示。然后通过碳二亚胺法 将该多肽偶联至钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH ，购自sigma公司），形成抗原肽复合物KLH-M15。

2、母鸡免疫

将上述抗原肽复合物KLH-M15与等体积福氏完全佐剂（购自MP Biome dicals）在室温下混合乳化，取22周龄的莱杭母鸡，于母鸡皮下多点 注射上述福氏完全佐剂乳化的抗原肽复合物 KLH-M15进行初次免疫， 初次免疫KLH-M15量为1.0mg/只；2周后用福氏不完全佐剂（购自MP  Biomedicals）乳化的抗原肽复合物 KLH-M15加强免疫一次，KLH-M1 5用量为0.5mg/只；4周后进行第二次加强免疫（福氏不完全佐剂乳化 的抗原肽复合物 KLH-M15），KLH-M15用量为0.5mg/只；之后每隔4周 免疫一次（福氏不完全佐剂乳化的抗原肽复合物 KLH-M15），每次K LH-M15 量为0.5mg/只；并于第一次免疫3周后连续收集鸡蛋，置于4℃保存备 用；同时留取免疫前鸡蛋作为阴性对照。

3、抗体提取

采用聚乙二醇沉淀法从步骤2收集的鸡蛋中提取、纯化抗蛇毒鸡卵黄抗 体（IgY）（Pauly D, Chacana PA, Calzado EG, Brembs B,  Schade R.IgY technology: extraction of chicken antib odies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) pre cipitation.J Vis Exp. 2011(51). doi:pii:3084.10.3791/308 4.）：取卵黄，加入2倍卵黄体积pH7.4的PBS缓冲液，混匀后加入终浓 度为3.5%的PEG6000（质量浓度），冰浴振荡溶解10min，12 000g， 4℃离心20min，取上清；按照上清液体积，加入8.5%（质量浓度）的 PEG6000，冰浴振荡溶解15min，12 000g，4℃离心20min，去上清； 沉淀用10ml pH7.4的PBS溶解，加入12%（质量浓度）的PEG6000，冰 浴振荡溶解15min，12 000g，4℃离心20min，去上清；沉淀用1ml  pH7.4的PBS溶解后用14 000Da截留量的透析袋于冰浴的pH7.4的PBS中 透析过夜，换液3次。透析后的样品于280nm处测定吸光度值，计算抗 体IgY含量达56.7mg/ml（计算方法参照：Pauly D, Chacana PA,  Calzado EG, Brembs B, Schade R.IgY technology: extrac tion of chicken antibodies from egg yolk by polyethy lene glycol (PEG) precipitation.J Vis Exp. 2011(51).  doi:pii:3084.10.3791/3084.）；样品于-20℃保存备用。

4、SDS-PAGE检测

采用SDS-PAGE法（参见申请号：200610035761.6）对步骤3提取、纯化 的IgY样品进行检测；样品于65kDa（重链）和25kDa（轻链）处可见明 显两个条带（图3所示），与相关文献报道一致（Pauly D, Chacan a PA, Calzado EG, Brembs B, Schade R.IgY technology:  extraction of chicken antibodies from egg yolk by  polyethylene glycol (PEG) precipitation.J Vis Exp. 201 1(51). doi:pii:3084.10.3791/3084.）（见图3）。

5、ELISA效价检测

参照申请号：200610035761.6方法，对步骤3制备的抗体样品与抗原肽 复合物KLH-M15的效价及样品与五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的交叉免疫性进行 了测定。结果表明，样品与KLH-M15的效价可达32万倍稀释度，但其与 五步蛇和蝮蛇蛇毒的交叉反应性均较差，稀释度分别只有5千倍和2千 倍左右。

6、小鼠皮下出血试验

选用ICR系健康雄性小白鼠，随机分组，每组10只。实验组一：将1.0 mg/ml的五步蛇毒液10μL与PBS（pH7.4）溶解的不同稀释度的IgY样品 10μL在无菌EP管内混合（见表1），置25℃恒温水浴箱中孵育60min， 然后在脱毛小白鼠的背部进行皮下注射。实验组二：将0.5mg/ml的蝮 蛇蛇毒液10μL与PBS（pH7.4）溶解的不同稀释度的IgY样品10μL在无 菌EP管内混合（见表1），置25℃恒温水浴箱中孵育60min，然后在脱 毛小白鼠的背部进行皮下注射。18h后颈椎脱臼处死，解剖，拍照记录 出血斑块长短径，并采用IPP软件计算出血面积及各抗血清对出血抑制 率，结果见表1和图4所示。

结果表明，样品IgY体内对五步蛇毒和蝮蛇蛇毒出血毒性均具有较好的 中和作用，其中对五步蛇毒中和活性较好，50μg IgY样品可完全中 和10μg五步蛇蛇毒，而同样剂量只能中和70%左右蝮蛇蛇毒（见表1和 图4）。样品体外ELISA和体内出血毒性之间的显著差异可能与蛇毒金 属蛋白酶构象有关（Tallant C, Marrero A, Gomis-Rüth FX. Matrix metalloproteinases: fold and function of their  catalytic domains.Biochim Biophys Acta. 2010,1803(1):20- 28.）。

表1各样品对蛇毒引起的小鼠皮下出血抑制率（%）

7、蛇毒中和试验 

选用ICR系健康雄性小白鼠，随机分组，每组10只。实验组一：将KLH -M15免疫后样品IgY(10mg/kg小鼠体重)分别与2倍半数致死量LD₅₀剂量 的五步蛇毒在无菌EP管内混合，置25℃恒温水浴箱中孵育60min，然后 小鼠腹腔注射0.2ml，记录给药后24h内小鼠存活率。实验组二：将KL H-M15免疫后样品IgY(20mg/kg小鼠体重)分别与2倍半数致死量LD₅₀剂量 的蝮蛇蛇毒在无菌EP管内混合，置25℃恒温水浴箱中孵育60min，然后 小鼠腹腔注射0.2ml，记录给药后24h内小鼠存活率。分别以免疫前Ig Y样品作为对照。

结果表明，无论是五步蛇毒还是蝮蛇蛇毒，给予KLH-M15免疫后的IgY 样品的小鼠全部存活，而给予免疫前IgY样品的小鼠全部死亡。